Luận văn Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

N CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu vật - Để thiết kế mồi chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng các trình tự gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm đã công bố trên Ngân hàng gen (GenBank). - Để nghiên cứu tối ưu hóa phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cúm A/H5N1, chúng tôi sử dụng RNA virus cúm A/H5N1 do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng, chúng tôi sử dụng RNA virus A/H3, A/H1N1, cúm B do viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương cung cấp; RNA virus A/H5 do Trung tâm chẩn đoán Thú Y Trung Ương cung cấp. - Để thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR chúng tôi sử dụng 14 mẫu dương tính với cúm A/H5N1 (Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương cung cấp) và 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm năm 2009 ở một số tỉnh phía Bắc. 2.1.2. Hóa chất - Hóa chất tách chiết RNA virus trong bộ sinh phẩm QIAamp viral RNA Mini Handbook for purification of viral RNA. - Hóa chất phát hiện virus cúm A/H5N1 trong bộ sinh phẩm QIAGEN OneStep RT-PCR Kit Handbook. - Hoá chất tạo plastmid tái tổ hợp mang gen M, HA, NA trong bộ sinh phẩm CloneJETTM PCR Cloning. - Hoá chất tổng hợp RNA trong bộ sinh phẩm TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit. - Dung dịch đệm TBE 10X, agarose, loading dye 6X, 100bp DNA ladder, ethidium bromide 10mg/ml. - Ethanol (96-100%), nuclease free water. 2.1.3. Thiết bị - Các thiết bị dùng thu thập mẫu bệnh phẩm từ gia cầm bị bệnh: Trang bị bảo hộ cá nhân (găng tay các cỡ, khẩu trang N95, kính bảo vệ mắt, ủng, quần áo bảo hộ), ống falcon 1.5 ml (đựng bệnh phẩm), catheter (lấy dịch tỵ hầu hoặc hút dịch đường hô hấp dưới), tăm bông, đè lưỡi, túi nylon, pipet 1 ml, 5 ml, đĩa petri, lọ nhựa, túi đá, hộp bảo quản lạnh, phiếu thu thập bệnh phẩm - Thiết bị dùng trong các xét nghiệm phát hiện virus cúm A/H5N1: Máy ly tâm (Eppendorf), pipette các loại (Eppendorf), vortex, đầu côn (filter) các loại, tube PCR (RNase free) các loại, găng tay dùng 1 lần, máy luân nhiệt C1000 (BIORAD), Bio Safety Cabinet level 2 (BIOAIR), máy soi gel và chụp ảnh, bộ nguồn và bể điện di, khay đổ gel, bể nhuộm gel, cốc đong 500 ml, lò vi sóng, cân điện tử, nồi khử trùng,và các phần mềm thiết kế mồi (clustal X 2.0.11, fastPCR 5.4, BioEdit). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chọn mẫu Cách chọn mẫu: Khi có dịch cúm xảy ra, đối với mỗi đàn gia cầm chúng tôi sẽ chọn ngẫu nhiên từ 2-3 con gia cầm chết hoặc bị bệnh để lấy mẫu. Mẫu bệnh phẩm thu thập có thể là mẫu mô (khí quản, phổi, ruột, lách, thận, não, gan, tim) hoặc dịch ngoáy họng, ổ nhớp. Bệnh phẩm được thu thập trong vòng 3 ngày đầu sau khi gia cầm mắc bệnh vì khi đó sẽ có mật độ virus cao nhất. Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu Cách lấy mẫu: - Mẫu ngoáy họng hoặc mẫu ổ nhớp: Đưa tăm bông mềm vào vùng họng hoặc ổ nhớp của gia cầm, ngoáy kỹ vùng định lấy mẫu. Nếu lấy mẫu ngoáy họng, cần đưa đầu tăm bông vào đến khí quản để lấy được dịch trong đường hô hấp. Sau đó đưa đầu tăm bông vào tube chứa 3 ml môi trường vận chuyển và nhúng kỹ trong môi trường vận chuyển. Nhấc đầu tăm bông lên khỏi môi trường, ép nhẹ vào thành tube để lượng dịch còn lại ở đầu tăm bông xuống hết. - Mẫu mô: Đối với gia cầm chết hoặc bị bệnh, tiến hành mổ gia cầm và thu thập mẫu mô (phổi, khí quản, ruột...) và cho vào tube chứa môi trường vận chuyển virus. Bảo quản mẫu: Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập được bảo quản bằng đá lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm ngay trong vòng 48 giờ. Nếu không vận chuyển được mẫu về phòng thí nghiệm trước 48 giờ thì bảo quản ở -20oC hoặc -70oC. Khi vận chuyển, mẫu vẫn giữ ở trạng thái đông băng. Vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm: Bệnh phẩm trước khi vận chuyển được đóng gói kỹ trong 3 lớp nhằm bảo vệ bệnh phẩm trong quá trình vận chuyển: Vặn chặt nắp tube bệnh phẩm, bọc kỹ miệng tube bằng giấy parafin, bọc riêng từng tube bệnh phẩm bằng giấy thấm, đặt tube vào túi nylon vận chuyển, buộc chặt. Tiếp tục bọc bên ngoài túi vận chuyển bằng giấy thấm hoặc bông thấm nước, cho vào một túi nylon khác và buộc chặt. Phiếu thu thập bệnh phẩm được cho cùng với túi bệnh phẩm vào lớp túi nylon thứ 3, buộc chặt. Cho các túi bệnh phẩm đã đóng gói kỹ vào hộp bảo quản lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm Xử lý mẫu - Đối với mẫu mô: Mẫu bệnh phẩm thu thập trên gia cầm được cho vào tube 2 ml có nắp xoáy, bổ sung 1 ml nước tinh sạch và glass bead, lắc trên máy lắc trong 5 phút để phá vỡ tế bào và giải phóng virus. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút và thu lấy dịch nổi để tách chiết RNA. - Đối với mẫu ngoáy họng và ngoáy hậu môn được cho vào tube có chứa dung dịch vận chuyển virus. Các mẫu được lắc kỹ bằng vortex, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi để tách chiết RNA. Tách chiết RNA Sử dụng 0.14 ml dịch nổi bệnh phẩm đã xử lý để tách chiết RNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol. Trước khi tách chiết, kiểm tra và chuẩn bị các loại hóa chất theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Và các bước tách chiết như sau: - Hút 560 μl dung dịch buffer AVL/Carrier RNA vào tube ly tâm 1.5 ml. - Thêm 140 μl bệnh phẩm đã được xử lý vào tube chứa buffer AVL/Carrier RNA. Trộn kỹ bằng vortex trong 15 giây. - Để ở nhiệt độ phòng (15-25°C) trong 10 phút để virus bị phân giải hoàn toàn, ly tâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy tube. - Thêm 560 μl ethanol (96-100%) vào tube, trộn bằng vortex trong 15 giây, ly tâm nhẹ để tập trung dung dịch xuống đáy tube. - Hút 630 μl dung dịch ở trên chuyển vào QIAamp spin column (đã đặt sẵn trong tube 2 ml), cẩn thận tránh để ướt miệng tube. Đóng chặt nắp và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Nhấc QIAamp spin column ra đặt column vào một tube 2 ml mới và vứt bỏ tube cũ. - Hút số dịch còn lại vào QIAamp spin column rồi ly tâm và chuyển QIAamp spin column sang tube 2 ml mới. - Bổ sung 500 μl buffer AW1 và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt QIAamp spin column vào tube 2 ml khác và vứt bỏ tube cũ. - Đặt QIAamp spin column vào 1 tube ly tâm 1.5 ml, vứt bỏ tube cũ. Bổ sung 60 μl buffer AVE. Đóng chặt nắp, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. RNA có thể bền vững trong vòng 1 năm khi bảo quản ở –20°C hoặc –70°C. Thiết kế mồi Mồi là những đoạn oligonucleotide dài khoảng 18-30 nucleotide có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA muốn khuếch đại. Mồi có vai trò khởi động enzyme DNA polyemerase để kéo dài chuỗi DNA đích và quyết định hiệu quả và độ chính xác của phản ứng PCR. Để có thể phát hiện được virus trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật RT-PCR với độ đặc hiệu cao thì một trong những yếu tố quyết định chính là việc thiết kế mồi. Các mồi thiết kế phải đặc hiệu với các gen đặc trưng cho đối tượng cần xác định. Để chẩn đoán virus cúm A/H5N1, chúng tôi tiến hành thiết kế 3 cặp mồi phát hiện 3 trình tự đặc hiệu trên 3 gen M, HA và NA bao gồm: - Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen M của tất cả các subtype của virus cúm A. - Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen HA của virus cúm A subtype H5 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype HA khác. - Cặp mồi khuếch đại trình tự nucleotide đặc hiệu trên gen NA của virus cúm A subtype N1 và không khuếch đại trình tự nucleotide tương đương với các subtype NA khác Các cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen M, HA và NA của các chủng virus cúm A/H5N1 đã công bố trên Genbank theo các nguyên tắc nhất định về: kích thước mồi từ 18-30 nucleotide; nhiệt độ biến tính các mồi (Tm) tương đương nhau; tỷ lệ GC trong mồi từ 40-60%; trình tự nucleotide của mồi đặc hiệu với khuôn; tránh bắt cặp bổ sung của 2 hoặc nhiều hơn các nucleotide tại đầu 3’ của các mồi để giảm sự hình thành primer-dimer; các nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu với trình tự đích để giảm thiểu tối đa hiện tượng bắt cặp sai; tránh 3 hoặc nhiều hơn G hoặc C tại đầu 3’ liền nhau; tránh trình tự bắt cặp bổ sung bên trong mỗi mồi và giữa các mồi; chọn vị trí mồi sao cho kích thước các đoạn DNA đích nhân lên trong phản ứng multiplex RT-PCR phân biệt được trên bản điện di. Để thiết kế mồi, chúng tôi sử dụng các phần mềm chuyên dùng cho thiết kế mồi đó là FastPCR5.4, BioEdit, Clustalx2.0.11. Các bước thiết kế các cặp mồi đặc hiệu các gen M, HA và NA như sau: + Mở trang web của NCBI (National Center for Biotechnology Information) ( lựa chọn các thông tin cần thiết về: loài virus (virus cúm A), vật chủ (bất kỳ), khu vực (bất kỳ), các gen cần download (M, HA và NA), thời gian lưu hành, subtype (H5N1),... + Download các trình tự nucleotide của các gen M, HA và NA của virus đã được công bố trên GenBank dưới dạng FASTA file. Các chủng virus chọn để thiết kế mồi được phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau. + Tiến hành so sánh các trình tự nucleotide bằng phần mềm Clustal X 2.0.11 + Phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit, lựa chọn các đoạn trình tự có độ lặp lại cao để thiết kế mồi cho các gen. + Phân tích các trình tự có độ lặp lại cao bằng phần mềm FastPCR5.4 để lựa chọn các trình tự mồi đặc hiệu sử dụng được trong cùng một phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1. + Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi đã chọn bằng Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Cặp mồi thiết kế phát hiện gen M được lựa chọn từ những vùng bảo tồn trên gen M của các subtype virus cúm A khác nhau. Trong khi đó, các mồi phát hiện gen H5 và N1 được lựa chọn từ những vùng không thay đổi (ít bị đột biến) trên các trình tự gen HA và NA của virus cúm A subtype H5N1. Tối ưu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA Sau khi thiết kế được các cặp mồi, chúng tôi thực hiện phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi riêng rẽ để xác định các điều kiện (nồng độ mồi, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, số chu kỳ lặp lại) thích hợp nhất để phát hiện được từng gen M, HA và NA của virus cúm A/H5N1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với bộ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR, trên máy luân nhiệt C1000 (Biorad). Theo bộ sinh phẩm này, cả hai giai đoạn phiên mã ngược tạo cDNA (phản ứng RT) và giai đoạn khuếch đại (phản ứng PCR) được thực hiện trong cùng một tube phản ứng, nghĩa là sau khi cho RNA tách chiết vào tube, phản ứng phiên mã ngược sẽ được thực hiện trước nhờ enzyme Omniscript and Sensiscrip Reverse Transcriptases và tiếp đến phản ứng PCR nhờ enzyme Hot Star Taq DNA polymerase. Như vậy, tất cả các thành phần của phản ứng RT và PCR được cho vào một tube phản ứng trong cùng một lần. Thể tích của mỗi phản ứng RT-PCR thử nghiệm là 50 ml bao gồm các thành phần trong bảng 2.1: Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (ml) Nồng độ cuối 1 RNase free water 2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X 10 1X 3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each 4 Primer forward 10 mM 5 Primer reverse 10 mM 6 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2 7 RNase Inhibitor 40 U/ml 5 – 10 U 8 RNA của A/H5N1 1 pg - 2 mg Tổng cộng 50 Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.2): Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR Thứ tự Các bước Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) 1 Phiên mã ngược (RT) 30 50 2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase, ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính cDNA ban đầu 15 95 3 Biến tính cDNA 0.5 94 4 Gắn mồi 0.5-1 51-60 5 Kéo dài 0.5-1 72 6 Số chu kỳ 35-50 7 Hoàn thiện 5 72 Sản phẩm DNA khuếch đại được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 2%, nhuộm dung dịch ethidium bromide 0.5 µg/ml 15 phút. Gel được chụp ảnh và phân tích kết quả. Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp. Tối ưu nhiệt độ gắn mồi: Muốn mồi có thể bắt cặp hoàn toàn đặc hiệu trên sợi khuôn thì phải xác định được nhiệt độ gắn mồi (Ta- annealing temperature) tối ưu cho từng cặp mồi. Nhiệt độ bắt cặp mồi tối ưu có thể nhỏ hơn hoặc lớn hơn nhiệt độ biến tính mồi (Tm -melting temperature). Bắt đầu tối ưu nhiệt độ gắn mồi ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm mồi khoảng 4-5oC. Chúng tôi lựa chọn dải nhiệt độ 51oC đến 60oC để thử nghiệm tìm ra nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mỗi cặp mồi. Tối ưu nồng độ mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng của phản ứng PCR để quyết định tính đặc trưng và hiệu quả của phản ứng. Nồng độ mồi thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả bắt cặp, sẩn phẩm khuếch đại thấp. Ngược lại, nồng độ mồi quá cao sẽ hình thành những bắt cặp không đặc hiệu trên các vị trí khác nhau của mẫu và xuất hiện các primer - dimer, làm giảm sản phẩm PCR của các đoạn cần khuếch đại. Để tìm được nồng độ mồi tối ưu cho mỗi phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi đã thiết kế, chúng tôi thử nghiệm ở các nồng độ 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM; 0.6 µM; 0.7 µM; 0.8 µM và 0.9 µM. Tối ưu thời gian gắn mồi và kéo dài chuỗi: Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Thời gian kéo dài thử nghiệm ở 30 giây, 45 giây và 60 giây để xác định thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất ở mỗi chu trình nhiệt của từng phản ứng. Thời gian gắn mồi cũng được lựa chọn kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây. Tối ưu số chu kỳ phản ứng RT-PCR: Để phân tích được bằng điện di, thì sản phẩm PCR phải đạt lượng nhất định. Số chu kỳ của phản ứng quá thấp sẽ không đủ để tạo ra tín hiệu có thể phát hiện, còn số chu kỳ quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu và tốn nhiều thời gian đối với các xét nghiệm cần chẩn đoán nhanh. Trung bình số chu kỳ phản ứng khoảng 25-30 chu kỳ, nhưng trong phản ứng RT-PCR số chu kỳ phụ thuộc vào nồng độ mẫu RNA cao hay thấp và lượng sản phẩm cDNA của phản ứng phiên mã ngược. Để có số chu kỳ thích hợp cho mỗi phản ứng RT-PCR phát hiện từng riêng rẽ, chúng tôi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ. Đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA: Độ nhạy của phản ứng RT-PCR là số bản copy RNA nhỏ nhất mà phản ứng PCR cho kết quả dương tính. Để đánh giá độ nhạy của mỗi phản ứng RT-PCR, chúng tối sử dụng các gen HA, NA và M của chủng virus cúm A/H5N1 gắn vào plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp theo bộ sinh phẩm CloneJET™ PCR Cloning Kit. Các bước như sau: - Gắn các gen M, HA, NA vào vector pJET1.2/blunt (2974 bp): Làm tan đông sản phẩm PCR, các sinh phẩm trong bộ kit CloneJet PCR Cloning và đặt trên đá bào. Hút 6 ml (Nuclease free water), 10 ml (2X reaction buffer), 1 ml (sản phẩm PCR), 1 ml (DNA blunting enzyme) vào tube PCR 0.2 ml, vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây. Sau đó ủ ở 70oC trong 5 phút rồi đặt ngay lên đá lạnh. Tiếp theo, thêm vào mỗi tube PCR 1 ml (pJET 1.2/blunt cloning vector – 50 ng/ml) và 1 ml (T4 DNA ligase - 5 u/ml), vortex và ly tâm nhẹ trong 3-5 giây rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sản phẩm phản ứng được sử dụng trực tiếp để biến nạp vào vi khuẩn E.coli. - Tạo tế bào khả biến: Sau khi gắn trình tự gen của virus cúm A/H5N1 vào plasmid pJET1.2, để nhân lượng plasmid thì cần phải biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli TOP10 và nuôi cấy tế bào để plasmid có thể nhân lên với số lượng lớn. Để tế bào E.coli có thể dung nạp plasmid, chúng tôi tạo tế bào E.coli khả biến bằng phương pháp CaCl2 để làm cho vi khuẩn E.coli trở nên khả biến. Các bước: Nuôi tế bào E.coli trong 2 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy chuyển 40 ml dịch cấy tế bào sang tube chứa 2 ml LB, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 2 giờ rồi để trên đá 10 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn. Bổ sung 1 ml CaCl2 100 mM (để ở 4oC từ trước). Tiếp theo ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, hút bỏ dịch nổi, thu lấy cặn. Bổ sung một lần nữa 1 ml CaCl2 100 mM, ly tâm, thu cặn tế bào. Bổ sung 200 ml CaCl2 100 mM và 30 ml glycerol. Trộn đều, chia vào các tube, mỗi tube 50 ml. Giữ trên đá 1-2 giờ trước khi biến nạp (hoặc đông lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở -85oC). - Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến: Lấy tế bào khả biến từ -85oC, để trên đá 30 phút (hoặc sử dụng tế bào khả biến vừa chuẩn bị). Bổ sung 5 ml hỗn hợp lai vào 50 ml tế bào khả biến, để trên đá 30 phút. Sốc nhiệt ở 42oC trong 2 phút, sau đó đặt ngay lên đá bào trong 2 phút. Bổ sung 200 ml LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ. Trải dịch nuôi trên môi trường thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 mg/ml), nuôi ở 37oC qua đêm. - Tách chiết plasmid với GeneJET Plasmid Miniprep Kit: Lấy 1 khuẩn lạc riêng rẽ, nuôi lắc 200 vòng/phút, 37oC, 12-16 giờ trong tube falcon (chứa 3 ml LB lỏng đã bổ sung Ampicillin). Ly tâm 8000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn, sử dụng cặn này để tách chiết plasmid tái tổ hợp. Các bước: hòa tan cặn tế bào trong 250 ml Resuspension Solution, bổ sung 250 ml Lysis Solution và trộn đều. Thêm 350 ml Neutralization Solution, trộn đều. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để làm lắng các thành phần của tế bào và DNA nhiễm sắc thể. Chuyển dịch nổi chứa plasmid sang GeneJET spin column. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch và đặt column trở lại. Thêm 500 ml Wash Solution vào column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, đổ bỏ dịch và đặt column trở lại (làm 2 lần). Ly tâm 13000 vòng/phút, 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dung dịch trong column. Chuyển column sang một tube 1.5 ml, bổ sung 50 ml Elution Buffer vào chính giữa màng lọc của cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút và vứt bỏ cột lọc. Điện di 5 ml trên gel agarose 1% để kiểm tra sự tinh sạch của plasmid. Bảo quản plasmid tinh sạch ở -20oC. Để chắc chắn trình tự gen của virus cúm A/H5N1 đã được gắn với plasmid chúng tôi kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR. - Sau khi có plasdmid gắn các gen M, HA và NA của virus A/H5N1 tiến hành tổng hợp RNA với bộ sinh phẩm TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit (Fermentas). Các bước: + Chuẩn bị 20 µl thể tích phản ứng RT ở nhiệt độ phòng gồm các thành phần: 4 µl (5X TranscriptAid Reaction Buffer); 8 µl (ATP/CTP/GTP/UTP mix); 1 µg (Template DNA); 2 µl (TranscriptAid Enzyme Mix); to 20 µl (DEPC-treated water). + Trộn đều, ly tâm nhẹ và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 2 giờ. Tinh sạch RNA được phiên mã: Các plasmid tái tổ hợp (DNA) sau phiên mã được loại bỏ nhờ DNase I. RNA phiên mã được tách chiết với phenol:chloroform, kết tủa RNA bằng ethanol: + Bổ sung 115 µl DEPC-treated water và 15 µl dung dịch Sodium Acetate 3 M, pH 5.2 vào 20 µl hỗn hợp phản ứng phiên mã. Trộn đều. + Bổ sung hỗn hợp phenol/chloroform với tỷ lệ 1:1, sau đó xử lý 2 lần với chloroform tho tỷ lệ 1:1. Ly tâm và hút dịch ở pha trên sang một tube mới. + Tủa RNA bằng với 2 thể tích ethanol. Ủ ở -20oC ít nhất 30 phút và ly tâm để thu RNA. + Loại bỏ dịch nổi, thêm 500 µl ethanol 70% lạnh để rửa tủa. + Hoà tủa RNA với 20 µl DEPC-treated water, bảo quản RNA ở -20oC hoặc -70oC. Xác định chất lượng (độ tinh khiết) RNA bằng cách đo khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại (mật độ quang - OD: Optical density) ở bước sóng 260nm và 280nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Nếu tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1.8 - 2.0 thì RNA là tinh khiết. Từ giá trị OD260nm, xác định nồng độ của RNA theo công thức: Nồng độ dung dịch RNA (ng/µl) = OD260 x 40 ng/µl Dựa vào nồng độ RNA và kích thước của đoạn RNA được phiên mã tính được số bản sao RNA trong một đơn vị thể tích theo công thức: Số bản copy/ml = [Nồng độ RNA (ng/µl) x 6.023x1023]/[L x 330 x 109 (ng)] Với: L: số nucleotide của RNA; 330x109: Khối lượng 1 nucleotide tính ra ng; 6.023x1023: Số Avogadro. Sau đó, mẫu RNA được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ giảm dần 10 lần đến 101 bản sao RNA/µl và sử dụng làm mẫu chuẩn để đánh giá độ nhạy của phản ứng. Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng: Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M, HA và NA chúng tôi sử dụng các mẫu RNA của virus cúm A/H1N1, cúm A/H3, cúm B (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp), cúm A/H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương cung cấp) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phòng thí nghiệm để kiểm tra xem có hiện tượng phản ứng chéo xảy ra hay không. 2.2.6. Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 Sau khi xác định được các điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ, chúng tôi tiến hành tối ưu phản ứng multiplex RT- PCR với bộ sinh phẩm Qiagen Onestep RT-PCR để phát hiện đồng thời cả 3 gen của virus A/H5N1 trong cùng một phản ứng. Để tối ưu hoá phản ứng, chúng tôi cũng thử nghiệm ở các điều kiện khác nhau về thành phần, chu trình nhiệt của phản ứng dựa trên các điều kiện đã tối ưu của phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt C1000 (Biorad). Thể tích của phản ứng là 50 ml với các thành phần trong bảng 2.3: Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR: Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (ml) Nồng độ cuối 1 RNase free water 2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X 10.0 1X 3 dNTP mix 10 mM each 2.0 400 mM each 4 DiagMF 10 mM DiagMR 10 mM 5 DiagH5F 10 mM DiagH5R 10 mM 6 DiagN1F 10 mM DiagN1R 10 mM 7 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2.0 8 RNase Inhibitor 40 U/ml 0.25 10 U 9 RNA của A/H5N1 5.0 1 pg – 2 mg Tổng cộng 50 Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.4): Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR Thứ tự Các bước Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) 1 Phiên mã ngược (RT) 30 50 2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase, ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính cDNA ban đầu 15 95 3 Biến tính cDNA 0.5 94 4 Gắn mồi 0.5-1 51-60 5 Kéo dài 0.5-1 72 6 Số chu kỳ 35-50 7 Hoàn thiện 5 phút 72 Sản phẩm phản ứng (10 µl) được điện di trên gel agarose 2%, nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chụp ảnh trên hệ thống chụp ảnh gel. Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp (base pairs). * Tối ưu nồng độ các cặp mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR: Ban đầu, chúng tôi thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các nồng độ mồi đã tối ưu ở phản ứng RT-PCR. Sau đó căn cứ vào kết quả của phản ứng để thay đổi tỷ lệ các loại mồi cho phù hợp nhất. Nếu sản phẩm các đoạn DNA đích được khuếch đại không đều thì thực hiện tăng lượng mồi đối với các DNA đích khuếch đại ít và giảm lượng mồi đối với các DNA đích được khuếch đại nhiều để chọn ra nồng độ tối ưu nhất cho mỗi cặp mồi. * Tối ưu nhiệt độ gắn mồi: Để xác định được nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng multiplex RT-PCR, chúng tôi kiểm tra ở nhiệt độ từ 51oC đến 60oC. Chu trình nhiệt của phản ứng: Phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA ở 50oC trong 30 phút, biến tính cDNA ban đầu ở 95oC trong 15 phút; tiếp theo là 50 chu kỳ (94oC: 30s; 51oC - 60oC: 30s; 72oC: 45s); giai đoạn kéo dài chuỗi sau cùng thực hiện ở 72oC trong 5 phút. *Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi, thời gian gắn mồi, số chu kỳ: Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Chúng tôi kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây để tìm được thời gian kéo dài thích hợp nhất cho cả 3 đoạn DNA cần khuếch đại. Với thời gian gắn mồi chúng tôi, cũng kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây. Số chu kỳ phản ứng phản ứng được kiểm tra ở 35, 40, 45 và 50 chu kỳ. * Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex RT-PCR: Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex RT-PCR, chúng tôi sử dụng các mẫu RNA của virus cúm A/H1N1, cúm A/H3, cúm B (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp), cúm A/H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương cung cấp) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phòng thí nghiệm để kiểm tra xem có hiện tượng phản ứng chéo xảy ra hay không. * Đánh giá độ nhạy của phản ứng: Chúng tôi sử dụng các gen HA, NA và M của chủng virus cúm A/H5N1 gắn vào plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp, sau đó tiến hành tổng hợp RNA với bộ sinh phẩm TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit (Fermentas). Nồng độ RNA được xác định bằng cách đo khả năng hấp phụ ở bước sóng 260 nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng độ RNA và kích thước của đoạn RNA được phiên mã có thể tính được số bản sao RNA trong một đơn vị thể tích. Sau đó, mẫu RNA đư