Luận văn Nghiên cứu xác định levofloxacin trong dược phẩm và nước tiểu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

khả năng khuếch tán tốt trong mô tế bào, nhanh chóng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn thông qua sự ức chế tổng hợp ADN, do đó đƣợc dùng phổ biến cho ngƣời và động vật. Levofloxacin là kháng sinh thuộc nhóm quinolone thế hệ 3, đƣợc flour hóa gọi là Fluoroquinolone. Levofloxacin là đồng phân quang học của Ofloxacin, có dƣợc lực mạnh gấp hai lần Ofloxacin. Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế hoạt động của enzym DNA gyrase của vi khuẩn, một enzym cần thiết cho quá trình nhân lên, sao chép, phục hồi và sửa chữa DNA của vi khuẩn. Trên invitro, Levofloxacin có phổ tác dụng rộng trên cả các chủng vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm. Trên thị trƣờng Việt Nam đang lƣu hành một số chế phẩm của Levofloxacin với giá thành khác nhau. Không biết rằng liệu dƣợc động học của các sản phẩm này có chênh lệch nhau đáng kể nhƣ vậy không? Việc đánh giá chất lƣợng thuốc hầu nhƣ mới chỉ dựa trên tiêu chuẩn chất lƣợng sản phẩm do nhà sản xuất đăng ký. Nhƣ vậy, nghiên cứu phƣơng pháp điṇh lƣơṇg kháng sinh Levofloxacin trong m ẫu thuốc là cần thiết. Điều này còn giúp phát hiện loại bỏ sản phẩm thuốc kém chất lƣợng. Bên cạnh kiểm tra chất lƣợng thuốc, để có thêm thông tin cho phác đồ điều trị kháng sinh phù hợp và hiệu quả với từng trƣờng hợp bệnh nhân, nghiên cứu sự đào thải kháng sinh Levofloxacin thông qua phân tích mẫu nƣớc tiểu là cần thiết. Qua đó giúp ngƣời bệnh chọn đƣợc loại thuốc rẻ tiền mà vẫn có tác dụng tƣơng đƣơng. Với ƣu điểm là phƣơng pháp có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lƣợng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn nên phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC đƣợc áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm phân tích thực hành kiểm nghiệm thuốc và đặc biệt phù hợp để phân tích thuốc có nồng độ thấp trong mẫu nƣớc tiểu. Xuất phát từ những lý do trên nên tôi chọn nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xác định Levofloxacin trong dƣợc phẩm và nƣớc tiểu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về Levofloxacin 1.1.1.Cấu trúc và tính chất lý – hóa của Levofloxacin Levofloxacin có tên theo IUPAC là: (S) -9-fluoro-2,3-dihidro-3-methyl-10- (4-methylpipezarin-1-yl)-7-oxo-7H-pyrido[1,2,3-de ]-1,4-benzoxazine-6-cacboxylic acid. Là kháng sinh họ quinolone thuộc thế hệ thứ ba, là đồng phân quang học của Ofloxacin [23, 29, 46]. Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của Levofloxacin Levofloxacin có công thức hóa học là C18H20FN3O4 (M = 361,368), dạng hemihydrate: C18H20FN3O4. ½ H2O ( M = 370,368 ). Levofloxacin ởdạng tinh khiết và hemihydrat đều là tinh thể màu vàng nhạt. Trong công thức cấu tạo Levofloxacin có khung quinolon, nhân quinolon, có tính axit yếu với pKa1 là 5,59 và pKa2 là 7,94; thời gian bán hủy từ 6 đến 8h; nóng chảy ở 228,60C [29].Levofloxacin tan nhẹ trong nƣớc và metanol, tan trong acid acetic băng và diclometan [48]. 1.1.2. Tính chất dược học của Levofloxacin Levofloxacin thuộc nhóm dƣợc lý: Thuốc trị ký sinh trùng, chống nhiễm khuẩn; có tên biệt dƣợc là: Cravit, Daewonlefloxin, Getzlox. Levofloxacin có các dạng bào chế: dung dịch tiêm truyền; viên nén dài bao phim; dung dịch nhỏ mắt và thuốc bột pha tiêm.Có thành phần chính là: Levofloxacin hemihydrat. 3 1.1.2.1.Dƣợc lực Levofloxacin và kháng sinh thế hệ sau của nhóm Fluoroquinolone đƣợc gọi chung là các “quinolone hô hấp ę do khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh quan trọng về đƣờng hô hấp. Levofloxacin là đồng phân quang học của Ofloxacin và có dƣợc lực mạnh gấp hai lần Ofloxacin. Cơ chế tác dụng của Levofloxacin là ức chế hoạt động của enzym DNA gyrase của vi khuẩn, một enzym cần thiết cho quá trình nhân lên, sao chép, phục hồi, sửa chữa DNA của vi khuẩn. Trên invitro, Levofloxacin có phổ tác dụng rộng trên cả các chủng vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm [33]. Do cơ chế tác động đặc hiệu này, Levofloxacin không bị đề kháng song song với các kháng sinh khác không cùng nhóm ức chế enzym DNA gyrase. Vì vậy, Levofloxacin có khả năng chống lại những vi khuẩn kháng các kháng sinh nhƣ aminoglycoside, penicillin, tetracycline, cephalosporin và các kháng sinh khác. Thƣờng không có đề kháng chéo giữa Levofloxacin và các loại thuốc kháng khuẩn khác. 1.1.2.2. Dƣợc động học Hấp thu: Khả năng hấp thu của Levofloxacin khi đƣợc đƣa vào cơ thể qua đƣờng tĩnh mạch và đƣờng uống với liều tƣơng đƣơng là gần nhƣ nhau, do đó có thể sử dụng hai đƣờng này thay thế cho nhau. Phân bố: Levofloxacin phân bố rộng rãi trong cơ thể tuy nhiên nó khó thấm vào dịch não tủy. Levofloxacin rất ít bị chuyển hóa trong cơ thể và thải trừ gần nhƣ hoàn toàn (khoảng 87%) qua nƣớc tiểu ở dạng còn nguyên hoạt tính trong 2 ngày, chỉ dƣới 5% liều điều trị đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu dƣới dạng chất chuyển hóa desmethyl và N-oxit [33]. 4 1.1.3.Vai trò và ứng dụng của Levofloxacin 1.1.3.1.Tác dụng điều trị bệnh lý của Levofloxacin Levofloxacin chỉ định [18]: Levofloxacin chỉ sử dụng cho ngƣời từ 18 tuổi trở lên với các viêm nhiễm do chủng vi khuẩn nhạy cảm trong những trƣờng hợp nhiễm khuẩn sau + Viêm xoang cấp tính + Viêm phế quản cấp và mãn tính + Hội chứng viêm phổi mắc phải từ cộng đồng + Nhiễm khuẩn da và cấu trúc da không biến chứng + Nhiễm khuẩn đƣờng tiết niệu biến chứng và không biến chứng + Viêm bể thận cấp + Viêm tuyến tiền liệt + Dự phòng sau khi phơi nhiễm và điều trị triệt để bệnh thận + Điều trị viêm mí mắt, lẹo mắt, viêm túi lệ, viêm kết mạc, loét giác mạc và các trƣờng hợp nhiễm trùng mắt sau phẫu thuật. Chống chỉ định: Ngƣời dƣới 18 tuổi và trong các trƣờng hợp có tiền sử mẫn cảm với Levofloxacin, các bệnh nhân có tiền sử bị động kinh, thiếu hụt G6PD hoặc bệnh ở gân cơ do Fluoroquinolone. 1.1.3.2.Tác dụng phụ của Levofloxacin Các tác dụng phụ [18] đã đƣợc ghi nhận trong thời gian sử dụng Levofloxacin, nhƣng không xảy ra với mọi bệnh nhân. Những tác dụng không mong muốn sau đây có thể xảy ra khi dùng Levofloxacin: -Hệ tiêu hóa: thƣờng gặp triệu chứng buồn nôn, tiêu chảy; ít gặp hơn là chán ăn, ói mửa, khó tiêu, đau bụng. -Phản ứng ngoài da và dị ứng: nổi mẩn ngứa. 5 -Hệ thần kinh: nhức đầu, ù tai, chóng mặt, buồn ngủ và mất ngủ. -Gan và thận: tăng các enzym gan, tăng bilirubin và crearutinin huyết thanh. -Máu và hệ bạch huyết: tăng bạch cầu ái toan và giảm bạch cầu 1.1.4.Sự tương tác của Levofloxacin với các loại thuốc khác Thuốc viên: không có sự tƣơng tác với thức ăn. Hai giờ trƣớc hoặc sau khi uống Levofloxacin, không nên uống những chế phẩm có chứa cation hóa trị II hoặc hóa trị III nhƣ các muối sắt hoặc thuốc kháng axit chứa magnesi hoặc nhôm vì có thể làm giảm hấp thu. Sinh khả dụng của Levofloxacin giảm có ý nghĩa khi thuốc đƣợc dùng chung với sucralfate, vì thế chỉ nên uống sucralfate 2h sau khi uống Levofloxacin. Thuốc và dung dịch tiêm truyền: thận trọng và điều chỉnh liều khi uống với theophylline. Nên thận trọng khi dùng chung Levofloxacin với những thuốc ảnh hƣởng sự bài tiết ở ống thận nhƣ probenecid và cimetidine, đặc biệt là trên bệnh nhân suy thận. Tăng thời gian đông máu hoặc chảy máu đã đƣợc báo cáo trên những bệnh nhân đƣợc điều trị Levofloxacin phối hợp với thuốc đối kháng vitamin K, do đó cần theo dõi các xét nghiệm đông máu trên bệnh nhân đƣợc điều trị trên thuốc đối kháng vitamin K. 1.2.Một số phƣơng pháp xác định Levofloxacin. Dựa vào cấu trúc và tính chất của Levofloxacin mà có nhiều phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nhƣ: phƣơng pháp quang học, phƣơng pháp điện hóa và phƣơng pháp sắc ký. Mỗi phƣơng pháp đều có những ƣu nhƣợc điểm riêng. 1.2.1.Phương pháp điện hóa A.Radi và Z.El-Sherif [10] đã xác định Levofloxacin trong nƣớc tiểu ngƣời bằng phƣơng pháp von-ampe hòa tan hấp phụ anot kĩ thuật quét sóng vuông trên điện cực glassy cacbon. Theo tài liệu tác giả đã sử dụng kỹ thuật quét sóng vuông và von-ampe vòng xác định đƣợc pic oxi hóa của Levofloxacin xuất hiện ở thế 0,4V với điện cực so sánh là Ag/AgCl trong hệ đệm acetat pH = 5,0; khoảng tuyến tính 6 xác định đƣợc là 6.10-9M đến 5.10-7M với giới hạn phát hiện là 5.10-9M. Nghiên cứu cũng tiến hành xác định các mẫu bằng phƣơng pháp HPLC để đối chứng, kết quả cho thấy phƣơng pháp đã dùng để xác định Levofloxacin trong mẫu nƣớc tiểu hoàn toàn tin tƣởng đƣợc. 1.2.2.Phương pháp phân tích quang học Juan Antonio Ocana González và các cộng sự [26] đề xuất phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang để xác định Levofloxacin trong thuốc viên, nƣớc tiểu và huyết tƣơng. Phƣơng pháp huỳnh quang cho phép xác định Levofloxacin khoảng 20 – 3000ng/ ml trong dung dịch nƣớc chứa đệm natri acetat đƣợc điều chỉnh pH bằng axit acetic (pH = 4) với bƣớc sóng hấp thu ở 292nm và phát xạ ở 494nm. Mixen tăng cƣờng huỳnh quang để cải thiện độ nhạy và cho phép đo trực tiếp Levofloxacin trong huyết thanh (5mg/ ml) và nƣớc tiểu (420mg/ ml), trong 8mM dung dịch natri lauryl sulfat ở pH = 5. Manimala M [32] đã phát triển phƣơng pháp quang phổ UV để xác định Hemihydrat Levofloxacin trong dƣợc phẩm. Phổ UV hấp thụ cực đại ở 286,4nm, khoảng tuyến tính từ 4 đến 10µg/ml. Ứng dụng phƣơng pháp vào phân tích Levofloxacin trong thuốc viên cho kết quả lƣợng Levofloxacin thu đƣợc so với hàm lƣợng ghi trên nhãn đạt khoảng 98,4 - 101,2%, độ lệch chuẩn RSD < 3%, độ thu hồi đạt 99,54-101,27% cho thấy phƣơng pháp có độ chính xác cao. Cũng trong mẫu dƣợc phẩm, VN Desai và các cộng sự [47] đã sử dụng phƣơng pháp phân tích quang phổ UV để xác định hàm lƣợng Levofloxacin ở bƣớc sóng 290nm. Phƣơng pháp cho khoảng tuyến tính 0,25 - 12,0mg/ ml với hệ số tƣơng quan R2 = 0,999, độ thu hồi 98,7%. Khi đƣợc áp dụng cho hai mẫu thuốc trên thị trƣờng, hàm lƣợng levofloxacin thu đƣợc so với trên nhãn là 99,69 ± 2,38 và 102,65 ± 3,64%. 1.2.3.Phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (FPIA) I.A. Shanin và các cộng sự [24] đã phát triển phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (fluoresence polarization immunoassay FPIA) để xác định chất 7 kháng sinh Levofloxacin trong nƣớc tiểu. Tác giả đã cho kháng nguyên Fluorescein gắn với các Fluoroquinolone khác nhau để đánh dấu. Đánh dấu dựa trên nhận dạng garenoxacin với fluorescein 4 -aminomethyl và kháng thể đa dòng cho phát hiện Levofloxacin là tốt nhất. Phƣơng pháp FPIA cho giới hạn phát hiện 1,00ng/ ml và phạm vi phân tích 2,50 – 50,0ng/ ml. Tác giả phát triển phƣơng pháp này để xác định Levofloxacin trong nƣớc tiểu với giới hạn phát hiện 0,50ng/ ml và phạm vi phân tích 1,00 – 10,00ng/ ml. 1.2.4.Phương pháp sắc ký lỏng Cũng nhƣ các phƣơng pháp phân tích khác, phƣơng pháp sắc ký lỏng đã đƣợc sử dụng để phân tích hều hết các mẫu phức tạp trong hầu hết các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục vụ đời sống hay trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học. Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, phƣơng pháp góp phần tách và định lƣợng các chất dinh dƣỡng trong sản phẩm; phân tích các độc tố nhƣ thuốc bảo vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nƣớc uống, Trong chữa bệnh góp phần xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm nhƣ phân tích các thuốc kháng sinh trong dịch sinh học; phân tích dƣợc phẩm, dƣợc liệu,... [5]. Từ những ƣu điểm trên nên đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp này để phân tích Levofloxacin trong các mẫu thực tế nhƣ dịch sinh học của ngƣời và động vật; nƣớc thải; dƣợc phẩm. Sắc ký lỏng là quá trình tách chất dựa trên sự phân bố liên tục của các cấu tử phân tích lên pha tĩnh và pha động. Pha tĩnh thƣờng đứng yên, có khả năng hấp thu các chất phân tích. Pha động là chất lỏng di chuyển qua pha tĩnh. Do các cấu tử có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau đi ra. Các cấu tử đi ra khỏi cột đƣợc đƣa vào detector UV, PDA/DAD, FLD hoặc detector MS. Đối với detector UV hay PDA/DAD phát hiện bởi tín hiệu dung môi chứa cấu tử hấp thụ ở một bƣớc sóng nhất định để định lƣợng. Đối với detector khối phổ MS, cấu tử đƣa ra khỏi cột đi vào detector MS và ở đây cấu tử đƣợc ion hóa, phân mảnh và đƣợc phát hiện dựa trên thông số M/Z. Đối với 8 detector huỳnh quang FLD, cấu tử lần lƣợt hấp thụ và phát quang ở một bƣớc sóng nhất định. Sắc ký lỏng có khả năng tách và định lƣợng đồng thời các chất có độ phân cực gần nhau. Vì vậy, có thể tách đƣợc các đồng phân và đồng đẳng của nhau từ đó định lƣợng rõ ràng hơn. Đối với các chất phân tích nhóm quinolone trong cấu trúc phân tử chứa vòng thơm (vòng quinolone) với các liên kết bội do đó nó có khả năng hấp thụ tia UV (có thể xác định bằng detector UV hoặc PDA/DAD), cũng nhờ có vòng thơm này mà các chất kháng sinh nhóm quinolone có khả năng pháp huỳnh quang khi đƣợc kích thích bằng tia sáng ở bƣớc sóng phù hợp (có thể xác định bằng detector huỳnh quang). Dƣới đây là môt số nghiên cứu tiêu biểu:  Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector huỳnh quang FLD Zhi-Ling Zhou và các cộng sự [51] dùng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang xác định Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời. Levofloxacin và Terazosin đƣợc tách sắc ký trên cột C18 với pha động gồm đệm phosphat (pH = 3,0), acetonitril và trietylamin (76:24:0,076) tốc độ dòng 1ml/phút. Các chất phân tích đƣợc phát hiện bằng detector huỳnh quang ở bƣớc sóng kích thích và phát xạ lần lƣợt là 295 và 440 nm. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn là 0,0521 - 5,213µg/ ml đối với Levofloxacin với giới hạn phát hiện là 0,0521µg/ ml. Thời gian lƣu của Levofloxacin và Terazosin lần lƣợt là 2,5 và 3,1 phút. Độ thu hồi dao động trong khoảng 86 - 89% ở nồng độ 0,0521; 0,5213 và 5,213µg/ ml. Phƣơng pháp thành công trong nghiên cứu dƣợc động học và tƣơng đƣơng sinh học của các sản phẩm chứa Levofloxacin. Đối với mẫu đất nông nghiệp Michela Sturini cùng các cộng sự [36] đã sử dụng phƣơng pháp chiết xuất vi ba không dùng dung môi (MAE) kết hợp HPLC detector huỳnh quang để xác định đồng thời tám kháng sinh Fluoroquinolon (FQs) bao gồm Ciprofloxacin, Danofloxacin, Enrofloxacin, Flerofloxacin, Levofloxacin, Marbofloxacin, Norfloxacin và Orbifloxacin. Bằng cách sử dụng dung dịch chứa 9 Mg (II) là tác nhân tạo phức, do đó tránh việc sử dụng các dung môi hữu cơ. Các điều kiện MAE tối ƣu đã đƣợc thành lập thông qua chemometric bởi các biến nhiệt độ, thời gian chiếu xạ và độ ẩm hoặc dung môi. Ke He, Lee Blaney [27] xác định đồng thời 11 kháng sinh Fluoroquinolone (FQs) trong các mẫu môi trƣờng và nƣớc thải bằng phƣơng pháp chiết pha rắn (SPE) và sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detecter huỳnh quang. Quá trình tách sắc ký của 11 FQs đƣợc thực hiện trên cột pentafluorophenyl 150 mm sử dụng chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm metanol, acetonitril, và đệm phosphat 20 mM (pH = 2,4). Bƣớc sóng kích thích và phát xạ lần lƣợt là 276 - 296 nm và 444 - 506 nm. Giới hạn định lƣợng của thiết bị là 20 - 100 pg của khối lƣợng tiêm. Trong số 11 FQs thì xác định đƣợc 7 FQs bao gồm: Ciprofloxacin, Difloxacin, Enrofloxacin, Fleroxacin, Norfloxacin, Moxifloxacin và Ofloxacin trong mẫu nƣớc thải và nƣớc bề mặt trong bốn tháng với nồng độ 5 - 1292; 2 - 504 và 4 - 187ng/ l.  Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector MS Ping-Fei Fang [39] sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ để xác định đồng thời Isoniazid (INH), Rifampicin (RFP) và Levofloxacin (LVX) trong các mô chuột và huyết tƣơng và dùng Gatifloxacin là chất nội chuẩn (IS). Các hợp chất và I.S đƣợc chiết xuất từ đồng chất mô và huyết tƣơng bằng phƣơng pháp tạo tủa protein bằng metanol. Việc tách sắc ký các chất phân tích đƣợc thực hiện trên cột Welch C4 (250mmx4.6mm, 5.0microm, Mỹ) ở 25oC, sử dụng chƣơng trình rửa giải gradient với pha động gồm là axit formic 0,05% và metanol (93:7) tại tốc độ dòng 1 ml/ phút. Đối với ba chất phân tích, độ thu hồi trong khoảng 83,3% - 98,8% trong các mô; trong khoảng 75,5% - 90,8% trong huyết tƣơng, độ chính xác từ 91,7% đến 112,0% trong các mô và từ 94,6% đến 108,8% trong huyết tƣơng. Giới hạn phát hiện (LOD) cho INH, RFP và LVX trong mô chuột lần lƣợt là 0,04, 0,05 và 0,05µg/ ml và trong huyết tƣơng chuột tƣơng ứng là 5,5, 6,0 và 6,6ng/ ml. 10 Đối với nền mẫu là huyết tƣơng, Sung Joong Lee và các cộng sự [44] đã sử dụng phƣơng pháp LC-ESI-MS/MS định lƣợng nồng độ của Moxifloxacin (MFX) và Levofloxacin (LFX) trong huyết thanh ngƣời, Enrofloxacin (EFX) đƣợc sử dụng làm chất nội chuẩn (IS). Định lƣợng đƣợc tính toán thông qua các phản ứng của quá trình chuyển đổi từ các ion mẹ của các ion con M/Z 402,2 → 384,2 cho MFX; 362,2 → 318,2 cho LFX và 362,1 → 318,3 cho EFX. Độ thu hồi trung bình tƣơng ứng là 96,0% và 95,5% cho MFX. Áp dụng các phƣơng pháp để định lƣợng MFX và LFX trong các mẫu huyết thanh thu đƣợc từ mƣời bệnh nhân MDR-TB. Kết quả chỉ ra rằng phƣơng pháp này có thể áp dụng nhƣ một công cụ kiểm định thuốc để phân tích chính xác MFX và LFX trong thời gian ngắn hạn.  Phƣơng pháp HPLC sử dụng detector UV hoặc PDA/DAD Hanwen Sun cùng cộng sự [19] phát triển phƣơng pháp mới để xác định đồng thời các chất Natri Ceftriaxone, Metronidazole và Levofloxacin trong nƣớc tiểu ngƣời. Natri Ceftriaxone, Metronidazole và Levofloxacin đƣợc tách ra trên cột C18, pha động gồm KH2PO4 1,5 mM (pH 4,5) với Trietylamin 0,0125% - Metanol (70:30), lần lƣợt ở bƣớc sóng 247, 320 và 292 nm. Giới hạn phát hiện của Natri Ceftriaxone, Metronidazole, và Levofloxacin tƣơng ứng là 0,05; 0,01 và 0,25 mg/ ml và độ thu hồi trung bình trong nƣớc tiểu của ngƣời đang ở trong khoảng 97,73- 100,7% với độ lệch trung bình tƣơng đối chuẩn (RSD) trong khoảng 2,5% và 3,0%. Nghiên cứu này có thể là tài liệu tham khảo cho việc sử dụng thuốc hợp lý và phƣơng pháp luận cho việc nghiên cứu dƣợc động học của thuốc kết hợp. T. Manish Kumar [45] đã xây dựng phƣơng pháp HPLC để xác định Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời với detector UV tại 235nm với pha động gồm ACN – đệm phosphat (pH = 2,5) đƣợc tách trên cột C18 và tốc độ dòng là 1ml/phút. Thời gian lƣu của Levofloxacin và chất nội chuẩn tƣơng ứng là 5,9 phút và 10,1 phút. Độ thu hồi trung bình trên 85,0%. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công trong nghiên cứu dƣợc động học. 11 William V. Caufied [49] triển phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) và Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời. Các hợp chất đƣợc tách bằng pha động Na2HPO4 25mM và axit trifluoroacetic 0,1% (pH 2,4) - ACN (86:14) trên cột octadecylsilane với bƣớc sóng phát hiện ở 266 nm. Ciprofloxacin đƣợc sử dụng làm chất nội chuẩn. Độ thu hồi trung bình là 94,1% với AZT là 91,2% với Levofloxacin và 84,7% cho chất nội chuẩn. Nghiên cứu này phù hợp để sử dụng trong các nghiên cứu dƣợc động học và theo dõi thƣờng xuyên huyết tƣơng ở những bệnh nhân nhiễm HIV sử dụng các loại thuốc này. 1.3.Các phƣơng pháp xử lý mẫu phẩm sinh học Hàm lƣợng Levofloxacin trong mẫu phẩm sinh học thƣờng nhỏ vì thế việc nghiên cứu phƣơng pháp để xử lý làm giàu mẫu là rất cần thiết. Hiện nay có hai phƣơng pháp chiết thƣờng dùng là chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn. 1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Chiết lỏng – lỏng là phƣơng pháp chiết dựa theo sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, thƣờng một pha nƣớc và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít tan vào trong nƣớc. Quá trình chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha nƣớc vào pha hữu cơ đƣợc thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tƣơng tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [3]. Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết. Điều kiện chiết chất phân tích đi vào pha hữu cơ: - Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không đƣợc trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích. - Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt. - Cân bằng dịch chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết đƣợc tốt 12 - Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia, Phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng có thể áp dụng cho chất vô cơ nhƣ các ion kim loại, các anion tan trong nƣớc và chất hữu cơ với ƣu điểm thiết bị đơn giản, dung môi dễ bay hơi. Phƣơng pháp này đã đƣợc F.A. Wong, S.J. Juzwin và S.C. Flor [14] sử dụng để xử lý mẫu huyết tƣơng và nƣớc tiểu ở ngƣời xác định Levofloxacin. Huyết tƣơng (0,25ml) hoặc nƣớc tiểu (0,01ml) đƣợc thêm 100µl chất nội chuẩn, 250µl dung dịch đệm phosphat sau đó thêm 4ml diclometan, hỗn hợp đƣợc trộn trong 30s và li tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Pha hữu cơ đƣợc cô đặc dƣới dòng khí nitơ. Phần cặn chiết còn lại đƣợc hòa tan trong 100µl pha động là hỗn hợp của CuSO4.5H2O chứa L-isoleucine - metanol (87,5:12,5) và bơm vào hệ thống HPLC phân tích. Hiệu suất thu hồi trung bình ở các mức nồng độ khác nhau của mẫu huyết tƣơng và nƣớc tiểu tƣơng ứng là 88 - 98% và 87 - 95%. Cũng với phƣơng pháp này T. Manish Kumar, Gurrala Srikanht, J. Venkateshwar Rao và KRS. Sambasiva Rao [43] dùng để xử lý mẫu huyết tƣơng ngƣời xác định Levofloxacin bằng dung môi etylacetat. Mẫu huyết tƣơng tự tạo (0,05ml) trộn thêm 50µl chất nội chuẩn Gatifloxacin nồng độ 100ppm và đệm phosphat (pH = 2,5). Hỗn hợp đƣợc chiết với 3ml etylacetat sau đó li tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 40oC. Pha hữu cơ đƣợc bốc hơi dung môi bằng khí nitơ, phần cặn chiết còn lại pha trong 400µl pha động và bơm vào hệ thống HPLC phân tích. Hiệu suất thu hồi trung bình của Levofloxacin trong mẫu huyết tƣơng là 85,95%. 1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng đƣợc cải tiến thành hấp thụ pha rắn với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau. Trong đó chất tan ban đầu ở pha lỏng (nƣớc hoặc 13 dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn [3,5]. Pha rắn (còn đƣợc gọi là pha tĩnh) thƣờng là các hạt silicagel xốp, trung tính, hạt oxit nhôm, silicagel trung tính đã đƣợc ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocacbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18, hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các lại nhựa hoặc than hoạt tính Các hạt này đƣợc nhồi vào cột chiết nhỏ (thƣờng là cột có kích thƣớc 5 x 1cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2mm với đƣờng kính 3- 4cm (đĩa chiết). Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tƣơng tác với chất cần phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu. Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi thích hợp. Ví dụ: chất hữu cơ thƣờng đƣợc rửa giải bằng aceton, acetonitrile, methanol,; kim loại thƣờng đƣợc rửa giải bằng dung dịch axit. Thông thƣờng, thể tích rửa giải nhỏ hơn nhiều lần so với thể tích mẫu ban đầu, điều này có nghĩa chất phân tích đã đƣợc làm giàu. Điều kiện chiết pha rắn: Pha rắn hay pha lỏng phải có tính chất hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với một hay một nhóm ion nhất định. Hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết phải lớn, để hiệu quả chiết cao. Quá trình chiết phải xảy ra nhanh, nhanh đạt đến cân bằng nhƣng không có tƣơng tác hóa học làm mất hay hỏng chất phân tích. Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch cao để có thể rửa giải chất phân tích ra khỏi pha lỏng. 14 Không làm nhiễm bẩn chất phân tích. Sự chiết đƣợc thực hiện trong một số điều kiện nhất định, phù hợp, lặp lại đƣợc, càng đơn giản càng tốt. Hiện nay chiết pha rắn đang đƣợc sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do những ƣu điểm sau: - Hiệu suất thu hồi cao. - Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch. - Thích hợp cho mẫu lƣợng nhỏ và phân tích lƣợng vết các chất. - Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt. - Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn. Trong phƣơng pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) và Levofloxacin trong huyết tƣơng ngƣời William V. Caufied [46] đã sử dụng phƣơng pháp chiết pha rắn để làm sạch mẫu huyết tƣơng. Cột chiết pha rắn C18 1cc/100mg đƣợc hoạt hóa cột bằng 1ml Metanol, sau đó với 1ml nƣớc deion và 1ml đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4). Mẫu huyết tƣơng đƣợc thêm 100µl chất nội chuẩn trƣớc khi đƣa lên cột chiết, sau đó rửa tạp 3 lần với 250µl đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4), cuối cùng đƣợc rửa giải với 1,0 ml hỗn hợp đệm NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) – MeOH (95:5). Hỗn hợp thu đƣợc đem cô cạn sau đó đƣợc pha loãng với pha động. Zidovudine và Levofloxacin đƣợc tách trên cột C18, với pha động là hỗn hợp của NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) : ACN (86:14).