Luận văn Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất các chế phẩm Probiotic dùng trong chăn nuôi

g 5 phút + Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút + Lấy dịch phía dưới. - Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ khả kiến ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch: OD260/OD280 > 1,7 Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing. Các sản phẩm PCR tinh sạch được khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng như sau : Terminator Ready Reaction Mix 8 ml Mẫu ADN sau PCR 200 ng/ml Mồi 1 ml Nước cất đủ đến 20ml Mồi ITS1: 5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ Mồi ITS4: 5’ – TCCTCCGCTTATTGATATGC – 3’ - Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing: Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 96 1 phút 2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau 96 10 giây 50 5 giây 60 4 phút 3 4 - Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn được duỗi ra. - Tinh sạch sản phẩm cho sequencing: Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml. Thêm 5ml EDTA 1,25 M, thêm 60ml ethanol 100%. Trộn thật nhẹ nhàng. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 15.000 v/ph trong 15 phút. Đổ bỏ dịch phía trên. Rửa bằng 100ml ethanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Làm khô mẫu băng máy cô quay chân không trong 3-5 phút. Đọc trình tự ADN. Trình tự của ITS rARN của chủng nấm được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen. 2.2.4. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp 2.2.4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có pH = 7,0, trong máy lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút) với các dải nhiệt độ khác nhau 30; 37; 40; 45oC. 2.2.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật Tương tự như trên, các chủng vi sinh vật cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể có độ pH khác nhau (2; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0), trên máy lắc ổn nhiệt giữ 37oC. 2.2.4.3. Ảnh hưởng của môi trường có nồng độ muối mật khác nhau đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật probiotic được nuôi riêng rẽ trên môi trường dịch thể phù hợp cho từng vi sinh vật chứa nồng độ muối mật thay đổi (0,2; 0,5; 1; 2; 3; 4 và 5%) từ đó tìm giới hạn nồng độ muối mật không ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng probiotic lựa chọn. Sau 48 giờ, tốc độ sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được đánh giá: với vi khuẩn (thông qua mật độ quang OD660); với nấm men (thông qua CFU/ml). 2.2.5. Phát triển chế phẩm 2.2.5.1. Đánh giá tính đối kháng của các chủng lựa chọn Đánh giá tính đối kháng của các chủng thông qua phương pháp cấy vạch. 2.2.5.2. Đánh giá khả năng bám dính của các chủng vi sinh vật vào niêm mạc đường tiêu hóa Chuẩn bị vi khuẩn và nấm men probiotic: - Vi khuẩn và nấm men được thu tại giữa pha log từ môi trường dịch thể tương ứng bằng ly tâm (6000 vòng/phút/15 phút) sau đó rửa 2 lần với đệm PBS. - Tế bào được huyền phù lại trong môi trường dịch thể (MRS cho vi khuẩn lactic, LB cho Bacillus, YM cho nấm men) trước khi tiến hành cho bám dính đạt mật độ 4 x 108 CFU/ml Chuẩn bị vật liệu bám dính: - Chuẩn bị các mẫu ruột tươi (ruột gà) có cùng kích thước sau đó rửa 3 lần với đệm PBS sao cho tất cả các vi khuẩn không còn trên bề mặt niêm mạc ruột nữa. Rửa lại 1 lần với môi trường dịch thể MRS (LB hoặc YM). Tiến hành bám dính: - Bổ sung dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên vào vật liệu bám dính (2 thể tích tế bào/1 trọng lượng vật liệu), ủ tại 370C trong 90 phút. - Rửa tế bào: + Rửa mẫu ruột sau khi ủ lần 1 với 2 thể tích muối sinh lý 1%. + Rửa 3 lần với 2 thể tích đệm PBS, thu lấy dịch rửa 3 lần, đếm tế số lượng tế bào bám dính trên mẫu. 2.2.5.3. Đánh giá tính tương thích của các chủng vi sinh vật với một số thành phần có hoạt tính trong khẩu phần ăn. Các chủng nghiên cứu được nuôi cấy trên môi trường dịch thể tương ứng (MRS cho vi khuẩn lactic; thạch thường cho vi khuẩn Bacillus và YM cho nấm men) nhưng có bổ sung các thành phần có hoạt tính thường có trong các khẩu phần ăn cho lợn và gia cầm gồm các loại kháng sinh thương mại BMD (50 ppm); Saigon Nox (100 ppm), Colistine 98% (100 ppm), CTC 15% (100 ppm); một số loại khoáng CuSO4 (250 ppm Cu); ZnSO4 (100 ppm Zn) và hỗn hợp axit hữu cơ (gồm axit lactic axit, axit formic, axit citric...) với liều 200mg/lít. Nuôi cấy lắc (200 vòng/phút) trong tủ ấm (37oC). Đếm mật độ tế bào trên môi trường đĩa thạch sau 48h. 2.2.5.4. Phát triển chế phẩm probiotic Các chủng vi sinh vật probiotic được sử dụng để phát triển chế phẩm dạng bột theo nghiên cứu trước đây (Trần Quốc Việt và cs, 2007). - Hai chế phẩm probiotic dạng bột đa chủng gồm PBB1 và PBB2 được sử dụng cho thí nghiệm này. Mật độ các chủng vi sinh vật hữu ích đạt 107 – 108 cfu/g. - Chín mươi sáu (96) lợn con lai thương phẩm cai sữa 21 ngày tuổi có khối lượng bình quân từ 7-8 kg đã được sử dụng. Lợn được nuôi trong thời gian 50 ngày, trong chuồng nền xi măng, thông thoáng tự nhiên. - Khẩu phần cơ sở cho lợn thí nghiệm được phối chế từ các nguyên liệu: ngô ép đùn, tấm gạo tẻ, khô dầu đậu tương tách vỏ, bột thay thế sữa (milk replacer), bột sữa whey, premix vitamin-khoáng và các axit amin tổng hợp. Phương pháp bố trí thí nghiệm. - Lợn thí nghiệm được phân ngẫu nhiên vào 4 lô theo thể thức ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi lô 24 con được nuôi trong 3 ô chuồng, 8 con/ô (đồng đều tính biệt), mỗi ô là một lần lặp lại. Lợn ở các lô 1 (đối chứng âm) và 2 (đối chứng dương) được ăn khẩu phần cơ sở (bảng 2) không và có bổ sung colistin với liều 100g/tấn tương ứng. Lợn ở các lô 3 và 4 được ăn khẩu phần cơ sở có bổ sung probiotic (PBB1 và PBB2) với liều 2000 g/tấn. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích. Vi sinh vật probiotic chủ yếu là vi khuẩn lactic, Bacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycess boulardii. Trên thực tế các đối tượng trên có mặt trong hầu hết các mẫu trong tự nhiên, để thu được chúng có thể phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như thực phẩm lên men (rau, củ, nem chua, bún), đất nước, thực phẩm các loại, bánh men... Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật tồn tại trong đường tiêu hoá của vật nuôi (gà, lợn) và một số nguồn khác nhau (đất, các sản phẩm lên men). Việc lấy mẫu phân lập sẽ có nhiều khả năng thu nhận và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có đặc tính probiotic như chịu axit, muối mật, sinh enzym thuỷ phân và bacteriocin kháng khuẩn gây bệnh. Từ các nguồn khác nhau, 254 chủng vi sinh vật đã được phân lập, trong đó có 164 chủng vi khuẩn lactic, 45 chủng vi khuẩn Bacillus và 45 chủng nấm men (bảng 4). Bảng 4: Kết quả phân lập các vi sinh vật từ các nguồn khác nhau Nguồn phân lập Nhóm vi sinh vật đã phân lập Vi khuẩn lactic Bacillus Nấm men Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn ngoại 48 20 18 Chất chứa trong ruột non và ruột già của lợn Móng cái 43 16 13 Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Lương Phượng 38 2 5 Chất chứa trong ruột non, ruột già của gà Ri 20 2 2 Các nguồn khác nhau trong tự nhiên 15 5 7 Tổng 164 45 45 Tổng số 254 Trong đó từ chất chứa trong ruột non, ruột già của lợn và gia cầm đã phân lập được 149 chủng vi khuẩn lactic, 40 chủng Bacillus và 38 chủng nấm men. Từ các nguồn khác nhau trong tự nhiên (đất, các sản phẩm lên men...), đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn lactic, 5 chủng Bacillus và 7 chủng nấm men. Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập được giữ trong ống nghiệm môi trường (MRS, thạch thường và YM) thạch nghiêng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời các chủng này còn được bảo quản lạnh sâu ở - 800 C nhằm giữ được giống trong thời gian dài. 3.2. Tuyển chọn các vi sinh vật có đặc tính probiotic 3.2.1. Vi khuẩn lactic. 3.2.1.1. Đánh giá khả năng sản sinh axit 164 chủng vi khuẩn lactic phân lập được được nuôi cấy lắc trên 20 ml môi trường MRS dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong. Để xác định khả năng sinh axit chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Kết quả tuyển chọn khả năng sinh axit được trình bày ở bảng 5. Bảng 5. Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit Khả năng sinh axit Số lượng chủng Tỷ lệ (%) Cao (D-d ≥25mm) 30 18,3 Trung bình (10≤D-d<25mm) 89 54,3 Yếu (0<D-d<10mm) 45 27,4 Tổng 164 100 (D-d là đường kính vòng phân giải CaCO3) Kết quả thu được cho thấy khả năng sinh axit của vi khuẩn lactic khá đa dạng, số chủng sinh axit trung bình là 89 chủng chiếm nhiều nhất (54,3%), trong khi đó khả năng sinh axit mạnh có 30 chủng chiếm 18,3%, còn lại là 45 chủng (27,4%). Các chủng sinh axit với hàm lượng cao nhất được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.1.2. Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin Một trong những đặc tính quan trọng nhất làm căn cứ tuyển chọn các chủng vi khuẩn probiotic là khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định. Trong số 30 chủng sản sinh axit lactic cao nhất, 12 chủng được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 6. Bảng 6: Khả năng sản sinh bacteriocin kháng vi khuẩn kiểm định của 12 chủng vi khuẩn lactic (được đánh giá bằng đường kính vòng kháng khuẩn - ∆D, mm) STT Ký hiệu chủng Vi khuẩn kiểm định (∆D, mm*) Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri 1 1K8 11 2 6 2 2M33 13 4 7,5 3 3K2 11 0 10 4 5M2 5 0 10,5 5 5H4 9 0 11 6 6H2 21 12 10 7 C3 16 11 10 8 Đ2 12 3 6 9 Đ12 6 1,5 3 10 Đ7 10 7 7 11 NC1 8 6 12 12 NC2 6 3 9 (* ∆D = D-d: đường kính vòng kháng khuẩn) Kết quả ở bảng 6 cho thấy, cả 12 chủng đều có hoạt tính kháng vi khuẩn Salmonella và Shigella. 09 chủng có khả năng ức chế cả 3 loại vi khuẩn kiểm định (Salmonella, E. coli và Shigella). Tuy nhiên, mức độ kháng các vi khuẩn kiểm định của các chủng rất khác nhau. Vòng kháng khuẩn (cả 3 loại vi khuẩn kiểm định) có đường kính lớn thuộc về các chủng 6H2; C3 (D-d ≥10mm đối với cả 3 chủng kiểm định); vòng kháng khuẩn trung bình thấy ở chủng Đ2; Đ7; 1K8; NC1; NC2 và 2M33 (D-d ‹ 10mm). Có 3 chủng 3K2; 5M2 và 5H4 có hoạt tính kháng E. coli không rõ rệt (D-d = 0 mm) (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng lactic có trong hình 4, 5 thuộc phụ lục 1). Vì vậy 09 chủng sinh bacteriocin kháng cả 3 loại vi khuẩn kiểm định được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. Hình 2: Sơ đồ minh họa hoạt tính kháng khuẩn của các chủng lactic. 3.2.2. Vi khuẩn Bacillus 3.2.2.1. Đánh giá khả năng sản sinh enzym Tổng số 45 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được, đã được nuôi lắc trên 20ml môi trường LB dịch thể trong 48 giờ. Thu dịch nuôi cấy, ly tâm lạnh 10000 vòng/phút lấy dịch enzym. Để xác định khả năng phân giải cơ chất chúng tôi tiến hành đục thạch và nhỏ dịch vào các giếng trên đĩa thạch đã có cơ chất khác nhau (tinh bột, xenluloza), để ở nhiệt độ 370 C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử Lugol và đo vòng phân giải. Kết quả được thể hiện ở bảng 7. Bảng 7: Số lượng chủng Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất Hoạt tính enzym Số lượng chủng Bacillus có khả năng phân giải cơ chất Tinh bột Xenluloza Mạnh (D-d ≥25mm) 7 6 Trung bình (8≤D-d<25mm) 23 5 Yếu (0<D-d<8mm) 15 34 (D-d là đường kính vòng phân giải cơ chất) Các chủng có hoạt tính enzym mạnh và trung bình (D-d ≥8mm) với cả 2 cơ chất (11 chủng) được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. Khả năng sinh enzym của 11 chủng Bacillus được lựa chọn được trình bày trong bảng 8. Bảng 8: Khả năng sản sinh enzym (thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất D-d, mm) của 11 chủng vi khuẩn Bacillus. TT Ký hiệu chủng Amylaza (D-d, mm) Xenlulaza (D-d, mm) 1 H3 34 30 2 M51 32 28 3 H4 30 27 4 M73 29 24 5 B71 16 15 6 M12 15 14 7 B75 18 16 8 D11 9 8 9 M16 10 9 10 M17 11 10 11 M21 8 8 (D-d là đường kính vòng phân giải cơ chất) H×nh 3. Sơ đồ minh họa hoạt tính amylaza của 11 chủng vi khuẩn Bacillus Kết quả ở bảng 8 trên cho ta thấy cả 11 chủng vi khuẩn Bacillus được lựa chọn thì hoạt tính enzym amylaza và xenlulaza mạnh nhất thuộc về chủng H3, tiếp đến là các chủng M51, H4 và M73 (đường kính vòng phân giải từ 24-34 mm). (Hình minh họa hoạt tính enzym của một số chủng Bacillus có trong hình 6, 7, 8 thuộc phụ lục 1). 3.2.2.2. Đánh giá khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định 11 chủng có hoạt tính enzym mạnh nhất được lựa chọn để đánh giá tiếp hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định. Các kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của 11 chủng vi khuẩn Bacillus được trình bày ở các bảng 9. Các kết quả ở bảng 9 cho thấy, trong 11 chủng được lựa chọn thì 09 chủng Bacillus không có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định và 2 chủng có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định (H3 và H4) nhưng với hàm lượng rất thấp và cả 2 chủng này đều không kháng vi khuẩn E.coli. Vì vậy 2 chủng H3 và H4 được dùng trong các nghiên cứu tiếp theo. (Hình minh họa hoạt tính kháng khuẩn của một số chủng Bacillus có trong hình 9 thuộc phụ lục 1). Bảng 9: Hoạt tính kháng khuẩn của 11 chủng vi khuẩn Bacillus TT Ký hiệu chủng Hoạt tính kháng khuẩn (D-d, mm) Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri 1 H3 0,5 0 2 2 M51 0 0 0 3 H4 0,5 0 2,8 4 M73 0 0 0 5 B71 0 0 0 6 M12 0 0 0 7 B75 0 0 0 8 D11 0 0 0 9 M16 0 0 0 10 M17 0 0 0 11 M21 0 0 0 (D-d là đường kính vòng kháng khuẩn) 3.2.3. Nấm men 3.2.3.1. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định Trong số 45 chủng nấm men đã được phân lập, các chủng được xác định khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định. 01 chủng được xác định là có khả năng kháng các vi khuẩn kiểm định là chủng SB. Kết quả tóm tắt được trình bày ở bảng 10, 11. Bảng 10: Số lượng chủng nấm men có hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn Số lượng chủng Tỷ lệ (%) Có 01 2,2 Không 44 97,8 Tổng 45 100 Bảng 11: Hoạt tính kháng khuẩn của chủng nấm men SB Khả năng kháng khuẩn (D-d, mm) Salmonella entriristic E. coli Shigella flexneri 0 0 10 (D-d là đường kính vòng kháng khuẩn) Các số liệu ở bảng 11 cho thấy, chủng SB chỉ có khả năng kháng Shigella, còn không kháng E.coli và Salmonella. Tuy không có một số đặc tính probiotic như các vi khuẩn lactic và Bacillus, nhưng các chủng nấm men hữu ích tác động có lợi đối với vật nuôi qua một số cơ chế sau: (i) kích hoạt một số enzym thuộc nhóm disacharridaza (surcraza, lactaza, maltaza) làm tăng khả năng tiêu hoá đường đa (Buts và ctv, 1986); (ii) trung hòa một số loại độc tố của vi khuẩn (Castagliuolo và ctv, 1998); (iii) kết dính một số vi khuẩn gây bệnh có roi bám vào biểu mô ruột nhờ các thụ quan mannose và loại chúng ra ngoài theo phân (Czerucka và ctv, 2002); (iv) kích thích hệ miễn dịch, tăng sản xuất IgA (Qamar et al, 2001). Từ phần tuyển chọn các chủng vi sinh vật 09 chủng lactic (1K8, 2M33, 6H2, C3, Đ2, Đ12, Đ7, NC1 và NC2), 02 chủng vi khuẩn Bacillus (H3 và H4) và 01 chủng nấm men (SB) được dùng trong nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Phân loại các chủng được tuyển chọn 3.3.1. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic Việc phân loại các chủng vi khuẩn được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và phân tích, giải trình tự gen 16S rARN. Bảng 12 trình bày các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hoá của 09 chủng vi khuẩn lactic. Tất cả 09 chủng vi khuẩn lactic đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phản ứng catalaza âm tính và có 3 dạng hình thái khác nhau: hình que ngắn (1K8; NC1; NC2), hình que dài (2M33; C3; Đ12 và Đ2) và hình cầu chuỗi (6H2 và Đ7). Khả năng đồng hoá tinh bột của các chủng không cao (chỉ có 2 chủng có khả năng nhưng ở mức độ yếu là 1K8; Đ7). Bảng 12: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn Đặc điểm Ký hiệu chủng giống 1K8 2M33 6H2 C3 Đ2 Đ12 Đ7 NC1 NC2 Hình dạng tế bào Que ngắn Que dài Hình cầu chuỗi Que dài Que dài Que dài Hình cầu, chuỗi Que ngắn Que ngắn Nhuộm Gram Gram + Gram + Gram + Gram + Gram + Gram + Gram + Gram + Gram + Phản ứng catalaza - - - - - - - - - Khả năng đồng hoá nguồn hydrat cacbon Riboza - + + + + + ++ - + Xyloza - + + ++ + + + - + Arabinoza + + + + + + + + + Rhamnoza + + + + - + + + + Trehaloza + ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ Lactoza +++ +++ ++ +++ +++ +++ + +++ ++ Mannitol ++ ++ + + ++ ++ + ++ ++ Sucroza +++ +++ ++ +++ +++ + +++ +++ +++ Cellobioza +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ +++ +++ Raffinoza ++ ++ + ++ ++ + + ++ ++ Galactoza + +++ +++ +++ + +++ ++ + ++ Tinh bột + ++ - - - - - + - Gluconat ++ ++ + ++ + +++ +++ ++ +++ Fructoza + ++ + ++ ++ +++ + + ++ Căn cứ vào khoá phân loại của Bergeys (1982) và Okada (1992) trên cơ sở các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa, 09 chủng trên được xác định thuộc các chi Lactobacillus (1K8, 2M33, Đ2, Đ12, C3, NC1 và NC2), Streptococcus (Đ7) và Enterococcus (6H2). Để phân loại đến loài, 9 chủng vi khuẩn này được trình tự gen rARN 16S và được so sánh với các loài có quan hệ họ hàng gần. Kết quả giải trình tự gen mã hóa cho rARN 16S được trình bày ở bảng 13. Bảng 13: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho rARN 16S (xem phụ lục 2) Chủng Kích thước đoạn gen đã được đọc (bp) Gần gũi với loài (BLAST Search) Tỷ lệ tương đồng (%) 1K8 1400 Lactobacillus plantarum 99 2M33 1306 Lactobacillus plantarum 99,7 6H2 1306 Enterococcus faecium 99,8 C3 1450 Lactobacillus acidophilus 99,8 Đ2 1270 Lactobacillus plantarum 99,7 Đ12 1532 Lactobacillus plantarum 99,9 Đ7 1547 Pediococcus pentosaceus 99,7 NC1 1450 Lactobacillus fermentum 99,7 NC2 1499 Lactobacillus casei 99,9 Kết quả giải trình tự gen mã hóa rARN 16S của 09 chủng vi khuẩn lactic cho thấy có 4 chủng có trình tự tương đồng gần gũi với loài Lactobacillus plantarum (1K8, 2M33, Đ2, Đ12), còn lại 5 chủng trình tự tương đồng với các loài Lactobacillus fermentum (NC1), Enterococcus faecium (6H2), Lactobacillus acidophilus (C3), Pediococcus pentosaceus (Đ7) và Lactobacillus casei (NC2). 3.3.2. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn Bacillus Tương tự như đối với vi khuẩn lactic, việc phân loại các chủng vi khuẩn Bacillus, được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và xác định trình tự gen. Các số liệu được trình bày ở các bảng 14 và 15. Bảng 14: Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của 2 chủng H3 và H4 Đặc diểm Ký hiệu chủng H3 H4 Hình thái tế bào Tế bào hình que và nhỏ, nối lại thành sợi dài Tế bào hình que, đơn và nhỏ Khả năng sinh bào tử Bào tử hình bầu dục, lệch tâm Bào tử hình bầu dục, gần tâm Nhuộm Gram Gram + Gram + Khả năng đồng hóa hydratcacbon D-Maltoza + + D-Glucoza + + Fructoza + + Lactoza - - Sacaroza ++ + Galactoza + + D-Xyloza + + Cellobioza ++ ++ Raffinoza + + Galactoza + + Tinh bột ++ ++ Gluconat ++ ++ Bảng 15: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho rARN 16S của 2 chủng Bacillus H3 và H4 (xem phụ lục 2) Chủng Kích thước đoạn gen đã được đọc (bp) Gần gũi với loài (BLAST Search) Tỷ lệ tương đồng (%) H3 1450 Bacillus licheniformis 99,7 H4 1544 Bacillus subtilis 99,5 3.3.3. Nghiên cứu phân loại vi khuẩn nấm men Tương tự như đối với vi khuẩn, việc phân loại các chủng nấm men được tiến hành căn cứ vào các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và xác định trình tự gen. Các số liệu được trình bày ở các bảng 16 và 17. Bảng 16: Một số đặc tính hình thái và sinh lý sinh hoá của chủng nấm men SB Đặc điểm Chủng SB Hình dạng tế bào Hình trứng, elíp, nảy chồi 1 phía Hình thái khuẩn lạc Trắng sữa tròn nhẵn bóng lồi có vòng đồng tâm Khả năng đồng hoá nguồn cacbohydrat Khả năng lên men nguồn cacbohydrat Sorboza - - Xyloza - - Arabinoza - - Rhamnoza - - Trehaloza + + Lactoza - - Sucroza + + Cellobioza - - Raffinoza + + Galactoza + + Tinh bột - - Melibioza - - Glucoza + + Bảng 17: Kết quả giải trình tự gen mã hoá cho đoạn ITS rARN của chủng SB (xem phụ lục 2) Kích thước đoạn gen đã được đọc (bp) Gần gũi với loài (BLAST Search) Tỷ lệ tương đồng (%) 570 Saccharomyces boulardii 100 Kết hợp số liệu thu được từ các bảng 12, 13, 14, 15, 16 và 17 chúng tôi xác định các tên loài của 9 chủng vi khuẩn lactic, 2 chủng Bacillus và 1 chủng nấm men lựa chọn trong bảng 18. Bảng 18: Kết quả định danh các chủng vi sinh vật probiotic STT Kí hiệu Tên loài 1 1K8 Lactobacillus plantarum 2 2M33 Lactobacillus plantarum 3 6H2 Enterococcus faecium 4 C3 Lactobacillus acidophilus 5 Đ2 Lactobacillus plantarum 6 Đ12 Lactobacillus plantarum 7 Đ7 Pediococcus pentosaceus 8 NC1 Lactobacillus fermentum 9 NC2 Lactobacillus casei 10 SB Saccharomyces boulardii 11 H3 Bacillus licheniformis 12 H4 Bacillus subtilis Các kết quả ở bảng trên cho thấy các chủng được lựa chọn đều là những chủng vi sinh vật lành tính, không phải là các vi sinh vật gây bệnh và được sử dụng rất phổ biến để tạo ra các chế phẩm probiotic. 3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn 3.4.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 3.4.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Nuôi lắc 220 vòng/phút 09 chủng vi khuẩn lactic trong bình tam giác chứa 20ml môi trường MRS dịch thể ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-450C. Sau 48 giờ nuôi cấy thu dịch lên men đo OD và định lượng axit lactic tạo ra. Kết quả được trình bày ở bảng 19. Bảng 19: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD660) và sản sinh axit lactic (g/l) của 09 chủng lactic Ký hiệu chủng Nhiệt độ nuôi cấy (oC) 30 oC 37 oC 40 oC 45 oC OD660 HA OD660 HA OD660 HA OD660 HA 1K8 2,131 2,52 2,157 2,57 0,354 0,92 0,241 0,63 2M33 1,654 2,34 1,876 2,39 0,426 1,15 0,354 0,68 6H2 1,466 1,48 1,481 1,53 1,134 1,28 0,221 0,65 C3 1,941 2,3 2,088 2,7 0,318 0,68 0,189 0,55 Đ2 1,912 1,95 2,121 2,09 0,985 0,89 0,208 0,78 Đ12 1,859 2,36 1,974 2,31 0,856 1,12 0,112 1,01 Đ7 1,945 2,34 2,029 2,43 1,119 1,26 0,195 0,86 NC1 1,578 2,68 1,924 3,08 1,234 1,8 0,667 0,63 NC2 1,657 2,34 1,885 2,58 1,053 1,1 0,725 0,49 HA: Hàm lượng axit lactic (g/l) Kết quả ở bảng 19 cho thấy, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic thể hiện bằng mật độ quang OD660 tăng khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên đến 37oC. Khi nhiệt độ tăng lên trên 37oC (40 và 45oC) mật độ quang giảm rõ rệt. Qui luật này quan sát thấy ở cả 09 chủng vi khuẩn. Các số liệu ở bảng 19 cũng cho thấy, nhiệt độ từ 30oC đến 37oC là thích hợp nhất đối với các chủng vi khuẩn lactic. Tuy nhiên, trong vùng nhiệt độ tối thích này, mật độ quang của các chủng cũng rất khác nhau. Khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 37oC thể hiện qua chỉ số OD660 xếp theo thứ tự cao (OD660≥2) gồm 4 chủng (1K8, Đ2, C3, Đ7), trung bình (1,5<OD660<2) gồm 4 chủng (Đ12, 2M33, NC1 và NC2) và thấp (OD660 ≤1,5) gồm 1 chủng (6H2). Khả năng sản sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn cũng có xu hướng tương tự như khả năng sinh trưởng. Nhìn chung, những chủng có khả năng sinh trưởng tốt cũng là những chủng có khả sản sinh axit lactic cao. Kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Ngọc Lan và ctv (2003) cho thấy, khi phân lập từ phân gà tươi 789 chủng vi khuẩn lactic, có hai chủng được lựa chọn (CH123 và CH156) là có các đặc tính probiotic và cả hai chủng đều có khả năng sinh trưởng ở khung nhiệt độ từ 15 đến 45oC. 3.4.1.2. Ảnh hưởng của pH môi trường dịch nuôi cấy Nuôi lắc 220 vòng/phút các chủng lactic trong môi trường MRS có pH khác nhau từ 2,0 đến 7,0 ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 20. Kí hiệu chủng pH 2 3 4 5 6 7 OD HA OD HA OD HA OD HA OD HA OD HA 1K8 0,175 1,76 0,191 2,06 0,713 2,21 0,181 1,89 0,163 0,72 0,162 0,42 2M33 0,043 1,01 0,081 1,52 0,696 1,78 0,044 1,04 0,038 0,58 0,029 0,33 6H2 0,022 1,42 0,042 1,63 0,732 2,04 0,038 1,53 0,019 1,01 0,007 0,45 C3 0,019 1,04 0,024 1,44 0,73 2,04 0,021 1,13 0,012 0,68 0,008 0,38 Đ2 0,015 0,95 0,019 1,27 0,645 1,85 0,017 1,04 0,015 0,9 0,013 0,42 Đ12 0,048 0,72 0,08 1,94 0,671 2,32 0,052 1,04 0,014 0,65 0,012 0,35 Đ7 0,046 1,49 0,092 1,96 0,585 2,29 0,077 1,89 0,038 0,95 0,01 0,62 NC1 0,609 2,55 0,73 2,5 0,725 2,48 0,71 2,56 0,400 2,45 0,173 2,4 NC2 0,690 2,18 0,8 2,18 0,805 2,12 0,789 2,2 0,578 2,08 0,257 2,0 Bảng 20: Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng (OD660) và khả năng sản sinh axit lactic (g/l). HA= Hàm lượng axit lactic (g/l) Kết quả ở bảng 20 cho thấy với dải pH rộng: 2; 3; 4; 5; 6 và 7, đáp ứng về sinh trưởng và khả năng sản sinh axit lactic của 09 chủng vi khuẩn lactic là khác nhau. Các số liệu ở bảng 20 cũng cho thấy mật độ quang (OD660) ở môi trường có độ pH 4 của 07 chủng là cao nhất (dao động từ 0,58 đến 0,8), riêng chủng NC1 thì tại pH 3 mật độ quang và hàm