Luận văn Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá khả năng kháng viêm của các hoạt chất phân lập từ loài sa nhân tím (amomum longiligulare t.l.wu)

MỞ ĐẦU. 3

CHưƠNG 1. TỔNG QUAN. 5

1.1. TỔNG QUAN VỀ LOÀI SA NHÂN TÍM (Amomum longiligulare

T.L.Wu). 5

1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố . 5

1.1.2. Công dụng và chủ trị. 6

1.1.3. Các nghiên cứu nước ngoài về Sa nhân tím. 6

1.1.3.1. Thành phần hóa học. 6

1.1.3.2. Hoạt tính sinh học. 9

1.1.4. Các nghiên cứu trong nước về Sa nhân tím . 11

1.1.4.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học . 11

1.1.4.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học. 12

1.2. GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM . 13

1.2.1. Giới thiệu về quá trình viêm . 13

1.2.2. Các yếu tố tham gia vào quá trình viêm. 15

CHưƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU . 16

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu . 16

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu . 17

2.1.2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong phân lập và xác định

cấu trúc các hợp chất. 17

2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong xác định hoạt tính

kháng viêm. 17

2.2. PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 18

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất. 18

2.2.1.1. Phương pháp chiết xuất . 18

2.2.1.2. Phương pháp phân lập. 18

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất. 19

2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR . 19

2.2.2.2. Phổ khối lượng MS. 19

2.2.2.3. Độ quay cực [α] . 20

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm. 20

pdf87 trang | Chia sẻ: honganh20 | Ngày: 03/03/2022 | Lượt xem: 290 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá khả năng kháng viêm của các hoạt chất phân lập từ loài sa nhân tím (amomum longiligulare t.l.wu), để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
cobacterrium tuberculosis, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi và có tác dụng diệt amip trên Entamoeba moshkowskii [1]. Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên cho thấy tinh dầu Sa nhân tím và dịch chiết ethanol từ hạt Sa nhân tím có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm với 3 chủng: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Candida stellatoides, dịch nƣớc sắc Sa nhân tím có tác dụng kháng Escherichia coli và Staphylococcus 13 aureus. Khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu Sa nhân tím khá mạnh so với chất đối chứng [6]. Phân đoạn bay hơi của hạt Sa nhân tím (chiết bằng dung môi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa và có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm đối với 5 chủng: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida stellatoides, Candida albicans và Cladosporium curcumerinum. Phân đoạn không bay hơi (đƣợc chiết với methanol sau khi chiết với dichloromethane) có tác dụng chống oxy hóa và tác dụng kháng nấm đối với hai chủng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus [6]. Hợp chất (+)-angelicoidenol-2-O-β-D-glucopyranoside (34) đƣợc phân lập từ Sa nhân tím có tác dụng kháng nấm đối với hai chủng Cladosporium cucumerinum và Candida albicans [6]. Hoạt tính chống oxy hóa Nghiên cứu của Đỗ Thị Hoa Viên phân đoạn bay hơi của hạt Sa nhân tím (chiết bằng dung môi dichloromethane) có hoạt tính chống oxy hóa [6]. Nhƣ vậy, các nghiên cứu về Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) còn chƣa nhiều. Các nghiên cứu ở nƣớc ta cho đến nay chủ yếu tập trung vào thành phần tinh dầu, các nghiên cứu về thành phần khác còn khá ít. Nghiên cứu về đánh giá về hoạt tính sinh học của Sa nhân tím còn khá ít, hiện chƣa có nghiên cứu nào về hoạt động kháng viêm. Thực hiện đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng viêm của dịch chiết từ quả Sa nhân tím cho kết quả dịch chiết Sa nhân tím thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO tƣơng đối mạnh (ức chế 75% và 93% ở nồng độ thử 30 µg/mL và 100 µg/mL). Do vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) là cần thiết, sẽ mở ra khả năng phát hiện các hoạt chất mới tiềm năng. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ KHÁNG VIÊM 1.2.1. Giới thiệu về quá trình viêm 14 Viêm đƣợc coi là cơ chế phòng vệ sinh lý chủ yếu, giúp cơ thể chống lại nhiễm trùng, bỏng, hóa chất độc hại, chất gây dị ứng hoặc kích thích độc hại khác. Quá trình gây viêm thƣờng kèm theo các triệu chứng sƣng, nóng đỏ và đau do các mạch máu giãn nở, đƣa nhiều máu và các tế bào bạch cầu đến nơi tổn thƣơng. Viêm không kiểm soát đƣợc có thể nhƣ một yếu tố dẫn đến các bệnh mãn tính. Hiện nay, thuốc kháng viêm giảm đau là các thuốc thuộc dòng nacotics, các thuốc không thuộc dòng steroid và các corticosteroid. Hầu nhƣ tất cả các loại thuốc này đều có tác dụng phụ. Trong quá trình viêm, những tế bào đƣợc kích hoạt (bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, thực bào đơn nhân và đại thực bào) tiết ra một lƣợng lớn nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và các cytokine tiền viêm nhƣ IL-1β, IL-6, TNF-α để giúp tiêu diệt hoặc gây ức chế sự tăng trƣởng của vi sinh vật xâm nhập hoặc mô ung thƣ. Lipopolysaccharide là một thành phần chính của màng tế bào vi khuẩn Gram âm. Nó có thể kích hoạt các đại thực bào tiết ra các cytokine tiền viêm và chất trung gian gây viêm nhƣ NO. Sự sản sinh NO đƣợc điều khiển bởi nitric oxide synthase (NOS), trong đó bao gồm nitric oxide synthases cảm ứng (iNOS), nitric oxide synthases nội bào (eNOS) và nitric oxide synthases thần kinh (nNOS). NO đƣợc sinh ra từ quá trình chuyển hóa L-Arginine thành L-citruline, xúc tác bởi iNOS. Tuy nhiên việc sản sinh ra quá nhiều hợp chất này không chỉ gây ra sự tổn thƣơng mô và tế bào, mà còn là nguyên nhân quan trọng gây bệnh thấp khớp và viêm gan mãn tính [16]. PGE2 là một trung gian viêm quan trọng khác và đƣợc sản xuất từ các chất chuyển hóa arachidonic acid bởi sự xúc tác của cyclooxygenase-2 (COX- 2) [17]. Cyclooxygenases (COX) nhƣờng 2 phân tử oxy cho arachidonic acid để tạo thành prostaglandin G2 (PGG2) bởi peroxidation, sau đó lần lƣợt chuyển hóa thành prostaglandin H2 (PGH2) dẫn đến sự hình thành của PGE2, thông qua kích hoạt phối hợp của PGE synthanse (PGES). Trong các đại thực bào, sự có mặt của LPS sẽ kích hoạt các dẫn truyền tín hiệu cho quá trình phiên mã các gen COX-2, iNOS, từ đó gây nên các đáp ứng viêm đặc trƣng. Do vậy, sự thay đổi nồng độ NO và PGE2 thông qua sự ức chế hoạt động của 15 iNOS và COX-2 là một phƣơng tiện quan trọng để đánh giá hiệu quả của các hoạt chất kháng viêm. 1.2.2. Các yếu tố tham gia vào quá trình viêm Đại thực bào: là các tế bào bạch cầu có vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng nhƣ hệ miễn dịch đặc hiệu của động vật có xƣơng sống. Khi đại thực bào đƣợc hoạt hóa bởi sự hiện diện của các tác nhân gây bệnh nhƣ vi khuẩn, endotoxin, leukotrien nó sẽ giải phóng một loạt các cytokine. Đại thực bào sản xuất 5 loại cytokine chính là IL-1, IL-6, IL-12, IL- 18 và TNF-α. Nitric oxide: là một trung gian tiền viêm, một phân tử tín hiệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của viêm. NO liên quan đến đáp ứng miễn dịch bởi các đại thực bào kích hoạt cytokine. NO ở nồng độ cao gây ra chứng viêm quá mức trong các tình huống bất thƣờng. Do đó, ức chế sản sinh NO là yếu tố quan trọng trong việc điều trị các bệnh viêm. Yếu tố nhân kappa B (NF-κB): NF-κB là một yếu tố sao mã thiết yếu kiểm soát quá trình biểu hiện gan mã hóa các cytokine tiền viêm trong quá trình sinh lý bệnh viêm. NF-κB tác động lên các gen quy định các cytokine, lên các chemokine có lợi cho quá trình viêm, lên các gen quy định các thụ thể miễn dịch. Trong bệnh lý viêm, TNF-α có thể kích hoạt yếu tố NF-κB và NF- κB thể hiện nhƣ một nhân tố điều hòa gen quan trọng đối với các gen liên quan đến viêm, nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch bao gồm iNOS, IL-1B, IL-6 và TNF-α. Các cytokine: Các cytokine là các protein tham gia vào các phản ứng miễn dịch và phản ứng viêm. Các cytokine có vai trò truyền tin qua lại giữa các bạch cầu với nhau và giữa các bạch cầu với các tế bào khác. Phần lớn các cytokine đƣợc gọi là interleukin dựa theo vai trò của nó trong việc truyền thông tin giữa các tế bào bạch cầu. Những cytokine đáp ứng viêm nhƣ IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 và TNF-α. Chúng có tác dụng tại chỗ và toàn thân, có vai trò dẫn truyền tín hiệu giữa các tế bào và cho phép hoạt hóa các hệ thống khác nhau. Các cytokine tiền viêm nhƣ IL-1, IL-6, TNF-α có vai trò ƣu thế trong điều hòa các đại thực bào, chúng cũng tham gia vào khả năng kết dính với các tế bào nội mạc, di tản đến ổ viêm, thực bào [18]. 16 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu thân và quả Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) đƣợc thu hái tại Yên Bái vào tháng 10/2018. Mẫu đƣợc định danh bởi TS. Nguyễn Thế Cƣờng, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu tiêu bản kí hiệu AM-02 đƣợc lƣu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình 2.1. Cây Sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) Mô tả đặc điểm thực vật: Cây thân thảo, cao 1,5 – 2,5 m. Thân rễ mọc bò lan trên mặt đất. Lá mọc so le thành hai dãy, hình mác, dài 23 – 30 cm, rộng 5 – 6 cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép nguyên, hai mặt nhẵn, mặt trên bóng, lƣỡi bẹ mỏng, xẻ đôi; cuống lá dài 5 – 10 mm. Quả hình cầu, màu tím, đƣờng kính 1,3 – 2 cm, mặt ngoài có gai ngắn, chia 3 ô. Hạt màu nâu sẫm, cứng, có áo, đƣờng kính 3 – 4 mm. 17 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 2.1.2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất - Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck). - Silica gel pha thƣờng với kích thƣớc hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh); hạt Diaion HP-20; Sephadex LH-20). - Thiết bị đo phổ NMR: Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đƣợc đo trên máy Brucker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội là Tetrametyl Silan - TMS) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Thiết bị đo độ quay cực: Máy JASCO P-2000 polarimeter, tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Thiết bị đo phổ khối lƣợng: Hệ thống LC/MS Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Agilent, Mỹ) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Dụng cụ, thiết bị tách chiết, phân lập: bể rung siêu âm (Daihan Scientific), hệ thống cất quay chân không (Buchi R300), hệ thống hứng mẫu tự động (EYELA fraction collector DC-1200), đèn tử ngoại hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm, cột sắc ký, bình triển khai sắc kí và các dụng cụ thí nghiệm khác. - Hóa chất: các dung môi methanol, n-hexane, ethyl acetate, dichloromethane, acetone, thuốc thử ceri sulphate, ... 2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong xác định hoạt tính kháng viêm Thiết bị, dụng cụ: - Máy đọc phiến 96 giếng (Bio-Rad Laboratories, Mỹ), bể ổn nhiệt thiết lập nhiệt độ 37oC, buồng đếm hemocytometer, máy đếm tế bào (improved Neubauer), tủ ủ CO2 (MMM Group, Đức), nồi hấp khử trùng, tủ sấy. - Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt, phiến 96 giếng đã xử lý bề mặt (SPL Life Sciences, Hàn Quốc); micropipetes, pipettes đa kênh; đầu tip micropipet (Isolab, Đức), eppendrof 1,5 và 2 mL. 18 Hóa chất: - DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium), RPMI 1640, PBS (phosphate bufferred saline), FBS (Fetal bovine serum, huyết thanh nhau phôi bò), penicillin, streptomycin (Gibco, Mỹ), MTT (Duchefa biochemie, Hà Lan), LPS (Sigma, Mỹ), sulfanilamide (BDH Chemical, Anh), N-alpha-naphthyl-ethylenediamine (BDH Chemical, Anh). - Dimethyl sulfoxide (DMSO) (Merck), nƣớc cất 2 lần (máy lọc MilliQ, Merck, Đức), methanol, isopropanol (Merck). - Chất đối chứng dƣơng Cardamonin trong đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 2.2.1.1. Phương pháp chiết xuất Mẫu sau khi thu hái đƣợc xử lý loại tạp, thái nhỏ rồi phơi khô hoặc sấy khô ở nhiệt độ 50-60ºC đến khô. Sau đó mẫu đƣợc xay nhỏ thành bột, đƣợc ngâm chiết với dung môi thích hợp để thu cao chiết tổng sau đó chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau để thu các cao chiết phân đoạn hoặc bột mẫu đƣợc chiết lần lƣợt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần để thu cao chiết các phân đoạn. 2.2.1.2. Phương pháp phân lập Sắc ký cột Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thƣờng hoặc pha đảo, diaionChất hấp phụ đƣợc nhồi lên cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh). Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa quãng đƣờng đi của chất cần tách so với quãng đƣờng đi đƣợc của dung môi đƣợc gọi là Rf, mỗi một chất sẽ có một giá trị Rf khác nhau. Chính nhờ sự khác nhau đó mà ngƣời ta tách đƣợc các chất riêng biệt ra khỏi hỗn hợp. Sắc ký lớp mỏng Săc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254. Phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc 19 dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, dung dịch ceri sulphate đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu. Sắc ký lớp mỏng điều chế Phƣơng pháp này dùng để điều chế, thu chất trực tiếp. Quá trình thực hiện tƣơng tự sắc ký lớp mỏng và sau khi triển khai xong, soi đèn UV để xác định vết rồi cạo lấy lớp silica gel chứa chất cần điều chế, tiến hành rửa giải để thu chất. 2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất Cấu trúc hóa học của các hợp chất đƣợc xác định dựa trên cơ sở sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phƣơng pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phƣơng pháp đo đƣợc sử dụng gồm có: - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR - Phổ khối lƣợng (MS) - Độ quay cực 2.2.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc đo trên máy Brucker Avance 500 MHz (chất chuẩn nội là Tetrametyl Silan - TMS) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các kỹ thuật phổ cộng hƣởng từ hạt nhân đƣợc sử dụng bao gồm: - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR, 13 C-NMR và DEPT. - Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC, COSY và NOESY. 2.2.2.2. Phổ khối lượng MS Phổ khối lƣợng đƣợc đo trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng ghép khối phổ với đầu dò Single Quadrupole 6120 (LC/MS Agilent series 1260 Single Quadrupole 6210, Agilent, USA) tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu đƣợc ion hoá bằng kỹ thuật phun mù điện tử ESI (Electrospray Ionization). 20 2.2.2.3. Độ quay cực [α] Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm Nguyên tắc đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO: Hoạt tính kháng viêm đƣợc đánh giá qua tác dụng ức chế sản sinh gốc tự do nitric oxide ( • NO). Gốc tự do • NO đƣợc sản sinh ở nhiều loại tế bào khác nhau. Dạng • NO xuất tiết có mặt ở các tế bào nhƣ đại thực bào, nguyên bào sợi hay tế bào gan thƣờng đƣợc sản sinh với lƣợng lớn khi xuất hiện đáp ứng viêm [22]. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để xác định gián tiếp • NO là đo màu các thành phần sản phẩm của nó (nitrte và nitrite). Phản ứng này đòi hỏi nitrate (NO3 - ) đầu tiên đƣợc chuyển thành nitrite (NO2 - ). Nitrite đƣợc phát hiện và phân tích thông qua phản ứng tạo phức màu hồng đỏ khi mẫu thử có chứa NO2 - với thuốc thử Griess (sulfanilamide và N-alpha-naphthyl- ethylenediamine trong môi trƣờng axit). Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7. Cách tiến hành: - Nuôi tế bào: Tế bào RAW264.7 nuôi cấy ở 37oC trong môi trƣờng DMEM có bổ sung huyết thanh nhau phôi bò 10% (FBS), 100 U/mL penicillin và 100 µg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy CO2 5% trong 24 giờ. - Sau đó chúng đƣợc nuôi cấy trong giếng phiến 96 với thể tích là 200 µL, mật độ 2 x 104 tế bào/giếng. Ủ 30 phút ở 37oC, 5% CO2. - Tế bào đƣợc kích thích với 2 µL LPS (0,1 mg/mL) trong 24 giờ với sự có mặt của các hợp chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau, đƣợc pha sẵn trong DMSO. Ủ ở 37oC, 5% CO2. - Hút 100 µL dịch nổi của tế bào phản ứng với 100 µL thuốc thử Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Cardamonin đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng dƣơng [23]. 21 - Giếng không đƣợc ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu, không cho LPS đƣợc coi là đối chứng âm. Đối chứng dƣơng đƣợc sử dụng là Cardamonin. - Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá khả năng gây độc tế bào bằng phƣơng pháp MTT. Nguyên tắc đánh giá gây độc tế bào: Khả năng gây độc tế bào đƣợc suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào RAW264.7 sử dụng phƣơng pháp MTT. Đây là một phƣơng pháp so màu, đo độ suy giảm màu vàng của MTT để đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở tế bào sống, MTT tham gia phản ứng oxi hóa khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể. Lƣợng formazan tạo thành đƣợc hoà tan bởi dung môi hữu cơ (DMSO, isopropanol) và đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 570 mm. Khả năng gây độc tế bào đƣợc suy ra từ việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào [24]. MTT (màu vàng) Formaran (màu tím) Cách tiến hành: Phần tế bào còn lại sau khi đã sử dụng để đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO đƣợc bổ sung 20 µL dung dịch MTT (0,5 mg/mL pha trong PBS), ủ trong 4 giờ ở 37oC và 5% CO2. Sau đó hút bỏ hết môi trƣờng trên bề mặt, kết tủa formazan đƣợc hòa tan trong isopropanol. Độ hấp thụ đƣợc đo ở 570 nm. Khả năng sống sót của tế bào CS% (% Cell Survival) đƣợc tính theo công thức: [ ] 22 Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử. OD: giá trị mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn, đƣợc tính theo công thức: √ ∑ ̅ Trong đó: xi : giá trị OD tại giếng i ̅: giá trị OD trung bình n: số giếng thử lặp lại Hàm lƣợng nitrite của mẫu thí nghiệm đƣợc xác định nhờ vào đƣờng cong NaNO2 và đƣợc so sánh % với mẫu đối chứng âm (LPS). Khả năng ức chế sản sinh NO đƣợc xác định theo công thức: % Ức chế = x 100% Phƣơng pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm đánh giá sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO của các chất sạch phân lập đƣợc đƣợc thực hiện lặp ít nhất 3 lần và lấy giá trị trung bình. Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính toán giá trị IC50 đƣợc xác định theo phƣơng pháp hồi quy không tuyến tính trên phần mềm Microsoft Excel 2016 và Graphpad Prism 6.0. 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 3.1.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ thân Sa nhân tím Thân Sa nhân tím đƣợc sấy khô, xay nhỏ (1 kg), sau đó chiết siêu âm với 5L methanol/lần x 3 lần ở 40oC, trong 1 giờ, cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết methanol (30 g). Cặn chiết methanol đƣợc hòa tan trong nƣớc cất và chiết lần lƣợt với dung môi n-hexane (5 lần x 500 mL), dichloromethane (5 lần x 500 mL) và ethyl acetate (5 lần x 500 mL). Cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết n-hexane (HAL 3,91 g), cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) và cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g). Hình 3.1. Sơ đồ tạo cặn chiết thân Sa nhân tím + 500 mL ethyl acetate x 5 lần Bột thân Sa nhân tím (1 kg) - Chiết siêu âm với 5L methanol ở 40oC, 1 giờ x 3 lần Cất loại dung môi Cặn methanol (30 g) + 500 mL nƣớc + 500 mL n-hexane x 5 lần Dịch nƣớc Cặn n-hexane HAL (3,91 g) + 500 mL dichloromethane x 5 lần Cặn dichloromethane DAL (5,76 g) Cặn ethyl acetate EAL (2,22 g) Dịch nƣớc Dịch nƣớc Cất loại dung môi Cất loại dung môi Cất loại dung môi 24 Cặn chiết dichloromethane (DAL 5,76 g) đƣợc phân tách trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAC gradient (100:0 → 0:100, v/v) thu đƣợc 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F1 đến F7. Phân đoạn F2 (0,85 g) kết tinh thu đƣợc tinh thể hình kim màu trắng kí hiệu AL1 (420 mg), phần dịch sau khi kết tinh đƣợc tinh chế tiếp trên cột Sephadex với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 9:1 thu đƣợc 5 phân đoạn F2.1 đến F2.5. Tiến hành phân tách phân đoạn F2.5 (0,10 g) trên cột sắc kí silica gel với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2:EtOAC tỉ lệ 50:47:3 (v/v/v) thu đƣợc chất sạch AL2 (11 mg). Phân đoạn F6 (2,28g) tiến hành phân tách trên cột Sephadex với dung môi MeOH sau đó tinh chế tiếp trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi n- hexane:CH2Cl2:EtOAC (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc 2 chất sạch kí hiệu AL3 (5 mg) và AL4 (6 mg). Hình 3.2. Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn dichloromethane thân Sa nhân tím 1, CC, Sephadex LH-20 MeOH 2, CC, Silica gel H:D:E (60:37:3, v/v/v) F1 0,86 g F2 0,85 g F3 0,73 g F5 0,18 g F4 0,23 g F6 2,28 g AL3 (5 mg) Cặn dichloromethane DAL (5,76 g) CC, Silica gel H:E gradient, 100:0 → 0:100, v/v F7 0,41 g Kết tinh AL1 (420 mg) AL4 (6 mg) CC, Sephadex LH-20 (M:D 9:1 v/v) F2.1–F2.4 F2.5 (0,10 g) AL2 (11 mg) CC, Silica gel (M:D:E 50:47:3, v/v/v) D: Dichloromethane E: Ethyl acetate H: n-Hexane M: Methanol CC: Sắc ký cột 25 Cặn chiết ethyl acetate (EAL 2,22 g) đƣợc tiến hành phân lập trên sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:acetone gradient từ 100:00:100 (v/v) thu đƣợc 12 phân đoạn, kí hiệu từ F1 đến F12. Phân đoạn F9 (8,5 mg) tinh chế trên sắc kí lớp mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexane:acetone 9:1 (v/v) thu đƣợc chất sạch AL5 (3 mg). Hình 3.3. Sơ đồ phân lập chất sạch từ cặn ethyl acetate thân Sa nhân tím 3.1.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ quả Sa nhân tím Mẫu quả Sa nhân tím đƣợc sấy khô, xay nhỏ (1,2 kg), sau đó chiết siêu âm ở 40oC, trong 1 giời (5L dung môi x3 lần), lần lƣợt với dung môi n- hexane, ethyl acetate, methanol, cất loại dung môi thu đƣợc cặn chiết n- hexane (ALH 5,5 g), cặn chiết ethyl acetate (ALE 8,84 g) và cặn chiết methanol (ALM 18,47 g). F1F8 F9 8,5 mg Cặn ethyl acetate EAL (2,22 g) CC, Silica gel H:A gradient, 100:0 → 0:100, v/v F10F12 TLC điều chế H:A (9:1, v/v) AL5 (3 mg) H: n-Hexane A: Acetone CC: Sắc ký cột TLC: Sắc ký lớp mỏng 26 Hình 3.4. Sơ đồ tạo cặn chiết quả Sa nhân tím Cặn chiết methanol đƣợc tiến hành phân lập trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH gradient (100:0→0:100, v/v) thu đƣợc 8 phân đoạn F1 đến F8. Phân đoạn F2 (0,57 g) đƣợc tiến hành sắc kí trên cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi MeOH:CH2Cl2 (9:1, v/v) thu đƣợc 5 phân đoạn F2.1 đến F2.5. Phân đoạn F2.3 tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n- hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v), sau đó chạy bản mỏng điều chế với hệ dung môi n- hexane:CH2Cl2 (2:1, v/v) thu đƣợc chất AL6 (20 mg). Tiến hành sắc ký cột silica gel phân đoạn F3 (0,32 g) với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (4:1, v/v) thu đƣợc 6 phân đoạn F3.1 đến F3.6. Phân đoạn Bột quả Sa nhân tím (1,2 kg) Chiết siêu âm với n-hexane 5L/lần ở 40oC, 1 giờ x 3 lần Cất loại dung môi Cặn n-Hexane ALH (5,5 g) Bã Chiết siêu âm với ethyl acetate 5L/lần ở 40oC, 1 giờ x 3 lần Cất loại dung môi Cặn ethyl acetate ALE (8,84 g) Bã Chiết siêu âm với methanol 5L/lần ở 40oC, 1 giờ x 3 lần Cất loại dung môi Cặn methanol ALM (18,47 g) Bã 27 F3.4 đƣợc tinh chế trên bản mỏng điều chế với hệ dung môi n- hexane:CH2Cl2:aceton (60:37:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL7 (8 mg). Phân đoạn F6 (0,23 g) đƣợc tinh chế trên trên cột sephadex LH-20 với dung môi methanol thu đƣợc 4 phân đoạn F6.1 đến F6.4. Phân đoạn F6.2 (141 mg) đƣợc phân lập trên cột silica gel với hệ dung môi n- hexane:CH2Cl2:acetone (37:60:3, v/v/v) thu đƣợc chất AL8 (4,2 mg). Hình 3.5. Sơ đồ phân lập các chất sạch từ cặn methanol quả Sa nhân tím Cặn methanol ALM (18,3 g) CC, Silica gel D:M gradient, 100:0 → 0:100, v/v F1 0,73 g F2 0,57 g F4 0,29 g F5 0,30 g F3 0,32 g F7 0,47 g F8 0,86 g F6 0,23 g CC, Sephadex LH-20 D:M (9:1, v/v) F2.1, F2.2 F2.4, F2.5 F2.3 0,20 g 1. CC, Silica gel H:D (2:1, v/v) 2. TLC điều chế H:D (2:1, v/v) AL6 20 mg CC, Silica gel H:E (4:1, v/v) F3.4 18 mg F3.1-F3.3 F3.5, F3.6 F3.3 TLC điều chế H:D:A (60:37:3, v/v/v) AL7 8 mg CC: sắc ký cột TLC: sắc ký lớp mỏng D: Dichloromethane E: Ethyl acetate H: n-Hexane M: Methanol A: Acetone CC, Sephadex LH-20 MeOH F6.1, F6.3, F6.4 F6.2 141 mg CC, Silica gel H:D:A (37:60:3, v/v/v) AL8 4,2 mg 28 3.2. THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.2.1. Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H10O3, M= 178,18. Phổ ESI-MS: m/z 179 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR xem bảng 3.1. 3.2.2. Hợp chất AL2: Methyl ferulate Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C11H12O4, M = 208,21. Phổ ESI-MS: m/z 209 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.2. 3.2.3. Hợp chất AL3: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-1,4,6-heptatrien-3- one Chất bột màu vàng, công thức phân tử: C19H16O3, M= 292,33. Phổ ESI-MS: m/z 293 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.3. 3.2.4. Hợp chất AL4: 3-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)- propan-1-one Chất rắn màu trắng, công thức phân tử: C10H12O4, M = 196,07. Phổ ESI-MS: m/z 197 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.4. 3.2.5. Hợp chất AL5: 4,4’-dihydroxy chalcone Chất rắn vô định hình màu trắng. Công thức phân tử: C15H12O3, M = 240,08. Phổ ESI-MS: m/z 241 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.5. 3.2.6. Hợp chất AL6: Nootkatone Chất dầu màu vàng nhạt, []25D = + 75,0 (CHCl3, c 0,5). Công thức phân tử: C15H22O, M = 218,33. 29 Phổ ESI-MS: m/z 219 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.6. 3.2.7. Hợp chất AL7: 6β-hydroxy-7-epi-α-cyperone Chất dạng dầu không màu, []25D = + 49,6 (CHCl3, c 0,28). Công thức phân tử: C15H22O2, M = 234,34. Phổ ESI-MS: m/z 235 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR xem bảng 3.7. 3.2.8. Hợp chất AL8: 7-epi-α-cyperone Chất dạng dầu màu vàng nhạt, []25D = - 175,0 (CHCl3, c 0,6). Công thức phân tử: C15H22O, M = 218,34. Phổ ESI-MS: m/z 219 [M+H]+. Số liệu phổ 1H-NMR xem bảng 3.8. 3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC 3.3.1. Hợp chất AL1: 4-methoxycinnamic acid Hình 3.6. Cấu trúc hợp chất AL1 Hợp chất AL1 đƣợc phân lập dƣới dạng chất rắn màu trắng. Phổ ESI- MS cho pic ion giả phân tử proton hóa ở m/z 179 [M+H]+. Phổ 1H-NMR của hợp chất thấy xuất hiện tín hiệu của proton vòng thơm hệ A2B2 ở δH 7,41 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz); 6,85 (2H, dd, J = 2,0; 7,0 Hz), ngoài ra xuất hiện hai proton olefine định hƣớng trans ở δH (ppm) 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz); 6,30 (1H, d, J = 16,0 Hz) và tín hiệu singlet của một nhóm methoxy ở phía trƣờng thấp δH 3,81 (3H, s, OCH3). Dựa

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_van_phan_lap_xac_dinh_cau_truc_va_danh_gia_kha_nang_kha.pdf
Tài liệu liên quan