Luận văn Nuôi cấy quang tự dưỡng cây hoa cúc cắt cành (chrysanthemum sp. ) bằng hệ thống túi nylon

carbon cho quá trình phát triển. Thêm vào đó, cây dị dưỡng được nuôi cấy trong điều kiện không thoáng khí (độ ẩm cao, nồng độ ethylene cao, nồng độ CO2 thấp), dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng và hình thái. Kết quả đưa đến sự tích tụ nước quá mức hay còn gọi là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification hay hyperhydricity) (Woodward S., 1991; Leshem B. và Sachs F. ,1985), sự trong mờ hay sự mọng nước. Kết quả là sự gia tăng trọng lượng tươi của cây đạt ở mức cao nhất. Xét về phương pháp nuôi cấy, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức là rất có ý nghĩa ở mức 0,01. Trong đó nuôi cấy dị dưỡng cho sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất (425,3mg/cây). Xét về ánh sáng, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa. Trong đó, các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có bổ sung ánh sáng đèn đạt trọng lượng tươi cao nhất (392,3mg/cây). Điều đó chứng tỏ sự gia tăng cường độ ánh sáng ở mức thích hợp, làm gia tăng hiệu suất quang hợp. Qua đó làm gia tăng sinh khối của cây (Kozai, 2005; Bùi Trang Việt, 2000). Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 427.1 423.6 282.8 361 0 200 400 600 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.6: Sự khác biệt về gia tăng trọng lƣợng tƣơi giữa các nghiệm thức  Ghi chú: AS đèn : Ánh sáng đèn. AS tự nhiên : Ánh sáng tự nhiên. 40 4.2.2. Gia tăng trọng lƣợng khô Kết quả nhận được cho thấy ở nghiệm thức quang tự dưỡng – ánh sáng tự nhiên (QT) cho gia tăng trọng lượng khô cao nhất (31,33mg/cây) và nghiệm thức dị dưỡng - ánh sáng đèn (DĐ) cho kết quả thấp nhất (20,77mg/cây). Nhưng sự khác biệt giữa tất cả các nghiệm thức là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên khi xét riêng giữa từng cặp tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng; ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên. Sự khác biệt rất có ý nghĩa. Các nghiệm thức dùng phương pháp quang tự dưỡng và nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có kết quả gia tăng trọng lượng khô cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi rút ra một số nhận xét: Cây được nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng, nguồn carbon cung cấp cho cây chủ yếu là CO2 của không khí. Qua các lỗ thông khí, cây vừa lấy nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để quang hợp, vừa thải khí ethylene, và có thể là các khí ức chế sinh trưởng nào đó, đồng thời giảm độ ẩm trong bịch nuôi cấy. Sự trao đổi khí làm gia tăng khả năng hấp thụ và thoát hơi nước của lá, giúp cho sự vận chuyển chất khoáng trong cây dễ dàng (Bùi Trang Việt, 2000). Kết quả làm giảm sự tích lũy nước quá mức và gia tăng khối lượng vật chất khô. Trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng cao, nồng độ khí CO2 cao, giúp cho bộ máy quang hợp của cây hoạt động hiệu quả. Trong đó lá là cơ quan chủ yếu để quang hợp tạo ra sản lượng vật chất khô. Vì vậy sản lượng vật chất khô phụ thuộc chủ yếu vào diện tích lá. Qua các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy ở các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên: kích thước lá và số rễ có sự gia tăng đáng kể. nó cũng đóng vai trò quan trọng tạo nên sự khác biệt trong gia tăng trọng lượng khô giữa nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên. Gia tăng trọng lượng khô (mg /cây) 20.77 29.01 31.33 24.33 0 10 20 30 40 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.7 Sự khác biệt về gia tăng trọng lƣợng khô giữa các nghiệm thức 41 4.2.3. Chiều cao cây Sự khác biệt chiều cao cây giữa các nghiệm thức có ý nghĩa ở mức 0,05. Trong đó chiều cao cây của nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn là cao nhất (89,67mm/cây) và nghiệm thức quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên là thấp nhất (47,00mm/cây). Giữa các nghiệm thức trong từng tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng; ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên, sự khác biệt rất có ý nghĩa. Các nghiệm thức nuôi cấy trong môi trường dị dưỡng và các nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn có chiều cao vượt trội so với các nghiệm thức còn lại. Sự khác biệt về chiều cao cây thể hiện rõ nhất ở yếu tố ánh sáng. Theo quan sát của chúng tôi thì số đốt thân giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt. Tuy nhiên ở các nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn, đốt thân dài ra, thân cây tương đối mảnh và mềm yếu. Việc sử dụng ánh sáng đèn có cường độ ánh sáng yếu làm cho cây vươn dài theo hướng ánh sáng (Bùi Trang Việt, 2000). chiều cao cây (mm/cây) 89.67 50.75 47 61.75 0 50 100 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.8. Sự khác biệt về chiều cao cây giữa các nghiệm thức 4.2.4. Kích thƣớc lá Qua Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt về kích thước lá giữa các nghiệm thức ở mức 0,05. Ở nghiệm thức quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên, kích thước lá lớn nhất (14,58mm/cây) còn ở nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn, kích thước lá nhỏ nhất (9mm/cây). Sự khác biệt về kích thước lá giữa các nghiệm thức trong cùng tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng, giữa ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên là rất có ý nghĩa. Trong đó các nghiệm thức về quang tự dưỡng và ánh sáng tự nhiên tạo ra lá có kích thước lớn nhất. 42 Lá là nơi xảy ra quá trình quang hợp chủ yếu của cây. Dưới tác dụng của ánh sáng lục lạp trong lá biến đổi các chất vô cơ thành các chất hữu cơ, cung cấp cho các hoạt động sống của cây, giúp cây sinh trưởng và phát triển. Vì vậy, kích thước lá hay số lượng lục lạp cũng thể hiện mức độ quang hợp của cây. Ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng sử dụng ánh sáng đèn, cây được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy kín (độ ẩm cao, khí ethylene cao, nồng độ CO2 thấp). Điều đó dẫn đến những bất thường về sinh lý của cây như: lá bị cong, già yếu và rụng (Ried, 1987). Theo Desjardin (1995) khả năng quang hợp của cây in vitro sẽ giảm khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy cao. Vì vậy cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng thường có kích thước lá nhỏ. Ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng cao, nồng độ khí CO2 cao mức độ quang hợp của cây được gia tăng. Kết quả là kích thước lá của cây cũng tăng theo. Cùng với sự gia tăng kích thước lá, là sự hoạt động bình thường của khí khổng và sự dày lên của lớp cutin trên bề mặt lá. Kích thước lá (mm/lá) 9 12.6713.75 14.58 0 5 10 15 20 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.9. Sự khác biệt về kích thƣớc lá giữa các nghiệm thức 4.2.5. Số rễ Số liệu phân tích cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 ở tất cả các nghiệm thức: ở nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng tự nhiên, cây có số rễ trung bình nhiều nhất (17,43 rễ/cây) và nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn, cây có số rễ trung bình ít nhất (8,92 rễ/cây). Giữa các nghiệm thức về tác nhân hình thức nuôi cấy: dị dưỡng và quang tự dưỡng, sự khác biệt không có ý nghĩa. Giữa các nghiệm thức về tác nhân ánh sáng: ánh sáng tự nhiên có số rễ nhiều nhất và có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn. 43 Rễ đóng vai trò hấp thu nước và chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy đưa lên lá, để lá tiến hành quang hợp, tổng hợp nên các chất hữu cơ. Do đó, việc sử dụng ánh sáng tự nhiên cho số rễ nhiều nhất là do hiệu suất quang hợp của cây được gia tăng (do cường độ ánh sáng và khí CO2 cao), dẫn đến việc gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng từ rễ. Vì vậy số lượng rễ nhiều. Số rễ ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng sử dụng ánh sáng tự nhiên cho kết quả nhiều nhất. Theo chúng tôi, ở điều kiện ánh sáng tự nhiên: cường độ ánh sáng cao, nồng độ CO2 cao, sự dao động lớn về nhiệt độ, độ ẩm, cường độ ánh sáng... trong ngày. Mặc dầu cây được nuôi cấy trong bịch nuôi cấy kín, nhưng sự chênh lệch áp suất giữa bên trong và bên ngoài bịch nuôi cấy có thể giúp cho cây lấy một lượng CO2 nhất định từ môi trường bên ngoài. Vì vậy, cây vừa sử dụng đường từ môi trường để tổng hợp chất hữu cơ, vừa sử dụng nguồn CO2 để quang hợp, vừa hoạt động chủ động để thích nghi với yếu tố bên ngoài. Nên số lượng rễ nhiều và kích thước lá tương đối lớn. Ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng ánh sáng đèn và nghiệm thức nuôi cấy quang tự dưỡng ánh sáng đèn cho số rễ ít nhất. Ở điều kiện ánh sáng đèn có cường độ ánh sáng thấp, khả năng quang hợp của cây dị dưỡng kém. Sự tăng trưởng của cây phần lớn chỉ dựa vào lượng đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Cây dị dưỡng phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, sử dụng ánh sáng nhân tạo, các điều kiện vật lý bên ngoài tương đối ổn định và dễ dàng được kiểm soát trong phòng nuôi cây. Vì vậy hoạt động sống của cây ít tiêu tốn năng lượng, nên cây chỉ cần một lượng dinh dưỡng vừa đủ để tồn tại và phát triển. Điều đó phần nào giải thích nguyên nhân kém phát triển của bộ rễ ở cây dị dưỡng ánh sáng đèn. Trái lại ở cây quang tự dưỡng, cây chỉ sử dụng nguồn carbon chủ yếu từ nguồn CO2 ở môi trường bên ngoài (thông qua lỗ thông khí). Tuy nhiên do cường độ ánh sáng và lượng CO2 thấp nên không đủ cung cấp cho nhu cầu quang hợp của cây. Kết luận sơ bộ: Qua kết quả thí nghiệm, cho thấy sự tăng trưởng vượt trội của cây quang tự dưỡng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với việc áp dụng mô hình quang tự dưỡng trong thực tế. Ngoài chất lượng cây cấy mô được gia tăng như đã nêu trên, hình thức nuôi cấy này còn giúp giảm rất nhiều chi phí trong nuôi cấy mô. Qua đó, làm giảm giá thành cây cây mô so với phương pháp dị dưỡng truyền thống. 44 Số rễ 8.92 17.43 10 13.67 0 5 10 15 20 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.10. Sự khác biệt về số rễ giữa các nghiệm thức Hình 4.4. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng lên sự tăng trƣởng của cây in vitro 45 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của giá thể đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Sau 21 ngày nuôi cấy, sự sinh trưởng của cây Cúc trên các giá thể khác nhau, được ghi nhận ở các kết quả sau: Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của giá thể đối với sự phát triển của cây Cúc trong điều kiện quang tự dƣỡng Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/cây) SR ĐC A C D X Đ B V 427.1 A 312.4 C 282.5 D 207.4 E 370.7 B 310.3 CD 114.8 F 182.1 E 26.77 BC 25.67 C 26.08 C 20.50 D 30.50 A 29.67 AB 16.17 E 20.25 D 89.67 A 38.33 DE 39.00 CD 39.35 CD 48.50 BC 50.25 B 28.83 E 37.92 DE 9.00 DE 13.67 AB 13.00 AB 10.83 CD 14.42 A 14.25 A 8.75 E 11.67 BC 8.92 D 8.17 D 11.25 BC 11.00 C 13.75 A 13.29 AB 4.33 E 8.92 D Khác biệt * * * * * * * * * * CV (%) 4.38 % 5.02 % 8.69 % 7.26 % 8.65 % Sự gia tăng trọng lượng tươi và chiều cao cây của nghiệm thức đối chứng (ĐC) tỏ ra vượt trội so với các nghiệm thức còn lại. Đó cũng chính là sự khác biệt giữa hai hệ thống: dị dưỡng ánh sáng đèn và quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên như đã được trình bày ở thí nghiệm 2. Dẫu vậy sự gia tăng trọng lượng khô của nghiệm thức lại rất thấp. Điều đó cho thấy trọng lượng tươi này chủ yếu đến từ khả năng hấp thu nước của cây đối chứng, mà không là sự hấp thụ dinh dưỡng để tổng hợp vật chất hữu cơ. Sự gia tăng trọng lượng khô ở nghiệm thức xơ dừa và đất sạch cao hơn các nghiệm thức khác. Trong đó giá thể xơ dừa có gia tăng trọng lượng khô cao nhất (30,5 mg/cây). Qua Bảng số liệu ở thí nghiệm 2 và 3, chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng giữa gia tăng trọng lượng khô với kích thước lá và số rễ. Sự gia tăng về kích thước lá và số rễ giúp cây tổng hợp được nhiều sinh khối hữu cơ. Kết quả ở Bảng 4.3 cũng cho thấy giá thể là dớn, giấy vệ sinh và giấy báo cho kết quả thấp nhất. 46 Ở giá thể dớn, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy độ pH của môi trường nuôi cấy sau 21 ngày thấp hơn rất nhiều so với độ pH được điều chỉnh ban đầu. Ngoài ra cây có biểu hiện thiếu sắt. Qua đó, chúng tôi có nhận xét: giá thể dớn làm acid hóa môi trường, độ pH quá thấp là nguyên nhân hạn chế sự hấp thu nước và muối khoáng của cây. Ngoài ra trong giá thể dớn có chứa nhiều tanin gây kết tủa sắt. Do đó việc dùng biện pháp xử lý để loại bỏ tanin là rất cần thiết. Ở giá thể giấy vệ sinh và giấy báo, cây phát triển kém. Điều này có thể do cây bị ảnh hưởng của phẩm nhuộm và mực in, có sẵn trên hai loại giá thể rẻ tiền này. Ở giá thể agar và cát, cây phát triển ở mức tương đối. Đối với giá thể cát, sau một thời gian nuôi cấy, độ ẩm trong môi trường nuôi cấy giảm rõ rệt (do cát không có khả năng ngậm nước và giữ nước). Agar là một loại giá thể phổ biến nhất được dùng trong nuôi cấy mô. Những nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới gần đây đã chứng minh vai trò kìm hãm của thạch đối với sự phát triển của cây nuôi cấy mô. Bên cạnh đó chi phí cho việc sử dụng agar là khá lớn (giá hiện nay là 180.000 đồng/kg). Agar còn có độ thông thoáng kém, cản trở sự khuyếch tán các khí hòa tan cũng như sự hấp thu nước và các chất khoáng của cây (Nguyễn Thị Quỳnh, 2002). Kết luận sơ bộ: Qua kết quả phân tích, chúng tôi rút ra kết luận: vật liệu tốt nhất dùng làm giá thể trong nuôi cấy quang tự dưỡng là xơ dừa và đất sạch. Đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Tuy xơ dừa cho kết quả tốt nhất, nhưng trước khi sử dụng phải trải qua giai đoạn xử lý để loại bỏ muối và tanin. Ngoài ra, ở những vùng không có ưu thế phát triển dừa, thì việc tìm kiếm nguồn mạt dừa là rất khó khăn. Vì vậy ở hầu hết các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đất sạch làm giá thể. Thực chất đây cũng là xơ dừa đã qua xử lý ủ hoai và được Công ty dừa Mekong bán rộng rãi trên thị trường hiện nay. 47 Gia tăng trọng lượng tươi 427.1 312.4 282.5 207.4 370.7 310.3 114.8 152.1 0 100 200 300 400 500 ĐC Agar Cát Dớn Xơ dừa Đất sạch Giấy báo Giấy vệ sinh Biểu đồ 4.11. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây in vitro Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây) 26.77 20.5 30.5 29.67 20.25 16.17 26.0825.67 0 10 20 30 40 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.12. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự gia tăng trọng khô của cây in vitro Chiều cao cây (mm/cây) 38.33 39 39.35 50.25 37.92 89.67 48.5 28.83 0 20 40 60 80 100 ĐC A C D X Đ B V 48 Biểu đồ 4.13. Ảnh hƣởng của giá thể đến chiều cao thân của cây in vitro Kích thước lá (mm/lá) 9 13.67 10.83 14.42 14.25 8.75 13 11.67 0 5 10 15 20 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.14. Ảnh hƣởng của giá thể đến kích thƣớc lá của cây in vitro Số rễ 8.92 8.17 11.25 11 13.75 13.29 4.33 8.92 0 5 10 15 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.15. Ảnh hƣởng của giá thể đến số rễ của cây in vitro Số rễ 49 Hình 4.5. Sự tăng trƣởng của cây in vitro ở các giá thể khác nhau 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Sau 21 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây Cúc được thể hiện qua những kết quả dưới đây: 50 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/cây) SR S11 269.3 C 22.43 B 40.00 13.17 B 11.83 B S14 325.3 B 26.03 B 41.75 14.42 AB 15.67 B S20 481.9 A 33.77 A 43.83 15.83 A 20.00 A Khác biệt * * * * NS * * * * CV (%) 1.9 % 9.19 % 5.88 % 3.45 % 8.54 % Qua kết quả thu được ở Bảng 4.4, các chỉ tiêu về gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô, kích thước lá, số rễ có sự khác biệt rất có ý nghĩa. Trong đó nghiệm thức S20 cho kết quả cao nhất, kế đến là S14 và thấp nhất là S11. Ở chỉ tiêu chiều cao cây, cũng cho kết quả tương tự.Tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức chiếu theo chỉ tiêu này. Có thể biện luận như sau: Khi tăng kích cở bịch nuôi cấy, thể tích khí CO2 trong bịch nuôi cấy cũng tăng theo. Do cây được nuôi trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, có cường độ ánh sáng tương đối cao, sự gia tăng thể tích khí CO2 này, cùng với sự hấp thu lượng CO2 từ môi trường bên ngoài, giúp đảm bảo lượng CO2 dồi dào ngay cả trong suốt thời gian chiếu sáng. Do đó, cây phát huy được tối đa khả năng quang hợp. Chính vì vậy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây ở nghiệm thức S20 tỏ ra vượt trội so với các nghiệm thức khác. Kết luận sơ bộ: Kết quả của thí nghiệm này cho thấy có thể sử dụng bịch có kích cở lớn trong nuôi cấy quang tự dưỡng để nâng cao hơn nữa chất lượng cây giống. Ngoài ra, có thể thấy rằng kích cở bịch lớn còn giúp tăng số lượng mẫu nuôi cấy/ bịch, qua đó giảm được công lao động và một số chi phí nguyên vật liệu khác. 51 Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 269.3 325.3 481.9 0 100 200 300 400 500 600 S11 S14 S20 S11 S14 S20 Biểu đồ 4.16. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây Cúc in vitro 2022.43 40 11.83 13.17 26.03 41.75 15.6714.42 33.77 43.83 15.83 0 10 20 30 4 50 GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR S11 S14 S20 Biểu đồ 4.17. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự gia tăng trọng lƣợng khô, chiều cao cây, kích thƣớc lá và số rễ của cây Cúc in vitro 52 Hình 4.6. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự tăng trƣởng của cây in vitro 4.5. Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Kết quả Thí nghiệm 4 đã chứng minh tốc độ sinh trưởng của cây quang tự dưỡng tỷ lệ thuận với kích cở bịch nuôi cấy. Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy mô hình nuôi cấy quang tự dưỡng chỉ thật sự có hiệu quả tối ưu ở giai đoạn đưa cây ra vườn ươm hoặc ngoài đồng ruộng. Bên cạnh đó, sự vô trùng chỉ có ý nghĩa tương đối. Với mục đích sản xuất một số lượng lớn cây giống với tốc độ nhanh, có giá thành rẻ mà vẫn đảm bảo được chất lượng cây giống. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm này, kết quả được trình bày trong Bảng 4.5. 53 Bảng 4.5. Các chỉ tiêu tăng trƣởng của cây in vitro trong thí nghiệm nhân giống đại trà Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR ĐC 1 ĐC 2 P0-0 P1-10 P1-15 P2-10 P2-15 224,7 C 147,8 C 172,2 C 354,2 B 333,9 B 453,5 A 454,2 A 69,07 A 34,6 C 35,43 BC 40,07 BC 38,17 BC 40,93 B 40,47 B 8,4 D 13,7 BC 12,57 C 14.27 ABC 14,77 AB 15,73 A 15,97 A 9,87 C 7,13 D 7,23 D 11,0 C 11,47 BC 13,27 AB 14,37 A Khác biệt * * * * * * * * CV (%) 10,77 % 5,5 % 5,19 % 7,22 % Kết quả nhận được cho thấy, ở nghiệm thức cây dị dưỡng trong túi nylon 12cm x 18cm (ĐC 1) cho kết quả chiều cao cây cao nhất (69,07mm/cây) và kích thước lá nhỏ nhất (8,4mm/lá). Kết quả này đã được lý giải ở thí nghiệm 2. Ở nghiệm thức cây vỉ xốp có 2 lỗ thông khí – kích thước lỗ 15cm x 3cm (P2-15) cho gia tăng trọng lượng tươi (454,2 mg/cây), kích thước lá (15,97mm/lá) và số rễ (14,37 rễ/cây) cao nhất. Các chỉ tiêu này có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức ĐC 1, ĐC 2, và cây vỉ xốp 0 lỗ thông khí (P0-0). Điều đó chứng tỏ kích cở bịch và kích thước lỗ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây. Việc sử dụng kích cở bịch lớn giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt. Điều này đã được ghi nhận ở thí nghiệm 4. Trong thí nghiệm 1 chúng tôi đã chứng minh về sự ảnh hưởng của sự thông khí đối với sự sinh trưởng của cây quang tự dưỡng. Cây quang tự dưỡng sống trong tình trạng không có sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài, hoặc có sự trao đổi khí quá mức sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý bình thường của cây. Trong thí nghiệm này cây vỉ xốp được nuôi cấy trong điều kiện bán vô trùng và được tưới nước bổ sung 10 ngày/lần. Vì vậy nghiệm thức P2-15 có kích thước lỗ lớn nhất nhưng sự tăng trưởng của cây vẫn cho kết quả tốt nhất. 54 Ở nghiệm thức cây quang tự dưỡng trong túi nylon, kích cở 12cm x 18cm (ĐC 2) cho gia tăng trọng lượng tươi (147,8 mg/cây), chiều cao cây (34,6mm/cây) và số rễ (7,13 rễ/cây) thấp nhất. Điều này được lý giải như sau: ở nghiệm thức ĐC 2 cây chủ yếu sử dụng nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để quang hợp. Do kích cở bịch nhỏ (lượng CO2 dự trữ trong bịch thấp), cây được cấy với mật độ dày (10 cây/bịch), không gian nuôi cấy bị hạn chế nên có sự cạnh tranh dinh dưỡng và lượng CO2. Qua đó phần nào ức chế sự sinh trưởng của cây. Ngoài ra, cây được nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, nên sự sinh trưởng của cây phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh bên ngoài. Thí nghiệm này được thực hiện vào thời điểm diễn ra mưa nhiều. Do vậy, cường độ ánh sáng tương đối thấp hơn so với các thí nghiệm trước. Nên phần nào hạn chế sự quang hợp và sinh trưởng của cây. Kết quả là cây có sự gia tăng trọng lượng tươi và số rễ thấp nhất. Kết luận sơ bộ: Trong thí nghiệm sử dụng vỉ xốp đậy lồng nylon để sản xuất giống Cúc đại trà. Lồng nylon có 2 lỗ, mỗi lỗ dán 2 lớp giấy báo, kích thước mỗi lỗ 15cm x 3cm là thích hợp nhất. Việc sử dụng lồng nylon trong nhân giống Cúc góp phần giảm bớt các chi phí trong phòng thí nghiệm. Cây nuôi quang tự dưỡng ở thí nghiệm này vẫn duy trì được tình trạng non trẻ hơn so với cây đưa thẳng ra đất. Do đó hệ số nhân của cây nuôi cấy ở hệ thống trên sẽ cao hơn rất nhiều lần so với cây đưa ra ngoài vườn ươm. Ngoài ra cây được nuôi cấy ở từng lỗ riêng biệt nên không có sự cạnh tranh dinh dưỡng. Các cây này khi đưa ra vườn ươm, bộ rễ không bị tổn hại do vẫn còn được giữ nguyên bộ rễ. Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 224.7 147.8 172.2 354.2 333.9 453.5 454.2 0 100 200 300 400 500 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.18. Chỉ tiêu gia tăng trọng lƣợng tƣơi trong mô hình nhân giống Cúc đại trà 55 Chiều cao cây (mm/cây) 69.07 34.6 35.43 40.07 38.17 40.93 40.47 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.19. Chỉ tiêu chiều cao cây trong mô hình nhân giống Cúc đại trà Kích thước lá (mm/lá) 8.4 13.7 12.57 14.27 14.77 15.73 15.97 0 5 10 15 20 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.20. Chỉ tiêu kích thƣớc lá trong mô hình nhân giống Cúc đại trà Số rễ 9.87 7.53 7.23 11 11.47 13. 7 14.37 0 5 10 15 20 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.21. Chỉ tiêu số rễ trong mô hình nhân giống Cúc đại trà 56 Hình 4.7. mô hình nuôi cấy quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Hình 4.8. Cây quang tự dƣỡng vỉ xốp đƣợc bao bằng lồng nylon, có 2 lỗ thông khí, mỗi lỗ có kích thƣớc 15cm x 3cm, đƣợc dán bởi 2 lớp giấy báo Hình 4.9. Cây quang tự dƣỡng vỉ xốp đƣợc bao bằng lồng nylon 0 có lỗ thông khí 57 Hình 4.10. Cây dị dƣỡng và quang tự dƣỡng nuôi cấy trong túi nylon Hình 4.11. Cây ở các nghiệm thức khác nhau trong thí nghiệm Hình 4.12. cây quang tự dƣỡng từ vỉ xốp còn giữ nguyên bộ rễ khi đƣa ra vƣờn ƣơm 58 4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đối với sự phát triển của cây hoa Cúc ở giai đoạn vƣờn ƣơm Sau 20 ngày tại vườn ươm, kết quả về sự sinh trưởng của cây ở hai hệ thống dị dưỡng và quang tự dưỡng được thể hiện như sau: Bảng 4.6. ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đối với sự phát triển của cây hoa Cúc ở giai đoạn vƣờn ƣơm Nghiệm thức TLS (%) GTTLT (mg/cây) GTCCC (mm/cây) KTL (mm/lá) DD QTD 92,5 100 784,01 B 1629,95 A 20,84 B 37,18 A 21,06 B 35,13 A Khác biệt NS * * * * * * CV (%) 7,03 % 15,49 % 14,9 % 10,16 % Qua kết quả Bảng 4.6 cho thấy: Tỷ lệ sống của cây có nguồn gốc quang tự dưỡng (QTD) đạt 100 %, trong khi tỷ lệ sống ở cây có nguồn gốc dị dưỡng (DD) chỉ đạt 92,5 %. Tỷ lệ sống của cây dị dưỡng kém là do ở giai đoạn in vitro, cây dị dưỡng có những bất thường về sinh lý như hiện tượng thủy tinh thể, cây thụ động trong quá trình quang hợp, kích thước lá nhỏ, lớp cutin trên bề mặt lá bị giới hạn, khí khổng hoạt động bất bình thường. Sự ghi nhận này cũng đã được trình bày ở thí nghiệm 2. Kết quả là cây bị mất nước nhanh chóng khi chuyển ra giai đoạn ex vitro. Tỷ lệ sống của cây dị dưỡng kém hơn cây quang tự dưỡng đã được chứng minh trên cây cà phê, hông, neem… (Nguyễn Thị Quỳnh, 2005), dâu tây (Fujiwara và cộng sự, 1988), khoai tây, khoai lang (Heo và Kozai, 1999). Cây có nguồn gốc quang tự dưỡng cho các chỉ tiêu tăng trưởng tốt hơn cây có nguồn gốc dị dưỡng. Sự gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng chiều cao cây và kích thước lá của cây có nguồn gốc quang tự dưỡng đều lớn hơn cây có nguồn gốc dị dưỡng. Ở giai đoạn in vitro, chiều cao cây ở cây dị dưỡng tỏ ra vượt trội so với cây quang tự dưỡng. Trái lại, ở giai đoạn ex vitro, cây quang tự dưỡng có sự gia tăng chiều cao cây lớn hơn rất nhiều so với cây dị dưỡng. Sự gia tăng chiều cao cây, trọng lượng tươi và số rễ nói lên mức độ sinh trưởng, phát triển của cây, khả năng hấp thu, tích lũy vật chất, vận chuyển dinh dưỡng cũng như khả năng hấp thụ ánh sáng để quang hợp. Kết 59 quả trên chứng tỏ cây dị dưỡng phải trải qua quá trình thích nghi kéo dài hơn so với cây quang tự dưỡng  Kết luận sơ