Luận văn Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên lúa

) lên 1.627.000 tấn (năm 2010) ( org/vietnam/fertilizer.html). III. Sự cố định đạm sinh học. Trung tâm Học KlihệíuquĐyểHn làCnầgunồnTdhựơtrữ@đạmTàNi2 lriệấtulớhn,ọtrcontgậkphovảàng nkhgôhngiêknhí cứu bên trên mỗi km2 đất đai có khoảng 8 triệu tấn nitơ. Tuy nhiên, loại nitơ này cây + trồng không thể hấp thu được trực tiếp mà phải được vi sinh vật biến đổi thành NO3− hoặc khử thành NH4 . Một số loài vi sinh vật có thể khử N2 thành NH3 và được gọi là sự cố định đạm sinh học (Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Sự cố định đạm sinh học có thể đạt được 175 triệu tấn mỗi năm ( microbiologyprocedure.com/nitrogen-fixation/biological-nitrogen-fixation.htm). Trong tự nhiên sự cố định đạm sinh học đã đóng góp một lượng lớn (khoảng 30 kg đạm/ha/vụ) cho cây trồng hấp thu khi mà phân đạm hóa học chỉ được cây trồng sử dụng 30 - 40% (Boddy and Dobereiner, 1984). Sự cố định đạm sinh học phụ thuộc vào hoạt động của enzyme nitrogenase được xúc tác bởi năng lượng. Để thực hiện phản ứng này cần cung cấp 17 ATP và enzyme nitrogenase để phá vỡ liên kết ba của phân tử nitơ. Nitrogenase là một phức hợp enzyme, chúng cấu tạo bởi 2 thành phần là protein sắt và protein sắt - molybden. Nitrogenase không chỉ xúc tác việc khử N2 thành NH3 mà còn có thể xúc tác việc khử C2H2, , HCN,…thành các sản phẩm tương ứng như: C2H4, CH3NH2… (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997). Theo Evans và Barber (1977) thì quá trình cố định đạm xảy ra như sau: Nitrogenase N2 + H2 + 6e NH3 NH3 được tạo thành sẽ kết hợp với acid hữu cơ tạo thành protein: NH3 + Acid hữu cơ Acid amino Protein Chính vì vậy mà vai trò của sự cố đinh đạm sinh học có một ý nghĩa hết sức quan trọng đối với nông nghiệp, nhất là đối với các nước có nền công nghiệp sản xuất phân hóa học chưa phát triển mà Việt Nam là một ví dụ điển hình. Trong tương lai, khả năng cố định đạm trong cây không phải họ đậu có thể làm giảm và thậm chí là loại bỏ hẳn sự cần thiết sử dụng phân bón vô cơ trong nông nghiệp, đồng thời cũng có thể cải thiện được năng suất của mùa màng khi sự cộng sinh cung cấp nguồn đạm liên tục cho cây trồng ( Trung tâcmom.Hvnọ)c.  liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu IV. Vai trò của Azospirillum trong nông nghiệp. 1. Sơ lược về vi khuẩn Azospirillum Năm 1974 lần đầu tiên người ta phân lập được một loài xoắn khuẩn sống trên rễ một số cây cỏ nhiệt đới và đặt tên là Spirillum lipoferum (Döbereiner và cộng tác viên (ctv), 1987). Về sau căn cứ vào tỷ lệ các base trong ADN người ta xác định chúng thuộc về một giống mới, được đặt tên là Azospirillum (Döbereiner và ctv, 1995). Azospirillum có số lượng khá lớn ở vùng rễ và trong lớp tổ chức ở bề mặt rễ (khoảng 106-107 tế bào/gram rễ khô) (Nguyễn Mỹ Nhung 2007). Từ đó đến nay, người ta đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn Azospirillum. Vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố định đạm tự do hoặc kết hợp với vùng rễ của cây họ hòa bản, đặc biệt vùng rễ của cây cỏ nhiệt đới , lúa nước, mía, ngô, lúa mì (Boddy và ctv, 1995). Saleeana và ctv (2002) đã tìm ra những loài vi khuẩn thuộc giống Azospirillum trong rễ lúa trồng ở Tamil Nadu, Ấn Độ. Ngoài ra, Nguyễn Hữu Hiệp và ctv (2005) cũng tìm ra dòng vi khuẩn Azospirillum cố định đạm cộng sinh với cây không thuộc họ đậu. Vi khuẩn Azospirillum là vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây. Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, các loại cây cỏ và cây có củ (Döbereiner và ctv, 1995). Azospirillum lipoferum là một trong bảy loài vi khuẩn đã được phát hiện: Azospirillum lipoferum, Azospirillum brasilense (Tarrand và ctv, 1978); Azospirillum amazonese (Magalhaes và ctv, 1983); Azospirillum halopraeferrans (Reinhold và ctv, 1987); Azospirillum irkense (Khanmas và ctv, 1989); hai loài còn lại là Azospirillum doebereinerae và Azospirillum largomobile được Dekhil và ctv tìm ra năm 1997. Chúng có những đặc điểm chung như: là vi khuẩn Gram âm, hình que cong hay hình chữ S, chiều rộng 1,0 - 1,5µm, sinh trưởng tốt ở 300C và pH từ 6,0 - 7,0 (Bashan và ctv, 2004). Azospirillum có thể chuyển động được trong môi trường lỏng nhờ có những chiên mao dài ở một đầu (polar Trung tâfmlageHlluọmc) tlếiệbàuo Đ(ĐHào TChầannh HTohànơg, @2005T).ài liệu học tập và nghiên cứu Vi khuẩn thuộc loài Azospirillum lipoferum sinh trưởng dưới 2 điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Tuy nhiên, chúng phát triển thích hợp và tối ưu nhất ở điều kiện vi hiếu khí với sự có mặt hoặc không của đạm trong môi trường (Döbereiner và Pedrosa, 1987). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của những vi khuẩn này là 35 - 370C. Khuẩn lạc của chúng phát triển trên môi trường agar - khoai tây có màu hồng nhạt hay đậm. Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng thực vật như IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (Abscisic acid) và Cytokynin (Bashan và Levanony, 1990). Sự sản xuất hormone thực vật của vi khuẩn Azospirillum đã làm tăng chiều dài rễ, tăng hấp thu khoáng, từ đó giúp tăng khả năng sinh trưởng của cây (Okon và Kapulnik, 1986), giúp cây chống chịu khô hạn. Ứng dụng Azospirillum có thể giảm được khoảng 30% lượng phân bón trong nông nghiệp ( /2002/04/04/stories/2002040400120400.htm) Để phát hiện loài vi khuẩn Azospirillum lipoferum, người ta dùng cặp mồi chuyên biệt dựa trên trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên website ngân hàng gen để nhận diện chúng ( nih.gov/Genbank/index.html). 2. Các nghiên cứu về sự cố định đạm sinh học của Azospirillum. Thí ngiệm về tác động của các dòng Azospirillum lên năng suất cây trồng đã được tiến hành ở nhiều loài cây và các nơi trên thế giới. Năng suất mùa vụ đã tăng từ 3 - 54% khi được chủng Azospirillum là kết quả của 18 thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại Ý (Favilli và ctv, 1987). Ngoài ra Azospirillum còn làm tăng sản lượng lúa mì ở Mexico từ 23 - 26% (Paceres và ctv, 1988), ở Argentina 13 - 30 % (Rodriguez - Caceres, 1982). Thí nghiệm ngoài đồng trên lúa Miến cho thấy khi có chủng giống Azospirillum brasilense vào hạt lúa Miến (107CFU/hạt) làm gia tăng năng suất từ 10 - 15% (Okon và ctv, 1994). Ủ hạt với vi khuẩn cho kết quả tốt hơn khi ủ với phân bón hóa học. Ủ Trung tâhmột lHúaọmcạlcihệuvớiĐAHzosCpiầrilnlumThliêơn @tục kThàoảinlgiệ3unhămọctạitậICpRIvSàATngchhoiêthnấy cứu chúng cố định được 26kg đạm/ha so với không ủ và lượng NPK chứa trong cây tăng 80 - 90% (Fages và ctv, 1994). Theo dữ liệu của thế giới ở thập kỷ qua, khi ủ thử nghiệm hột giống với Azospirillum hoặc kết hợp với vi khuẩn cố định đạm khác dẫn đến kết quả là vi khuẩn có khả năng gia tăng sản lượng nông nghiệp trên những loại đất và khu vực khác nhau (Sumner và ctv, 1990; Fages và ctv, 1994). Điều này được giải thích như sau: khi ủ hạt giống với vi khuẩn với Azospirillum không chỉ giúp cố định đạm trong vùng rễ mà còn làm cho hệ thống rễ phát triển nhiều hơn, gia tăng diện tích tiếp xúc của rễ với đất nhờ đó mang lại hiệu quả cao trong sự thẩm thấu nước và chất dinh dưỡng, giúp tăng năng suất cây trồng (Bashan và Holguin, 1997; Boddey và ctv, 1986). v Một số nghiên cứu về Azospirillum tại Việt Nam Theo Nguyễn Thái Huy (1999), sử dụng phân đạm vi sinh (nhóm Azospirillum, loài Pseudomonas, Enterobacter...) cho thấy lúa có thể tăng năng suất 10 - 15%, tiết kiệm được 30 - 40 kg đạm/ha. Tại Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, ở bộ môn Vi sinh vật học, thí nghiệm về xử lý mầm mạ với chế phẩm Azospirillum cho thấy mạ cứng chắc và lớn hơn, chống chịu rét tốt hơn nếu mạ gặp rét đậm kéo dài (dưới 100C). Lúa chín sớm hơn từ 3 - 5 ngày so với cây lúa không xử lý với chế phẩm Azospirillum (Nguyễn Bảo Vệ, 2004). Theo Phạm Thị Ngọc Lan và Lý Kim Bảng (2004), số lượng vi khuẩn cố định đạm trong mẫu đất phân lập (trong đó có Azospirillum) đạt từ 414,0 - 428,3 CFU/g đất khô tuyệt đối và khi xử lý hạt của giống lúa Khang Dân với nồng độ vi khuẩn 105, 106, 107 tế bào/ml, các chỉ tiêu nảy mầm, chiều dài rễ và thân mầm đều tăng so với đối chứng, ngoại trừ chỉ tiêu của rễ mầm ở nồng độ 107 tế bào/ml. Nguyễn Khắc Minh Loan và Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum trên cây lúa. Riêng Đào Thanh Hoàng (2005) đã phân lập được 28 dòng vi khuẩn cố định đạm từ lúa trồng, lúa hoang hay cỏ dại và đã xác định 3 dòng A16, A28 và A31 là Trung tâAmzosHpirọilclumliệliupofĐerHumCcóầnnguTồnhơgốc@từ Tthâàni, lriễệluúahtrọồncg t(ậlúpa cvaào snảng)hviàêlnúa cứu hoang. Tác giả cho rằng nồng độ acid malic, nguồn carbon chính cho Azospirillum trong môi trường NFb, thích hợp nhất là 4g/lít. Các kết quả thí nghiệm trên cho thấy loài Azospirillum lipoferum phân bố rộng và chúng có những đóng góp lớn trong việc tăng năng suất cây trồng, thay thế phần nào lượng phân hóa học bón cho cây, cải tạo đất đai và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. V. Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử. 1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng tác viên phát minh năm 1985. Kỹ thuật này dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần mồi, là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung vào mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước: - Bước 1: Biến tính (denaturation). Phân tử ADN được tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 94 - 950C trong vòng 1 phút. - Bước 2: Bắt cặp (anealing). Nhiệt độ được hạ thấp 490C cho phép mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn này kéo dài 1 phút. - Bước 3: Kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho ADN polymerase tổng hợp ADN, giai đoạn này kéo dài 1 phút. Các ADN mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n (với n là số chu kỳ nhiệt). Sản phẩm PCR sau đó sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê, 2006). 2. Điện di agarose gel. Điện di là một quá trình mà các phân tử mang điện tích được tách ra trong một điện trường do khả năng di chuyển khác nhau của các phân tử. Đây là Trung tâpmhươHngọpchálpiệthuônĐg HdụnCg dầùnngTđhể tơách@rờiTcáàciđloiệạnuachidọncuctlậeipc cvó àkícnhgthhưiớêcntừ cứu 200bp đến 50kb (Võ Công Thành, 2004; Trần Thị Xuân Mai, 2005). Trong điện di, người ta thường sử dụng thang ADN chuẩn (ADN ladder). Đó là hỗn hợp nhiều đoạn ADN có kích thước đã biết khi cho điện di cùng lúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn ADN của mẫu. Kỹ thuật điện di trên gel sẽ tách các phân tử ADN tùy theo kích thước của chúng ( topic&p=7). Vận tốc và sự phân ly ADN phụ thuộc vào một số yếu tố sau: kích thước phân tử ADN, nồng độ gel agarose, kiến trúc ADN, cường độ điện trường, chiều của điện trường, … (Trần Thị Xuân Mai, 2005). PHẦN III - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP I. Địa điểm và thời gian. 1. Địa điểm. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật, Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ. 2. Thời gian. Từ tháng 02/2008 đến 06/2008. II. Vật liệu thí nghiệm. - Lúa hoang (hình 1): mẫu được thu tại 2 địa điểm: Khoa Nông Nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ, đường Huỳnh Thúc Kháng - Thành Phố Cần Thơ. Lông gai Hình 1: Lúa hoang ( Oryza rufipogon Griff.) - Lúa trồng: + Giống lúa: Hàm Châu, Châu Hạng Võ, Miền Tây Lúa, Cửu Long 8 và IR 504 - 04. + Mẫu được thu tại một số địa điểm: Trà Vinh, Vĩnh Long, Hậu Giang và thành phố Cần Thơ. III. Phương tiện. 1. Phương tiện để phân lập vi khuẩn. - Cối chày, chai khử trùng mẫu, eppendorf 1,5 ml. - Bình tam giác, đĩa Petri đường kính 10 cm. - Máy khuấy (vortex), máy sấy, cốc. - Kính hiển vi Olympus, tủ ủ Incucell. - Tủ cấy vô trùng, que cấy, tủ lạnh, cân điện tử - Ống nghiệm nắp đen 15 ml - Nồi khử trùng nhiệt ướt, máy đo pH -Xẻng (dùng để đào lúa), kéo, bọc nilon, đèn cồn - Lò vi sóng Panasonic, đũa thủy tinh. 2. Phương tiện trích ADN, thực hiện phản ứng PCR, điện di. - Micropipet Bio - Rad, - Eppendorf 1,5 ml và 2,0 ml - Bộ chạy điện di Embi - Tec - Máy PCR Bio - Rad - Máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000 - Tuýp chạy PCR 200 l - Lò vi sóng Panasonic - Máy lắc (vortex), water bath. IV. Hóa chất. Trung tâm H1.ọHcóaliệchuấtĐđểHphCânầlnậpTvihkơhu@ẩn. Tài liệu học tập và nghiên cứu - Nước cất vô trùng - Tween 20 (1:20) - Cồn 700C - Môi trường NFb (môi trường bán đặc và đặc) Công thức môi trường NFb đặc (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997). - Acid malic 5 - K2HPO4 0,5 - MgSO4.7H20 0,2 - NaCl 0,1 - CaCl2 0,02 - KOH 4,5 - Dung dịch vi lượng 2ml - Dung dịch vitamine 1ml - Dung dịch FeEDTA 1,64% 4ml - Bromothymol blue 0,5% trong KOH 0,2M 2ml - pH 6,8 - Agar 18g (môi trường đặc ) - Agar 1,9g (môi trường bán đặc ) Dung dịch vi lượng: Na2MoO4.2H2O 1 MnSO4.H2O 1,5 H2BO3 1,4 CuSO4 0,4 ZnSO4.H2O 0,12 Thêm nước cất cho đủ 1000ml Dung dịch vitamine Biotin 10mg Pyridoxyl - HCl 20mg Thêm nước cất cho đủ 100ml - Trường hợp trữ ống thêm vào công thức môi trường trên Trung tâm Học liệu ĐHKNCOầ3 n Thơ @ Tài liệ50umlh/lọc tập và nghiên cứu Dịch trích nấm men 5g/l 2. Hóa chất nhuộm Gram. - Crystal violet, iod - Fushin, ethanol - Nước cất 3. Hóa chất trích ADN. - Ethanol 70% - Eppendorf 1,5ml và 2ml - Micropipet - Tăm tre đầu nhọn - Môi trường LB (Lauria Betan) Công thức môi trường LB (Lauria Betan) (g/l) Trypton 10 Dịch trích nấm men 5g NaCl 10 Agar 20 4. Hóa chất thực hiện phản ứng PCR. - Nước cất 2 lần đã khử trùng - Eppendorf 200 l - PCR buffer - Mồi dùng nhận diện Azospirillum lipoferum: + Mồi xuôi: 5’- GTA AAT CCA CCA CCT CCC - 3’ + Mồi ngược: 5’- TGT AGA TTT CCT GGG CCT - 3’ (Cặp mồi chuyên biệt để nhận diện Azospirillum lipoferum được Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Cần Thơ thiết kế dựa theo trình tự gen nifH của vi khuẩn Azospirillum được công bố trên website htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). - dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) - Taq polymerase Trung tâm Học- lAiệDuN Đvi HkhuCẩnần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 5. Hóa chất điện di. - Agarose - TAE buffer 1X - Ethidium bromide (EtBr) - Thang chuẩn /pstI - Loading buffer Fer - Nước cất 2 lần đã khử trùng V. Phương pháp. 1. Phân lập vi khuẩn Azospirillum. a). Thu mẫu. - Các mẫu lúa được thu lấy từ bờ ruộng hay ven kênh và rạch. - Dùng xẻng đào đất xung quanh bụi lúa để có thể thu được toàn bộ cây lúa. Sau đó cho vào bao nylon và được mang về phòng thí nghiệm vi sinh vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn Azospirillum. b). Xử lý mẫu và phân lập. - Rửa sạch đất bám quanh thân và rễ lúa. - Tách rời thân và rễ lúa - Thân (lúa hoang): lột bỏ lớp bao bên ngoài thân lúa, cắt thành từng đoạn 5cm và để ráo nước. - Rễ lúa: rửa thật sạch đất quanh rễ, rửa lại 2 lần với nước cất, sau đó cắt thành từng đoạn 2 - 3cm - Tiến hành khử trùng bề mặt mẫu thân và rễ lúa với Tween 20 (1:20) trong 10 phút, sau đó khử trùng bằng cồn 700 trong 5 phút, rửa mẫu lại bằng nước cất 1 lần 5 - 6 lần đến khi sạch bọt thì ta tiến hành giã mẫu. - Mẫu được giã nhuyễn trong cối, sau đó cho 1ml nước cất vô trùng vào mẫu và trộn đều. - Hút 200µl phần trong cho vào 800µl nước cất đựng sẵn trong eppendorf (đã pha loãng 5 lần), đem Vortex . Tiến hành pha loãng 10 lần, 100 lần,…nếu cần thiết. Trung tâm Học- lHiệúut 1Đ0µHl dCịchầmnẫuTđhãơph@a loTãnàgiclhioệuvàohọmcôi ttrậưpờngvàNFnbgbhániêđnặc cứu trong ống nghiệm, đậy nắp lại cho vào tủ ủ và ủ ở 310 C. - Sau 2 - 3 ngày, ta thấy xuất hiện vòng màu trắng (vòng pellicle), cách bề mặt môi trường 2 - 5mm, làm cho môi trường xanh lá dần chuyển sang màu xanh dương. Đó là dấu hiệu của sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum. - Hơ nóng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn, chấm đầu kim cấy vào ống lấy vi khuẩn từ vòng pellicle cấy lên đĩa petri có môi trường NFb đặc theo đường zigzag hay chữ chi và ủ trong tủ ủ ở 310 C. - Sau 2 - 3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, tròn và phải nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển. Tiếp tục phân lập nhiều lần trên môi trường NFb đặc. - Sau vài lần cấy chuyển, chọn lọc những khuẩn lạc rời trên môi trường đĩa, trữ lại trên môi trường ống NFb như là một dòng, sau đó kiểm tra các dòng vi khuẩn này dưới kính hiển vi để xem ròng hay không. Nếu chưa ròng ta phải cấy chuyển lại đĩa và tiếp tục phân lập cho đến khi ròng. Sau 2-3 ngày Vòng pellicle  Vòng pellicle Vòng pellicle Sau 2-3 ngày Hình 2: Qui trình phân lập Azospirillum trên lúa. 2. Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn. Trung tâm HTiọếnchlàiệnhuquĐanHsáCt cầhnuyểTnhđơộng@củaTAàzioslipệiruilluhmọbcằntgậpphưvơàngnpghhápiêginọt cứu ép dưới kính hiển vi ở vật kính X40 (độ phóng đại 400 lần) như sau: - Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên kính mang vật. - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội.  - Dùng đầu kim cấy lấy một ít vi sinh vật rồi chấm vào giọt nước cất trên kính mang vật (trong điều kiện vô trùng). - Lấy kính đậy vật đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 450, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật. - Quan sát dưới kính hiển vi để thấy chuyển động. 3. Nhuộm Gram Phương pháp nhuộm được tiến hành theo các bước sau a). Chuẩn bị mẫu vật - Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên giữa kính mang vật. - Áp dụng thủ thuật vô trùng lấy một ít vi sinh vật cho vào giọt nước, trải ra cho đều và thật mỏng theo hình xoắn ốc. - Lướt mặt dưới của kính mang vật trên ngọn lửa đèn cồn cách khoảng 10cm từ độ 3 lần để giết chết vi sinh vật và dán chúng lên kính mang vật. b). Nhuộm Gram - Nhỏ 1 hay 2 giọt Crystal violet phủ nơi cố định mẫu, để 2 phút. - Rửa từ 2 - 3 giây (tránh làm trôi mẫu), chậm nhẹ cho khô bớt nước. - Nhỏ dung dịch Iot trong 60 giây. - Rửa nước, chậm nhẹ. - Rửa cồn + aceton thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính, rửa đến khi giọt cồn + aceton không còn màu tím nữa. - Rửa nước vài giây, chậm nhẹ. - Nhỏ Fushin hay Safranin từ 1 - 2 giọt để trong 60 giây. - Rửa nước vài giây. - Dùng giấy thấm chậm nhẹ hay hơ cho khô bớt nước trên ngọn lửa Trung tâđmèn cHồnọ. c liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu - Quan sát dưới kính hiển vi. 4. Đo kích thước tế bào vi khuẩn. Quan sát hình dạng và đo kích thước tế bào vi khuẩn Azospirillum dưới kính hiển vi ở vật kính X40. a). Mô tả thước đo - Thước trắc vi thị kính là một miếng kính hình tròn có khắc 100 vạch giữa 2 thấu kính của thị kính. - Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài 2mm chia thành 200 khoảng. Khoảng giữa mỗi khoảng là 10µm. b). Phương pháp đo - Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy ảnh rõ của thước. - Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính và 1 vạch thứ 2 nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính. - Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Ta có trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính (x) theo công thức: x = Trong đó:  N *10µm n + N là số khoảng của thước trắc vi vật kính, N = 6 + n là số khoảng của thước trắc vi thị kính, n = 35 Như vậy : x =  6 *10µm 35 - Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển vi mẫu thế nào cho một đầu của mẫu đo trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm 1 vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo. Đếm số khoảng trắc vi nằm trong 2 vạch này. Suy ra kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng nhân với trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính. Trung tâm H5.ọTcrílcihệnuhaĐnhHACDNầntừ Tvihkơhuẩ@n ATzoàspiirliiệlluumh. ọc tập và nghiên cứu - Cấy vi khuẩn Azospirillum trên môi trường LB đặc. - Sau 1 ngày cấy, dùng đầu nhọn của tăm tre lấy khuẩn lạc rời, nhỏ, non hòa tan với 25µl nước cất 2 lần trong eppendorf 1,5ml. - Trộn đều dung dịch trên máy Vortex. - Ủ ở 950C trong 10 phút (ủ trong water bath). - Lập tức ngâm đá nhanh trong 3 phút. - Đem trữ ở -200C nếu chưa tiến hành qui trình PCR. 6. Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). a). Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25µl/ phản ứng). Nước cất 2 lần 10,75 Buffer Fer 2,5 dNTPs 4 MgCl2 3 P1 (mồi ngược) 1 P2 (mồi xuôi) 1 0,1% BSA 0,25 Taq polymerase Fer 0,5 ADN 2 b). Qui trình PCR. - Biến tính ADN ở 950C trong 5 phút. - Tiếp theo là 30 chu kỳ được gia nhiệt như sau: + 950C trong 1 phút + 490C trong 1 phút + 720C trong 1 phút - Bước cuối cùng là 720C trong 10 phút. - Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -200C để chạy điện di. c). Điện di Sản phẩn ADN sau khi trích, được tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật Trung tâPmCRH, sọaucđlóiệkuiểmĐtHra CbằnầgnphTưhơnơg @phápTđàiệinlidệi utrêhn ọgcel taậgaprovseà1%ngchó icêhnứa cứu ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di được chụp bằng máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000 (Hoa Kỳ). - Chuẩn bị gel nhỏ: ( 20ml) + Agarose (1%): 0,2g +TAE buffer (1X): 20ml - Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave). - Sau khi nấu để nguội khoảng 500 - 600C, bổ sung EtBr: 0,4µl - Rót gel vào khuôn. - Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu. - Load mẫu: dùng Micropipet hút 10µl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10µl mẫu ADN vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng. - Chạy điện di 60 phút ở 90V. - Chụp hình gel bằng máy chụp hình gel Bio - Rad. PHẦN IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum 1. Nguồn gốc cây chủ, thời gian tăng trưởng và đặc điểm môi trường nuôi cấy các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập được. Sau khi chuyển 10µl dịch trích vào ống nghiệm có chứa môi trường NFb bán đặc, được ủ trong tủ ở 300C từ hai đến ba ngày (tùy từng dòng), các dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ (lúa hoang, lúa trồng) và thân lúa hoang đều sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Sự phát triển này tạo thành một vòng pellicle trắng đục bên dưới môi trường ống NFb bán đặc khoảng 2,0 - 5,0mm (hình 3), lớp màng này đặc trưng cho sự phát triển của vi khuẩn. Những đặc điểm này phù hợp với mô tả trong những nghiên cứu trước đây của Rodriguez và ctv (1982), Hiệp và ctv (2005), Nguyễn Khắc Minh Loan (2005), Đào Thanh Hoàng (2005). Vòng pellicle Hình 3: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum tạo dòng pellicle cách mặt môi trường NFb bán đặc 2-5mm và làm thay đổi màu môi trường Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum trong môi trường NFb bán đặc với chất chỉ thị màu là bromothymol blue (pH = 6,8), làm môi trường màu xanh lá dần chuyển sang màu xanh dương sau 2 - 3 ngày nuôi cấy. Độ nhạt hay đậm tùy thuộc vào sự phát triển của từng dòng. Sau 3 ngày nuôi cấy thì môi trường sẽ đổi hoàn toàn sang xanh dương. Trong môi trường NFb đặc để phân lập, sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum cũng làm thay đổi pH của môi trường (pH ban đầu trung tính, sau đó trở nên kiềm hơn), màu môi trường cũng chuyển từ xanh nhạt sang xanh dương và tùy thuộc vào từng dòng sau 2 đến 3 ngày (hình 4). Kết quả, chúng tôi thu được 44 dòng vi khuẩn Azospirillum, ký hiệu AT (Azospirillum được phân lập từ thân lúa hoang) và AR (Azospirillum được phân lập từ rễ lúa hoang và lúa trồng) (bảng 1). Các dòng vi khuẩn này được trữ trong môi trường ống NFb đặc có bổ sung thêm dịch trích nấm men (yeast extract) (5g/l) và KNO3 (50ml/l), sau đó được trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C. Hình 4: Sự phát triển của vi khuẩn Azospirillum môi trường đĩa petri NFb đặc làm thay đổi màu môi trường Các dòng vi khuẩn Azospirillum mà chúng tôi phân lập được có nguồn gốc từ lúa hoang và các giống lúa trồng tại Cần Thơ (quận Ninh Kiều, Ô Môn, Cái Răng) và một số tỉnh lân cận của vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long như: Vĩnh Long (huyện Bình Minh, Trà Ôn), Hậu Giang (huyện Châu Thành), Trà Vinh (Cầu Kè) (bảng 1). Kết quả cho thấy đa số các dòng vi khuẩn tăng trưởng mạnh khoảng từ 1 - 2 ngày sau khi cấy (38 dòng ), 6 dòng còn lại có thời gian tăng trưởng chậm hơn (2 - 3 ngày). Trong số 44 dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập có 13 dòng từ lúa hoang, chiếm 29,55%, chủ yếu được thu mẫu tại quận Ninh Kiều - Thành Phố Cần Thơ. Có 20 dòng vi khuẩn từ lúa cao sản (giống lúa IR 505 - 04, Miền Tây Lúa), chiếm 45,45% và 11 dòng vi khuẩn từ lúa mùa (lúa Châu Hạng Võ, Hàm Châu và Cửu Long 8), chiếm 25% trong tổng số 44 dòng vi khuẩn Azospirillum mà chúng tôi phân lập được. Đa số các dòng vi khuẩn Azospirillum được phân lập từ rễ của cây lúa chiếm 86,36% (38 dòng), còn lại 13,64% (6 dòng) được phân lập từ thân lúa hoang. Bảng 1: Nguồn gốc cây chủ, xuất xứ và một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên lúa trồng và lúa hoang. STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Thời gian tăng trưởng (ngày) Cây chủ Nơi lấy mẫu 1 âm2 H 3 4 5