Luận văn Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60420107 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội – Năm 2015 Công trình được hoàn thành tại: Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) – Bộ Y Tế Người hướng dẫn khoa học: TS. Đỗ Tuấn Đạt PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Vân Trang Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, 14h00 ngày 21 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: Trung tâm Thông tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội PHẦN MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốc gia trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy, phát triển các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay. Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng các quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào. Một trong những thông số rất quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng nguyên vi rút cúm có mặt trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các tiêu chuẩn về chất lượng kháng nguyên là một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá được chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” . 2. MỤC TIÊU, NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN - Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm - Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm.. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Trong nhiều thập kỷ qua, bên cạnh virus cúm mùa, thế giới liên tục phải trải qua những đại dịch cúm với các chủng khác nhau, A/H5N1, A/H7N9, A/H1N1 đại dịch. Sản xuất virus cúm vừa phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt về chất lượng vắc xin, vừa phải đối diện với việc thay thế chủng hàng năm cũng như các chủng mới gây đại dịch. Việc xây dựng quy trình và tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vắc xin chung cho các vắc xin cúm và riêng cho một số vắc xin phòng các chủng cúm gây đại dịch là rất quan trọng, nhằm đảm bảo chất lượng, tính an toàn và tính kháng nguyên của vắc xin. Những đánh giá này có thể là cơ sở để áp dụng cho các vắc xin cúm mới khác, nhằm nhanh chóng đưa vắc xin mới vào thử nghiệm và sử dụng5. KẾT CẤU LUẬN VĂN Luận văn ngoài phần mở đầu, danh mục các hình, danh mục các bảng, bảng ký hiệu các chữ viết tắt, kết luận, tài liệu tham khảo, phụ lục còn có 3 chương sau: Chương 1. Tổng quan Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN Đặc điểm chung của vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựalà căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu trúc 1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. Các hạt virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (-). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn. 1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982. Vi rút R8/34 có 13.588 nucleotit. 1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bào chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp giữa vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN- polymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-) của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của mARN có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ. Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân. 1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là 57,1%. 1.6. Kỹ thuật di truyền ngược Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản diễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp polymeraza của vi rút. Trong quá trình tái bản vARN được sử dụng làm khuôn để tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khuôn để tổng hợp sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản là vRNP. 1.7. Dịch tễ học bệnh cúm Dịch cúm xảy ra theo xu hướng khác nhau ở các năm, thường xảy ra vào mùa đông ở bắc và nam bán cầu, nhưng xuất hiện hàng năm ở khu vực nhiệt đới. Vi rút cúm có khả năng tấn công cao, nên tỷ lệ mắc bệnh do vi rút cúm trong dân số là tương đối cao. Tăng tỷ lệ mắc và tử vong do cúm xảy ra ở cực trị của nhóm tuối và ở người đang mắc sẵn một bệnh khác. Mô hình dịch tễ phản ánh sự thay đổi đặc điểm kháng nguyên của vi rút cúm, và sự lây lan của bệnh phụ thuộc vào nhiếu yếu tố, bao gồm khả năng lây nhiễm và sự mẫn cảm của nhóm dân cư. Đặc biệt ở vi rút cúm A có khả năng thay đổi định kỳ lớp vỏ kháng nguyên glycoproteins như hemagglutinin và neuraminidase. Trong số các vi rút cúm nhóm A ảnh hưởng đến sức khỏe ở người có ba phân typ chính của hemagglutinin (H1, H2, và H3) và ba phân typ chính của neuraminidase (N1 và N2) đã được công bố. Vi rút cúm B ít có sự thay đổi về đặc điểm kháng nguyên. TCYTTG ước tính hàng năm có khoảng 3-5 triệu người mắc và 250.000 – 500.000 người tử vong vì cúm. 1.8. Sinh bệnh học Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên. Vi rút phát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phá hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô hấp. Kèm theo sự nhân lên của vi rút, interferon được phát hiện trong giai đoạn cấp tình của bệnh trong một thời gian ngắn là nguyên nhân của sự nguy hiểm do nhiễm vi rút cúm. 1.9. Vắcxin cúm Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm. Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp căn bản để kiểm soát cúm ở mức độ cá nhân và cộng đồng. Vắcxin cúm được phát triển và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và vi rút bất hoạt. Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích miễn dịch đối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do đó thành phần của vắcxin cúm thường xuyên được thay đổi sao cho tương thích nhất với chủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước. Vai trò kích thích các đáp ứng miễn dịch khác của vắcxin trong phòng ngừa bệnh vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, và được TCYTTG khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già, người đang mắc bệnh “đặc biệt”, và cán bộ y tế. Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuất vắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phôi (IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP. HCM), trong đó VABIOTECH đã hoàn thành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 do VABIOTECH sản xuất là an toàn trên người tình nguyện. Các chỉ số sinh hóa học ở những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường. Vắcxin A/H5N1 sản xuất trên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất cả các đối tượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu Âu. Từ những kinh nghiệm có sẵn trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH cũng đã xây dựng được một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định và hiệu suất cao. Người Việt Nam sẽ được sử dụng vắcxin cúm do Việt Nam sản xuất trong một ngày không xa. 1.10. Một số dạng vắcxin cúm Hiện nay có nhiều cách tiếp cận công nghệ khác nhau để sản xuất vắcxin cúm và cũng có nhiều loại vắcxin cúm khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật sử dụng: Vắcxin toàn tế bào (vi rút toàn phần) Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine) Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine) Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào Vắcxin tái tổ hợp và hấp phụ Vắcxin sống giảm độc lực 1.11. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm Kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm - Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm - Nhận dạng: Xác định các kháng nguyên đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán miễn dịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu. - Xác định hàm lượng kháng nguyên HA: - Thử nghiệm về các nguyên liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh các nguyên liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế bằng phương pháp chạy SDS-PAGE nhưng vấn phải giữ nguyên đặc tính kháng nguyên bằng phương pháp kính hiển vi điện tử. - Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry. Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm - Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho mỗi loạt vắcxin. - Hàm lượng kháng nguyên HA. - Thử nghiệm an toàn chung - Thử nghiệm chất gây sốt - Thử nghiệm công hiệu. CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Tế bào Tế bào thận chó thường trực (Madin- Darby Canine Kidney): MDCK (London – Anh) 2.1.2. Mẫu thử nghiệm Mẫu nước nổi sau gặt vi rút trong quy trình sản xuất vắc xin cúm. Mẫu bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắc xin cúm. 2.1.3. Môi trường và hóa chất và các trang thiết bị Các môi trường, hóa chất và trang thiết bị cần thiết 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu: Phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50, chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, xá định nồng độ kháng nguyên HA bằng SRID, định lượng protein tổng số, điện di trên gel SDS-PAGE, kính hiển vi điện tử, phân tích xu hướng tại Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1. CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm 3.1.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 Tách tế bào MDCK từ chai ra phiến với mật độ 4x104 tế bào/ml. Sau 2 ngày nuôi cấy tế bào MDCK trên các phiến 96 giếng đều kín 1 lớp. Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác để tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm: nhiệt độ, môi trường và thời gian nuôi cấy vi rút. Các phiến trước khi tiến hành thử nghiệm có mật độ tế bào tương đương nhau. Hình 3.5. So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại môi trường MEM, DMEM, LH3E tại 32oC sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày ( Giá trị trung bình của 3 lần thử nghiệm). Qua các kết quả thu được sau 3 lần tiến hành lặp lại thử nghiệm chúng tôi đã tìm được các điều kiện tối ưu cho quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm là: - Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC - Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM - Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày. 3.1.2. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1. Bảng 3.4. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 CCID50 (CCID50/ml) HA (HAU) SRID (µg/ml) Protein (µg/ml) Loạt 0112 107,5 1024 177,4 324,13 Loạt 0212 107,8 512 173,1 416,67 Loạt 0312 108,0 512 195,1 379,01 Loạt 0412 108,4 512 228,0 388,27 Loạt 0512 108,6 512 169,3 373,04 Loạt 0113 107,9 512 169,0 304,61 Loạt 0213 108,0 1024 127,7 245,09 Loạt 0313 108,2 1024 165,2 278,96 Loạt 0413 108,5 512 182,17 277,02 Bảng 3.5. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 CCID50 (CCID50/ml) HA (HAU) SRID (µg/ml) Protein (µg/ml) Loạt 0113 107,5 256 132,2 498,1 Loạt 0213 108,2 512 159,1 507,1 Loạt 0313 107,0 512 131,6 525,5 Loạt 0413 107,8 512 135,2 558,8 Loạt 0114 108,5 256 129,5 480,6 Loạt 0214 108,6 512 145,6 563,4 Loạt 0314 108,4 512 142,5 556,2 Loạt 0414 108,6 512 140,8 532,5 Loạt 0115 108,2 512 125,2 505,2 Loạt 0215 108,8 512 138,5 512,8 Sau bước tinh chế bán thành phẩm cúm, chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp điện di mẫu trước siêu ly tâm và mẫu sau siêu ly tâm trên gel SDS-PAGE. Kết quả chạy SDS-PAGE cho thấy sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm. Đồng thời, với các phương pháp thông dụng hiện vẫn được áp dụng trong việc đánh giá chất lượng của kháng nguyên, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng đã tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh các kháng nguyên vi rút cúm. Phương pháp này được tiến hành trên các mẫu nuôi cấy vi rút cúm trên tế bào để quan sát quá trình nhân lên của vi rút cúm Các vi rút cúm A/H1N1 được tổng hợp đã nẩy chồi ra khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hoàn toàn bị teo lại, quan sát thấy rất nhiều hạt vi rút hoàn chỉnh giải phóng ra bên ngoài tế bào. Mẫu bán thành phẩm vắcxin cúm sau khi tinh chế để thấy được tính toàn vẹn của hạt vi rút cúm với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút. 3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm. Chúng tôi đã phân tích dữ liệu dựa trên kết quả của 9 loạt vắcxin đại dịch cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm mùa A/H1N1 để xây dựng tiêu chuẩn đáng giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm nhằm đảm bảo chất lượng mà còn đảm bảo tính ổn định của sản phẩm. 3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.10. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Từ đồ thị trên chúng tôi nhận thấy các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD) chứng tỏ các loạt BTP đều ổn định vể hiệu giá vi rút. Từ đó chúng tôi phân tích dữ liệu và xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên. 3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm Hình 3.12. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.13. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, các kết quả hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hiệu giá kháng nguyên HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên. 3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID Hình 3.15. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1. Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1. Qua đồ thị trên, các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên. 3.2.4. Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số Hình 3.17. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1 Hình 3.18. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1 Qua đồ thị trên, các kết quả hàm lượng Protein tổng số đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng Protein tổng số ổn định. Từ các phân tích trên và dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số của vắc xin sản xuất trên trứng gà có phôi, chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml. 3.2.5. Tiêu chuẩn của điện di trên gel SDS-PAGE Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm. 3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút. KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm: Tìm ra các điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là: + Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC + Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày Đã áp dụng được các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm như phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định cũng như chất lượng của sản phẩm. Hiệu giá vi rút trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên. Hiệu giá kháng nguyên HA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên. Hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên. Hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml. Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm. Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút.