Luận văn Phân lập vi khuẩn Bacillus Subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E.Coli gây bệnh tiêu chảy trên heo

nh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất phải đơn giản không tốn kém. Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại đƣợc trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thƣờng. 2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic có nguồn gốc từ bacillus sp đƣợc sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm này có nhiều ƣu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào tử chịu đựng đƣợc các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa….Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis đƣợc tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang những gene gây độc cho ngƣời và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis đƣợc nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm đƣợc trên phần đầu của ruột non (3). Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đƣợc đẩy mạnh. 2.4 Bacillus subtilis 2.4.1 Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc. Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.4.2 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thƣớc 0,5- 0,8μm x 1,8-3μm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thƣờng ở 11 dạng đơn bào, hiện diện nhiều trong đất, nƣớc, trong đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật. Hình dạng của Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA là khuẩn lạc khô, có rìa răng cƣa, có đƣờng kính 3-5mm nằm sát trên bề mặt thạch. Hình 2.1: Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trƣờng TSA và nhuộm gram của Bacillus subtilis Các phản ứng sinh hóa đƣợc sử dụng để để khẳng định Bacillus subtilis. Phản ứng lecithinase (-), khả năng phân giải casein (+), khả năng phân giải tinh bột (+), phân giải gelatin (+), phản ứng khử nitrate (+), phản ứng khử citrate (+), VP (+), indol (-), lên men không sinh hơi các loại đƣờng nhƣ: glucose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Bacillus subtilis là vi khuẩn gram (+) đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất cho đến thời điểm hiện nay, bộ genome của loài này đã đƣợc giải mã toàn bộ, bộ gene có 4 Mbp (23), trọng lƣợng của bộ genome khoảng 2,4×109 đến 2,6×109 dalton đặc biệt trong genome của Bacillus subtilis có nhiều gene qui định cho khả năng kháng lại kháng sinh nhƣ gene kháng thiostrepton, streptomycin, erythromycin, spectinomycin, chloramphenicol, penicilin.v.v…(8) tuy nhiên bất kể là gene kháng kháng sinh đƣợc qui định trên genome hay trên plasmid nó cũng là nguồn cung cấp gene kháng kháng sinh cho các vi sinh vật đƣờng ruột. Ở điều kiện kỵ khí Bacillus subtilis sử dụng nitrate nhƣ chất nhận điện tử cuối cùng, nếu trong môi trƣờng thiếu nitrate thì Bacillus subtilis phát triển bằng cách lên men. Trong môi trƣờng nuôi cấy Bacillus subtilis tiết ra exopolysacharide để gắn kết các tế bào lại với nhau để tạo màng sinh học (biofilm) (10). Màng sinh học giúp cho Bacillus subtilis có ƣu thế trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi 12 trƣờng tự nhiên đồng thời màng sinh học nổi lên trên bề mặt môi trƣờng giúp cho vi khuẩn có thể tiếp xúc trực tiếp với oxy trong không khí. Sản xuất các chất diệt khuẩn khác nhau, có nhiều nghiên cứu cho thấy Bacillus subtilis có khả năng sản xuất nhiều hợp chất kháng khuẩn khác nhau có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Clostridium perfringens, Helicobacter pylori, Escherichia coli 078:K80.v.v… (5). Vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc ứng dụng để sản xuất các loại enzyme khác nhau nhƣ amylase, protease đồng thời cũng đƣợc ứng dụng để sản xuất sản phẩm lên men truyền thống natto của Nhật Bản. Khi gặp điều kiện bất lợi Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử, bào tử có thể tồn tại rất lâu trong tự nhiên có thể đến hàng ngàn năm và có thể phát triển lại thành tế bào sinh dƣỡng hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Hiện nay bào tử của Bacillus subtilis đang đƣợc quan tâm để sản xuất ra các vaccin thế hệ mới, bằng kĩ thuật di truyền đã chuyển gene qui định độc tố thƣơng hàn vào Bacillus subtilis và trong quá trình hình thành bào tử gene này cũng đƣợc biểu hiện để sản xuất ra những protein kháng nguyên trên lớp vỏ bào tử (7). 2.5 Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 2.5.1 Giới thiệu Peptide antibiotic là sản phẩm chuyển hóa bậc hai của nhiều loại vi sinh vật khác nhau, giúp chúng có ƣu thế trong cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong môi trƣờng cũng nhƣ trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm. Peptide antibiotic có bản chất là các peptide có trọng lƣợng phân tử nhỏ, depsipeptide, peptidolactone, lipopeptide, đƣợc phân thành hai lớp là peptide đƣợc tổng hợp bằng ribosome còn đƣợc gọi là bacteriosin, còn lại là lớp peptide không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (16). Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau nhƣ subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin có bản chất là bacteriocin còn bacilysin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillaene, difficidin và các lipopeptide có tính kháng khuẩn là các antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome (20). Bacteriocin đƣợc tổng hợp dƣới dạng tiền peptide có chứa một đoạn tín hiệu giúp cho enzyme tiết nhận biết, đồng thời ức chế sự tác động của bacteriocin trong tế bào, dạng tiền peptide sau đó đƣợc chuyển lên màng nguyên sinh chất tại đây xãy ra 13 các phản ứng biến đổi sau dịch mã, cắt đoạn peptide tín hiệu ở đầu C của tiền chất để thành dạng hoàn chỉnh, sau đó đƣợc tiết ra ngoài bằng phức hợp bơm protein ABC (ATP-binding cassette transport complex) gắn với màng tế bào chất (16). Các peptide antibiotic không tổng hợp bằng ribosome thì đƣợc tổng hợp bằng các enzyme có cấu trúc phân tử lớn, bên trong cấu trúc đƣợc chia thành nhiều module khác nhau mỗi module chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt, các module đƣợc sắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự các amino acid trên chuỗi peptide (16). Lipopeptide có tính kháng khuẩn đƣợc chia thành 3 họ khác nhau là surfactin, fengycin và iturin, lipopeptide đƣợc cấu tạo bằng vòng peptide có cấu tạo từ 7 (họ surfactin và iturin) hoặc 10 (họ fengycin) amino acid liên kết với nhóm –COOH và nhóm hydroxy (họ surfactin và fengycin) hoặc nhóm amino (họ iturin) tại vị trí β của acid béo. Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ C13 đến C16 đối với lipopeptide thuộc họ surfactin, từ C14 đến C17 đối với họ iturin và từ C14 đến C18 trong trƣờng hợp của họ fengycin (20). 2.5.2 Peptipe antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 2.5.2.1 Subtilin Subtilin là bacteriocin thuộc nhóm I lantibiotic, những antibiotic thuộc nhóm Lantibiotic có tính kháng khuẩn mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng nhƣ Propionibacterium acnes, staphylococci, streptococci và clostridia. Cấu tạo của subtilin có chứa các amino acid không bình thƣờng lanthionin, β-methyllanthionin, D- alanin, dehydroalanin, dehydrobutyrin, cầu nối sulfic đƣợc hình thành giữa các amino acid này tạo nên nhiều cấu trúc dạng vòng trong cấu tạo của subtilin. Các amino acid không bình thƣờng đƣợc tạo ra do quá trình biến đổi sau dịch mã của subtilin (28). Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vật bằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tƣơng tác giữa điện tử tự do sinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydryl trên màng nguyên sinh chất làm ảnh hƣởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lƣợng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Subtilin đƣợc tổng hợp trong pha tăng trƣởng và đạt nồng độ cao nhất ở đầu pha cân bằng (29). 14 Operon của subtilin gồm có spaS mã hóa cho tiền peptide của subtilin, spaB và spaC mã hóa cho enzyme thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã, spaT mã hóa cho enzyme chuyển dạng tiền chất của subtilin lên màng tế bào chất , spaR và spaK mã hóa cho protein điều hòa quá trình tổng hợp subtilin (27), spaI mã hóa cho thành phần protein của lipopeptide SpaI giúp bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại sự tác động của subtilin, spaF, spaE, spaG mã hóa cho hệ thống chuyển ABC thực hiện tiết subtilin ra ngoài môi trƣờng bên ngoài (26). Cấu trúc của subtilin, thứ tự các gene trên operon spaIEFG đƣợc thể hiện ở Hình 2.2 (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp subtilin đƣợc điều hòa bằng hệ thống điều hòa hai thành phần là protein SpaK và SpaR. SpaK là protein xuyên màng với đầu cuối N nằm trong tế bào chất. Khi nồng độ vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy tăng cao hoặc có sự hiện diện của subtilin hay các antibiotic có cấu trúc tƣơng tự (nisin) trong môi trƣờng nuôi cấy. SpaK tiếp nhận tín hiệu rồi truyền vào bên trong bằng cách tự phosphoryl hóa His ở vị trí 247 ở đầu N sau đó sẽ chuyển gốc phosphat đến amino acid Asp ở vị trí 51 của protein SpaR , SpaR sẽ gắn vào promoter thúc đẩy sự biểu hiện của gene spaB, spaT, spaC, spaS đồng thời cũng điều hòa sự tổng hợp của spaI, spaF, spaE, spaG. Ngoài ra operon của subtilin còn đƣợc điều hòa bởi yếu tố H (27). Subtilin ban đẩu đƣợc tổng hợp ở dạng tiền chất có 56 amino acid, dạng tiền chất này đƣợc SpaT chuyển lên màng tế bào chất, tại đây dạng tiền chất của subtilin đƣợc biến đổi thành dạng subtilin hoàn chỉnh có 32 amino acid. Sau đó subtilin đƣợc chuyển ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC do SpaF, SpaE, SpaG hợp thành. Lipoprotein SpaI định vị ở bề mặt ngoài của lớp màng tế bào có tác dụng ngăn chặn sự tác động của subtilin vừa đƣợc tiết ra lên màng tế bào chất của Bacillus subtilis (26). 2.5.2.2 Subtilosin Subtilosin là bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh đối với Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (24), cấu trúc dạng vòng, tiền peptide có 43 amino acid, Asn ở vị trí 9 tạo liên kết với Gly ở đầu cuối C, đoạn tín hiệu ở đầu cuối N đƣợc cắt để tạo thành cấu trúc dạng vòng, Phe và Thr đƣợc biến đổi sau dịch mã dẫn đến sự 15 hình thành cầu nối nội phân tử để hình thành dạng antibiotic hoàn chỉnh dạng vòng có 32 amino acid (25). Cấu trúc của subtilosin đƣợc thể hiện ở Hình 2.3A (phụ lục). Toàn bộ gene chịu trách nhiệm cho toàn bộ quá trình tổng hợp subtilosin đƣợc mã hóa trên cùng 1 operon. Operon sbo-alb đƣợc điều kiển bởi promotor ở upstream của sboA, giữa 2 gene sboA và albA có một cấu trúc terminator cho nên các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp và phân tiết subtilosin đƣợc tổng hợp với số lƣợng ít hơn cơ chất của nó. Operon của subtilosin bao gồm các gene là sboA mã hóa cho dạng tiền chất của subtilosin, albA, albF và albE mã hóa cho protein thực hiện các phản ứng biến đổi sau dịch mã và hoàn chỉnh subtilosin, albB, albC, albD và albG mã hóa cho protein chịu trách nhiệm cho sự tự đề kháng của Bacillus subtilis với subtilosin (24). Cấu trúc của operon đƣợc thể hiện ở Hình 2.3B (phụ lục). Quá trình điều hòa, tổng hợp, biến đổi sau dịch mã và phân tiết của subtilin. Sự tổng hợp của subtilosin đƣợc kiểm soát bởi hệ thống điều hòa spo0-abrB, ở pha tăng trƣởng AbrB sẽ gắn trực tiếp với promotor của operon sbo-alb ức chế sự biểu hiện của operon này, ở đầu phag cân bằng do sự thiếu dinh dƣỡng trong môi trƣờng và nồng độ cao của tế bào (25), các enzyme trên màng của tế bào tiếp nhận tín hiệu, các enzyme này truyền tín hiệu vào bên trong bằng một loạt các phản ứng phosphoryl hóa cuối cùng là phosphoryl hóa SpoA, quá trình này cũng là sự mở đầu của quá trình tạo bào tử, SpoA đƣợc phosphoryl hóa sẽ ức chế sự biểu hiện của abrB dẫn đến thúc đẩy sự biểu hiện của operon sbo-alb. Quá trình dịch mã đƣợc thực hiện bởi RNA polymerase đƣợc kiểm soát bởi yếu tố điều hòa A, trong điều kiện thiếu oxy operon sbo-abl đƣợc điều hòa bởi hệ thống truyền tín hiệu ResDE (25), (24). Tiền chất của subtilocin đƣợc tổng hợp ở dạng thẳng có 42 amino acid sau đó đƣợc AlbA và AlbF biến đổi thành dạng hoàn chỉnh. Trong cấu tạo của AlbB có hai nhóm Cys một ở giữa đoạn cuối N, một ở đầu C , nhóm này đƣợc xem là trung tâm S- Fe là trung tâm hoạt động của các enzyme thực hiện các phản ứng hydrate hóa hoặc dehydrate cơ chất, còn AlbF trong cấu trúc có một đoạn peptide tƣơng tự nhƣ là peptidase nằm giữa đầu N còn ở đầu C có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cấu trúc protein gắn vào peptide cho nên hai enzyme này đƣợc thực hiện các phản ứng biến đổi dạng pre- subtilocin thành dạng hoàn chỉnh (24). 16 Sau khi đƣợc biến đổi thành dạng hoàn chỉnh thì subtilocin đƣợc tiết ra ngoài chủ yếu bằng AlbC có sự tham gia của AlbD. AlbB có tác dụng giữ cho Bacillus subtilis tránh đƣợc sự tác động của subtilocin (24). 2.5.2.3 Sublancin Sublancin thuộc nhóm AII lantibiotic vì trên đoạn peptide tín hiệu có 1 motif GS kế tiếp nó là một site cắt, do đó sublancin đƣợc tiết ra ngoài bằng hệ thống chuyển ABC hai chức năng là cắt đoạn peptide tín hiệu và tiết sublancin ra môi trƣờng, trong cấu tạo có 3 cầu nối nội phân tử gồm 2 cầu nối disulfic của 4 Cys và một cầu nối sulfic của -methyllanthionine và dehydrobutyrine, tƣơng tự nhƣ antibiotic thuộc họ lantibiotic, sublansin không tác động với vi khuẩn gram âm nhƣng có khả năng ức chế mạnh đối với vi khuẩn gram dƣơng kể cả tế bào dinh dƣỡng lẫn bào tử. Sublancin là bacteriocin rất bền, bảo quản ở điều kiện bình thƣờng trong thời gian 2 năm không làm mất hoạt tính của sublancin (21). Operon của sublancin gồm các gene sunA, sunT, bdbA, bdbB, bdbC, và bdbD. SunA là tiền peptide của sublancin có 56 amino acid sau đó đoạn tín hiệu bị cắt đi trong quá trình phân tiết tạo thành dạng hoàn chỉnh có 37 amino acid, sunT mã hóa cho hệ thống chuyển ABC vì trong cấu trúc của SunT có 4 cấu trúc xuyên màng, ở đầu N tồn tại domain có hoạt tính peptidase, còn ở đầu C là domain liên kết với ATP (21).Gene bdbB là gene quan trọng cho sự tổng hợp sublancin nó mã hóa cho enzyme xúc tác phản ứng tạo cầu nối disulfic giữa hai Cys bên trong cấu tạo của sublancin, bdbA, bdbC và bdbD thì không có tác động lớn đối với việc tổng hợp sublansin. Cấu trúc của sublancin, trình tự amino acid và cấu trúc operon của sublancin đƣợc trình bài ở Hình 2.4 (phụ lục). 2.5.2.4 TasA TasA là peptide kết hợp với bào tử của Bacillus subtilis, TasA có phổ kháng khuẩn rộng đƣợc tổng hợp và tiết vào môi trƣờng 30 phút sau khi quá trình tạo bào tử đƣợc bắt đầu, đồng thời TasA cũng đƣợc chuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp peptidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ƣu thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm (30). Operon của TasA bao gồm 3 gene là yqxM, sipW và tasA. yqxM là gene mã hóa cho kháng sinh đƣợc tổng hợp trong môi trƣờng có nồng độ muối cao (32), SipW chịu 17 trách nhiệm cắt đoạn peptide tín hiệu và chuyển TasA ra ngoài môi trƣờng và giữa lớp màng kép của tiền bào tử trong cấu tạo của SipW có 4 đoạn peptide xuyên màng, amino acid serine ở vị trí 47 và Histidin ở vị trí 87 là trung tâm hoạt động của đoạn peptide đóng vai trò là peptidase của SipW (31). Gene tasA mã hóa cho tiền peptide của TasA. Trong cấu trúc của đoạn peptide tín hiệu ở vị trí 7 và 9 là kế tiếp là một đoạn peptide kỵ nƣớc (G ở vị trí 10 đến A ở vị trí 15) cấu trúc bậc 3 có dạng α-helic cho phép đoạn peptide này có thể xuyên màng, kế tiếp là đoạn peptide chứa 3 L, 5 amino acid, kế tiếp là site cắt cho peptidase. Trình tự amino acid tiền chất của TasA và cấu trúc của operon đƣợc đƣợc biểu diễn ở Hình 2.5A (phụ lục). Quá trình điều hòa tổng hợp và phân tiết của TasA. TasA đƣợc tổng hợp ngay đầu phag cân bằng cho nên nó đƣợc điều hòa bởi các yếu tố điều hòa chuyển phag. Tƣơng tự nhƣ subtilosin quá trình tổng hợp TasA đƣợc điều hòa hệ thống spo0-abrB nhƣng RNA polymerase chịu trách nhiệm dịch mã cho operon cùa TasA đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa H (31). Sau khi đƣợc tổng hợp dạng tiền chất của TasA đƣợc chuyển lên màng tế bào chất, hai Lys ở vị trí 7 và 9 mang điện tích dƣơng liên kết với màng tế bào chất, sau đó đoạn peptide kỵ nƣớc sẽ xuyên qua màng tế bào chất đồng thời kéo đoạn peptide còn lại xuyên màng sau đó peptidase trong SipW cắt đoạn tín hiệu rồi giải phóng TasA hoạt động, đoạn tín hiệu sau đó tiếp tục đƣợc cắt rồi loại ra khỏi màng tế bào chất (36). Cơ chế chuyển TasA vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử cũng xãy ra tƣơng tự. Khác với các loại protein tiết khác TasA sau khi đƣợc chuyển qua màng tế bào chất thì một phần không khuếch tán ra môi trƣờng mà định vị trong lớp peptidoglycan của vách tế bào Bacillus subtilis và bào tử (33). Vị trí của TasA bên trong vách tế bào và bào tử đƣợc thể hiện ở Hình 2.5B (phụ lục). 2.5.3 Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng Ribosome. 2.5.3.1 Surfactin Surfactin có cấu tạo là lipopeptide do sự liên kết của một chuỗi heptapeptide với acid béo có một gốc –OH ở vị trí β tạo nên vòng lacton.Chiều dài của chuỗi acid béo thay đổi từ 13–16 C (20). Surfactin có hoạt tính bề mặt rất mạnh do đó nó có tính đối kháng mạnh đối với vi khuẩn, virus và kháng lại các tế bào ung thƣ nhƣng ít tác động đối với nấm. Tác động của surfactin làm ức chế các kênh chuyển ion trên trong lớp 18 màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính của enzyme cylic AMP phosphodiesterase (35). Chuỗi heptapeptide của surfactin có trình tự amino acid là NH2-Gly-Leu-DLeu- Val-Asp-DLeu-Leu-COOH, chuỗi peptide này đƣợc tổng hợp bằng các phản ứng enzyme. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm trên cùng một operon gọi là srf operon. srf operon có tất cả 4 gene là srfA, srfB, srfC và srfD. SrfA (402 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid đó là Gly, Leu, DLeu. SfrB (401 kDa) là enzyme hoạt hóa 3 amino acid kế tiếp, SrfC (144 kDa) hoạt hóa Leu còn lại và tách chuỗi peptide ra ngoài.Trong cấu tạo của các enzyme này đƣợc đƣợc chia thành nhiều modul khác nhau mỗi modul chịu trách nhiệm hoạt hóa một amino acid chuyên biệt. Bên trong mỗi modul đƣợc chia thành các domain là domain A (adenylation), domain C (condensation), domain T (thiolation), domain E (epimerization) mỗi domain thực hiện một bƣớc trong trong quá trình hoạt hóa amino acid của modul. Domain A thực hiện phản ứng adenyl hóa cơ chất tạo thành aminoacyladenylate, trung tâm hoạt động của domain A liên kết với ion Mg2+. Domain T với cofactor là 4′-phosphopantetheine (ppan) thực hiện phản ứng hoạt hóa liên kết thioeste. Domain C thực hiện phản ứng tạo liên kết este giữa 2 amino acid. Trong những modul thực hiện hoạt hóa amino acid có cấu hình D thì có thêm domain E chịu trách nhiệm chuyển amino acid từ cấu hình L sang cấu hình D (34). Cấu trúc của surfactin, quá trình điều hòa, cấu trúc của operon srf, quá trình tổng hợp chuỗi amino acid của surfactin đƣợc thể hiện ở Hình 2.6 (phụ lục). Quá trình điều hòa và tổng hợp surfactin. Surfactin đƣợc tổng hợp để đáp ứng với nồng độ cao của vi sinh vật trong môi trƣờng, srf operon đƣợc đƣợc điều hòa dƣơng bởi ComA. Nhƣng quá trình phosphoryl hóa ComA đƣợc điều hòa bởi nhiều yếu tố khác nhau. Các modul của 3 enzyme SrfA, SrfB, SrfC đƣợc xắp xếp theo trình tự tƣơng ứng với trình tự của amino acid của chuỗi peptide. Khi quá trình bắt đầu Gyl sẽ gắn vào domain A của modul 1 để thực hiện phản ứng adenyl hóa sau đó đƣợc chuyển qua domain T để tạo phản ứng thioeste với cofactor 4′-phosphopantetheine. Ở modul thứ 2 Leu đƣợc gắn vào domain A, domain C của modul 2 thực hiện phản ứng tạo liên kết este của Gly với gốc amine tự do của Leu sau đó đƣợc chuyển qua domain T của 19 modul 2 để thực hiện các phản ứng tiếp theo. Ở modul cuối cùng có domain TE nhận biết và tách đoạn peptide ra ngoài (34). Heptapeptide sau khi đƣợc tổng hợp sẽ tồn tại ở dạng vòng hoặc dạng thẳng sau đó sẽ liên kết với β-hydroxyl acid béo cuối cùng là đƣợc tiết ra ngoài. 2.5.3.2 Fengycin (18), (34) Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm. Fengycin bao gồm một peptide có 10 amino acid có trình tự L-Glu · D-Orn · L-Tyr · D-allo-Thr · L-Glu · D-Ala (D-Val) · L-Pro · L-Glu · D-Tyr · L-Ile với một cầu nối lacton giữa L-Tyr và L-Ile liên kết với 1 chuỗi β-hydroxyl acid béo có mạch cacbon dài từ 14 đến 18. Fengycin đƣợc tổng hợp nhiều trong phag tăng trƣởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối phag tăng trƣởng, fengycin vẫn đƣợc duy trì ở nồng độ thấp với hàm lƣợng ổn định trong phag cân bằng. Operon mã hóa cho các enzyme tổng hợp fungycin gồm fenC mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu và D-Orn, fenD mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Tyr và D-allo-Thr, fenE mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho L-Glu · D-Ala (D-Val), fenA mã hóa cho enzyme hoạt hóa L-Pro, L-Glu và D-Tyr, fenB mã hóa cho enzyme hoạt hóa cho amino acid cuối cùng là L-Ile, cuối cùng là gene mã hóa cho enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi acid béo. Chuỗi 81 nucleotide trên phần upstream của fenC có 2 điểm khởi đầu dịch mã và 4 promotor, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với promotor đƣợc điều hòa bởi yếu tố điều hòa A, điều này giải thích tại sao fengycin đƣợc tổng hợp trong phag tăng trƣởng, 2 promotor có cấu trúc tƣơng ứng với yếu tố điều hòa F duy trì sự tổng hợp fengycin trong phag cân bằng. Cấu trúc của fengycin, fen operon, trình tự nucleotide của phần upstream của fenC đƣợc trình bày ở Hình 2.7 (phụ lục). 2.5.3.3 Mycosubtilin (19), (34) Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin. Mycosubtilin có cấu tạo là một chuỗi β-amino acid béo có chiều dài từ 14-17 C liên kết với 1 heptapeptide mạch vòng có trình tự amino acid là Asn-DTyr-DAsn-Gln-Pro-DSer-Asn. Các lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhƣng có tác động rất hạn chế với vi khuẩn, trong cấu tạo của chuỗi heptapeptide có DTyr ở amino acid thứ 2 20 đồng thời có thêm 2 amino acid có cấu hình D ở vị trí 3 và 6. Cấu trúc của mycosubtilin đƣợc trình bày ở Hình 2.8A (phụ lục). Operon của mycosubtilin bao gồm các gene fenF mã hóa cho protein FenF (45,2 kDa) có hoạt tính malonyl-CoA transacylases, mycA mã hóa cho protein MycA (449,3 kDa) trong cấu tạo của MycA có 2 modul chịu trách nhiệm hoạt hóa Asn và tổng hợp chuỗi acid béo. Trong modul chịu trách nhiệm tổng hợp acid béo đƣợc chia thành nhiều domain mỗi domain thực hiện một bƣớc chuyên biệt trong quá trình tổng hợp acid béo, thứ tự sắp xếp của các domain này là AL (acyl-CoA ligase), ACP (acyl carrier protein), KS (β -keto acyl synthetase), AMT (amino transferase). Tiếp theo là gene mycB mã hóa cho protein MycB (612,3 kDa) chịu trách nhiệm hoạt hóa 4 amino acid là DTyr, DAsn, Glu, Pro. Gene cuối cùng trong operon là mycC mã hóa cho MycC (297.9 kDa) hoạt hóa cho 2 amino acid cuối cùng là DSer và Asn. Cấu trúc của Mycosubtilin operon đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8B (phụ lục). Khác với sự tổng hợp của surfactin, acid béo của mycosubtilin đƣợc tổng hợp kèm với quá trình tổng hợp chuỗi peptide. Acid béo đƣợc tổng hợp trên 1 modul của MycA sau khi tổng hợp, acid béo đƣợc gắn nhóm amino vào vị trí β, modul còn lại hoạt hóa Asn và chuyển vào domain T, sau đó liên kết este đƣợc tạo ra giữa acid béo với gốc amine tự do của Asn. Qúa trình tổng hợp chuỗi peptide xãy ra tƣơng tự với quá trình tổng hợp của surfactin. Các bƣớc của quá trình tổng hợp acid béo, gắn gốc amine, tạo liên kết este đƣợc trình bày chi tiết ở Hình 2.8C (phụ lục). 2.5.3.4 Bacilysocin (17) Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với nấm, đƣợc tổng hợp khi bắt đầu phag cân bằng sau đó thì giảm dần. Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid đƣợc phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis. Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12-methyltetradecanoyl)-3-phosphoglyceroglycerol đƣợc thể hiện ở hình bên dƣới. 21 Bacilysocin đƣợc tổng hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của Bacillus subtilis. Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin đƣợc thực hiện bởi enzyme lysophospholypase đƣợc mã hóa bởi gene ytpA. Quá trình tổng hợp bacilysocin đƣợc thể hiện ở Hình 2.9 (phụ lục). 22 5. PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian Từ 02/2006-05/2006. 3.1.2 Địa điểm Địa điểm thực hiện đề tài tại phòng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Phân heo lớn, khỏe mạnh đƣợc lấy từ các hộ chăn nuôi ở Đồng Nai và Bình Dƣơng Chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo và Bacillus subtilis đối chứng dƣơng đƣợc cung cấp bởi phòng vi sinh truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi Thú y đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.