Luận văn Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (Beta-Fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía

. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006. 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc khoảng 21 - 26 nucleotide [4]. Các siRNA này đƣợc giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5’ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất đƣợc chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 nguyên tắc bổ sung. Khi đã đƣợc nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4]. Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích chức năng hệ gen cây trồng v.v... 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector. Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway - Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính: + Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện (expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D). + Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa “entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB. Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1 và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2 để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2. Mặt khác, đoạn gen quan tâm đƣợc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì thế thu đƣợc trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn. 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA Tái sinh cây đƣợc xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công của các thí nghiệm chuyển gen. Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn. Ở mía đã chuyển gen thành công với hai phƣơng pháp là súng bắn gen và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là hiệu quả hơn hẳn. Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía bằng phƣơng pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29]. Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D +5 g/l agar), pH = 5,8 trong điều kiện tối, ở 28oC. Trƣớc 4 giờ chuyển gen bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol. Sau chuyển gen các mô sẹo đƣợc đồng nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày. Tiếp theo mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc và thu đƣợc cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trƣờng có bổ sung 45 mg/l geneticin. Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ sung 5 mg/l ppt. Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông qua A.tumefaciens GV2260. Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34]. Mô sẹo đƣợc tạo từ đoạn thân non trên môi trƣờng [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l NZ- amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3 mg/l 2,4D + 100 ml nƣớc dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1 tháng. Trƣớc 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống ôxyhóa vào dịch khuẩn. A.tumefaciens đƣợc hòa tan với môi trƣờng cảm ứng tạo chồi có bổ sung 5 ml chất chống ôxyhóa với OD578 = 0,2 và đƣợc lây nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút. Diệt khuẩn và chuyển mô sẹo lên môi trƣờng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime ở 28oC, lắc 60 vòng/2 ngày. Cây chuyển gen đƣợc tạo thành với các môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin. Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua A.tumefaciens (OD600=0,2; 0,4; 0,6) trong thời gian 10 - 20 phút với kháng sinh chọn lọc 500 mg/l carbenicillin và 1 mg/l ppt [28]. Nhƣ vậy, các tác giả đã tái sinh và chuyển gen thành công chủ yếu từ mô sẹo và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Để thành công việc chuyển gen vào thực vật nói chung cũng nhƣ ở mía thì nhất thiết phải có một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm và cải biến hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen của các nghiên cứu thành công về mía ở trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang đƣợc giữ tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm Plasmid Kích thƣớc (bp) Kháng sinh chọn lọc Nguồn cung cấp pENTR TM /D- TOPO 2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ) pK7GWIWG2(II) 12904 Spectinomycine, streptomycine Trƣờng Đại học Ghent (Bỉ) - Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng CV58C1 mang plasmid pGV2260 - Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs - Các enzyme T4 ligase, T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp 2.1.3. Hóa chất khác - Cặp mồi 3’INV/5’INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 dòng pENTR TM /D-TOPO do chúng tôi thiết kế và đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc). - Gateway LR Clonase TMII Enzyme Mix Kit (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction) - Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). - Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs... 2.1.3. Các thiết bị máy móc Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy biến nạp bằng xung điện, máy đo OD, máy vortex, máy xác định trình tự nucleotid tự động... của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Thiết kế mồi Khai thác dữ liệu trong GenBank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá Invertase của cây mía (Bảng 3.2). Sử dụng phần mềm chuyên dụng DNAstar so sánh độ tƣơng đồng giữa các trình tự Invertase thu đƣợc và thiết kế cặp mồi đặc hiệu tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 2.2.2. Tách RNA tổng số Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá và bẹ thân non của 2 giống mía in vitro ROC1 và ROC10 theo hƣớng dẫn kèm theo. 2.2.3. RT-PCR Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase ở mía bằng kỹ thuật RT-PCR một bƣớc (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau: Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ 1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 2 Biến tính 95 5 phút 1 3 Biến tính 94 20 giây 35 4 Gắn mồi 52 1 phút 35 5 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 6 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 7 Kết thúc phản ứng 8 24 giờ 1 Thành phần của phản ứng với tổng thể tích 25 l đƣợc bổ sung vào ống effendorf 0,5 ml đã đƣợc xử lý DEPC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; 1 µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6 mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT. Mix mẫu nhẹ nhàng và thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2. Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8 - 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và nhuộm bản gel trong ethidium Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 bromide (EtBr). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction Kit. 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn (INV_pENTR). Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli Top 10 và nhân nuôi lƣợng lớn trong môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambroock và đƣợc cất giữ ở -20oC. INV_pENTR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, 10 ng M13for, 10 ng M13rev, 0,5 g Taq polymerase. Chu kỳ của phản ứng nhƣ sau: Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 95 5 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 35 3 Gắn mồi 52 1 phút 35 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Mẫu plasmid tái tổ hợp INV_pENTR sau khi kiểm tra sẽ đƣợc loại RNA và thực hiện xác định trình tự nucleotide trên máy ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen. 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi INV_pENTR sẽ đƣợc gắn vào vector pK7GWIWG2(II) theo kỹ thuật Gateway để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa Invertase (INV_RNAi). Trong kỹ thuật này, vector pENTR/D mang vị trí tái tổ hợp attL trong khi ở vector nhận là attR. Các vị trí này giúp phản ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra khi có mặt đồng thời plasmid INV_pENTR với vector nhận pK7GWIWG(II) gắn đoạn gen Invertase theo cả 2 chiều xuôi-ngƣợc vào vector nhận, tạo nên cấu trúc INV_RNAi mong muốn. Các dòng plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc nhân lên trong tế bào E.coli trên đĩa môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol ở 37 oC qua đêm. Sau đó tiến hành tách plasmid theo kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi thu đƣợc sẽ đƣợc phân lập và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen Invertase bằng phƣơng pháp cắt giới hạn với hai enzyme HindIII và XbaI sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Dòng tế bào mang vector INV_RNAi sẽ đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens CV58C1 bằng xung điện ở 400 Ω / 2,5 KV / 25 μF. Plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân nuôi trong môi trƣờng có bổ sung 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin ở 28oC qua đêm. Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo Chúng tôi tiến hành tái sinh mía theo phƣơng pháp của hai nhóm nghiên cứu Santosa và cs (2004); Zhangsun và cs (2007) có cải biến nhƣ sau: cắt những đoạn thân mía non có chứa đỉnh sinh trƣởng của cây mía in vitro dài khoảng 0,5 cm sau đó đặt lên môi trƣờng môi trƣờng tạo mô sẹo (M1 - M4). Các mẫu cấy sẽ đƣợc nhân nuôi trong buồng tối ở 25oC trong vòng 15 - 20 ngày thì thu đƣợc các mô sẹo lên tốt. Các mô sẹo nhân lên trong môi trƣờng tạo mô sẹo (M1) lỏng có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong tối, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút, 1 tuần để đạt kích thƣớc lớn phục vụ cho việc biến nạp. Sau đó, các mô sẹo đƣợc loại bỏ phần thân xanh và đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc. Khi chồi có kích thƣớc khoảng 1- 3 cm (25 - 30 ngày) thì chuyển sang môi trƣờng tạo rễ Mr. Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía Môi trƣờng Thành phần pH Nhân mía M0: MS + 0,8 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Tạo mô sẹo M1: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M2: MS + 4 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M3: MS + 5 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M4: MS + 6 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Nhân mô bằng nuôi lỏng lắc M1 lỏng: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose 5,8 Tạo chồi Mc: MS +1,5 mg/l kinetin + 2 mg/l BAP + 30 g/l sucrose +9 g/l agar Tạo rễ Mr: MS + 1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose +9 g/l agar 5,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía 2.2.7.1. Tạo huyền phù vi khuẩn Lấy một khuẩn lạc từ đĩa nuôi đặc nuôi trong môi trƣờng LB có bổ sung 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l chloramphenicol + 50 mg/l kanamycine (hoặc 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l rifamycin) ở 28oC, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Lấy ra 5 ml khuẩn nuôi phục hồi trong 30 ml môi trƣờng LB lỏng mới, lắc tiếp trong khoảng 2 - 3 giờ trong cùng điều kiện. Sau đó ly tâm khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 10 phút thu sinh khối tế bào rồi hòa tan khuẩn vào ½ MS không đƣờng, (pH = 5,8) có bổ sung AS 100 mM. 2.2.7.2. Đồng nuôi cấy với huyền phù A.tumefaciens và tái sinh Mô sẹo sau khi đƣợc nhân sinh khối từ môi trƣờng lỏng sẽ đƣợc lấy ra tách thành từng mảnh nhỏ. Quá trình lây nhiễm khuẩn đƣợc tiến hành theo hai hƣớng là thổi khô mô sẹo và chuyển lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi với các ngƣỡng thời gian khác nhau. Sau đó mô sẹo đƣợc lấy ra và ngâm trong huyền phù vi khuẩn thời gian từ 10 - 30 phút. Sau đó thấm khô và cấy lên môi trƣờng đồng nuôi cấy M1 (thổi khô) hoặc Mc (cảm ứng tạo chồi). Sau 3 ngày, mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng diệt khuẩn M1 có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong 1 tuần. Các mô sẹo sống sót sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tái sinh Mc + 500 mg/l cefotaxim và Mc + 500 mg/l cefotaxim + 1 mg/l ppt. Các chồi tái sinh đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và 1 mg/l ppt để tạo cây hoàn chỉnh. Chúng tôi kiểm tra biểu hiện gen gus bằng cách nhuộm mô sẹo sau đồng nuôi cấy với dung dịch X-gluc, ủ ở 37oC trong tối trong khoảng từ 12 - 16 giờ, sau đó rửa với cồn 70% và soi trên kính hiển vi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 KHÁI QUÁT SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM Cắt đoạn thân sát gốc (5 cm) Mô sẹo Chọn lọc mô sẹo Tái sinh cây Đồng nuôi cấy Diệt khuẩn Tách RNA tổng số RT_PCR Tách dòng và xác định trình tự gen Thiết kế vector tái tổ hợp INV_RNAi Thiết kế mồi Cây mía in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ MỒI Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase bằng kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng nhất là phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự của đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase. Chúng tôi đã sử dụng từ khóa “Invertase Sugarcane” để tìm kiếm trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI các trình tự gen Invertase đã đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả đã thu đƣợc sáu trình tự của gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía, trong đó có 5 trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase) với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; và một trình tự mã hóa cho enzyme Invertase liên kết màng (cell wall Invertase) có mã số AY302084 (Bảng 3.2). Sử dụng chƣơng trình MegAlign (DNAstar) so sánh độ tƣơng đồng của các trình tự trên với nhau cho thấy năm trình tự của Invertase hoà tan tƣơng đồng cao mặc dù đƣợc phân lập từ các giống mía khác nhau và có độ tƣơng đồng 46% với đoạn trình tự mã hoá cho Invertase liên kết màng. Trình tự đầy đủ của gen này với mã số AY302083 có độ dài 1923 bp. Trong nghiên cứu của chúng tôi đoạn gen dài 435 nucleotide (từ nucleotide vị trí 384 tới vị trí 818 bp - vùng có trình tự bảo thủ cao nhất) nằm trên gen mã hoá enzyme Invertase hòa tan (AY302083) đƣợc lựa chọn để tách dòng. Sau đó với mục đích giúp sản phẩm PCR gắn đƣợc vào vector tách dòng pENTR/D chúng tôi đã gắn thêm đồng thời vào mồi đầu 3’ một đoạn trình tự CACC để tạo vị trí bám cho enzyme TOPO-Isomerasse (GTGG) gắn trên vector nhân dòng PENTR/D-TOPO. Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp bởi hãng BIONEER, Hàn Quốc. Trình tự cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc ở bảng 3.1 nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3 ’ INV và 5 ’ INV Mồi Trình tự mồi Tm(oC) %GC (5 ’ INV) 5 ’ -CATCTGGGGCAACAAGATC-3 ’ 52,3 52,6 (3 ’ INV) 5 ’ -CACCAAGTGCACGAAGTCCTTG-3 ’ 59,1 54,5 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI STT Mã số Chiều dài Dạng Tên Tác giả 1 AY302083 2274 bp mRNA Invertase hòa tan Peters,K.F., Grof,C.P.L. and Botella,J.R. 2 AF062734 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 3 AF083856 1402 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 4 AF083855 494 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 5 AF062735 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 6 AY302084 1889 bp mRNA Invertase liên kết màng Peters,K.F., Grof,C.P.L., Albertson,P.L. and Botella,J.R. 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). RNase có mặt ở khắp nơi trong tế bào và có hoạt tính rất mạnh và vẫn có hoạt tính mạnh ở nhiệt độ cao (100oC trong khoảng 1 giờ). Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải hết sức cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải đƣợc xử lý trong dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Để tách RNA tổng số từ lá và thân non của mía chúng tôi tiến hành thu mẫu lá và bẹ non của hai giống ROC1 và ROC10. Các mẫu đƣợc nghiền nhanh trong N2 lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đã đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó phải bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không các RNase nội bào sẽ đƣợc giải phóng và phân cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và bất hoạt các RNase nội bào. Bổ sung chloroform:isoamyl (24:1) để làm sạch các protein còn sót lại. Tiếp theo việc bổ sung isopropanol vào làm kết tủa RNA. Cuối cùng sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong 20 μl nƣớc cất có DEPC 0,01%. RNA tổng số sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ thân và lá có hàm lƣợng lớn và có 2 băng RNA riboxom rõ nét nên khẳng định rằng RNA tổng số chƣa bị phân hủy và tối ƣu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ lá và thân non của mía ROC1 và ROC10 in vitro. Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% RNA tổng số sẽ đƣợc loại DNA bằng DNase sử dụng cho phản ứng RT-PCR. ROC 1 10 1 10 Lá Thân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 3.3. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE RNA tổng số sau khi đƣợc tinh sạch sẽ sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase với cặp mồi 5’INV và 3’INV đã thiết kế. Nếu phản ứng này xảy ra đặc hiệu theo lý thuyết thì sẽ có một băng duy nhất có kích thƣớc dài tƣơng ứng với tính toán lí thuyết là 435 bp của đoạn Invertase cần phân lập đƣợc nhân lên. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% (M): Marker 1kb; (INV): sản phẩm thôi gel Phản ứng RT-PCR có thể bị giảm hiệu quả do một số nguyên nhân nhƣ chất lƣợng và hàm lƣợng RNA tổng số của gen mã hóa enzyme Invertase, nhiệt độ bắt cặp với mồi chƣa phù hợp... Vì vậy khi tiến hành phản ứng chúng tôi đã điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+, nhiệt độ bắt cặp với mồi... để đảm bảo cho phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Thành phần hỗn hợp của phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng đã đƣợc tối ƣu hóa trình bày ở mục 2.2.1.3. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR một bƣớc với khuôn là RNA tổng số thu đƣợc từ bẹ mía non (giống ROC1) đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2). Kết quả cho thấy chúng tôi INV M 450 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 đã nhân đƣợc 1 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 450 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA dự đoán khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu. 3.4