Luận văn Phân tích cấu trúc của sulfate polysaccharide chiết tách từ rong lục chaetomorpha linum

biển là vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay đổi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đƣờng đơn khác nhau. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đƣờng. Các fucoidan có cấu trúc phức tạp bao gồm nhiều vấn đề cần làm sáng tỏ nhƣ thành phần các đƣờng đơn, các dạng đồng phân của đƣờng, mức độ phân nhánh và polymer hóa của chúng. Vì vậy, cho tới nay, 15 việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất. Hiện nay phƣơng pháp sử dụng phổ khối ion hóa phun mù điện (ESI-MS) đang đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, ứng dụng trong nghiên cứu cấu trúc fucoidan. Bằng phƣơng pháp sắc ký, phổ IR và NMR đã cho các thông tin về thành phần đƣờng, kiểu liên kết của các đƣờng trong phân tử fucoidan, nhƣng các thông tin về trật tự sắp xếp của các đƣờng cũng nhƣ vị trí của nhóm sulfate trong phân tử vẫn chƣa đƣợc xác định, do đó chƣa giải thích đƣợc các đặc tính sinh học khác nhau của các phân đoạn fucoidan một cách rõ ràng và thuyết phục. Fucoidan có hoạt tính sinh học rất phong phú, nhiều hoạt tính sinh học quí báu nhƣ hoạt tính chống khối u, hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ máu và hoạt tính chống lại các virus nhƣ HIV. Ngoài ra, fucoidan còn đƣợc mô tả có nhiều tác dụng sinh học lý thú khác nhƣ tác dụng hạ cholesterol, giảm mỡ máu, giảm LDL- cholesterol, triglyceride máu, tăng HDL-cholesterol, ức chế miễn dịch nên có thể sử dụng fucoidan trong các trƣờng hợp ghép phủ tạng 1.1.4.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ [40] Carrageenan là sulfate polysaccharide mạch thẳng, có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch. Carrageenan tồn tại trong một số rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae. Hiện nay, carrageenan thƣờng đƣợc chiết từ một số loài rong nhƣ Gigartina, Chondrus, Iridaea, Eucheuma. Carrageenan đƣợc tạo thành từ các đƣờng galactose mạch thẳng với hàm lƣợng sulfate khác nhau (trong khoảng 15%-40%). Các loại carrageenan khác nhau thì khác nhau về thành phần và cấu dạng, vì thế chúng tạo nên một khoảng biến đổi rộng các tính chất lƣu biến cũng nhƣ các tính chất đặc biệt khác. Cũng nhƣ các polysaccharide tự nhiên khác, carrageenan cũng không có khối lƣợng phân tử xác định. Carrageenan thƣơng mại loại dùng trong ngành chế biến thực phẩm có khối lƣợng trung bình nằm trong khoảng 200.000 g/mol. 1.1.4.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục [36] Trên thế giới, các loài rong lục cho sulfate polysaccharide đƣợc chia thành 3 nhóm chính: 16 - Nhóm rong lục cho ulvan: Bao gồm các loài rong lục thuộc 2 chi Ulva và Enteromorpha. Từ năm 2000, nhóm rong cho ulvan đƣợc gọi chung là chi Ulva []. Ulvan có thành phần đƣờng gồm: Rha, Xyl, UroA, Glu, Gal, Man và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau, tạo nên cấu trúc rất đa dạng, phức tạp gồm nhiều kiểu liên kết glycoside nhƣ: Ở Rha: α-(1→4)-, α-(1→3)-, α-(1→3,4)- và α- (1→2,3,4)-, ở Xyl: β-(1→4)-, β-(1→2,4)-; ở Glu: β-(1→4)- và β-(1→3); ở GlcA: β-(1→4)-. Nhóm sulfate trong phân tử ulvan đều ở vị trí carbon C-3 hoặc C-2 của Rha. Bảng 1.2. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide Họ Chi Loài Monostromataceae Monostroma M. latissimum M. nitidum M. angicava Ulvaceae Enteromorpha E. clathrata E. compressa E. intestinalis E. linza E. prolifera Ulva U. arasakii U. armoricana U. clathrata U. conglobata U. fasciata U. lactuca 17 U. pertusa U. reticulata U. rigida U. rotundata Capsosiphonaceae Capsosiphon C. fulvescens Cladophoraceae Chaetomorpha C. antennina Bryopsidaceae Bryopsis B. plumose Halimedaceae Halimeda H. monile Caulerpaceae Caulerpa C. brachypus C. cupressoides C. lentillifera C. prolifera C. racemosa C. sertularioides Codiaceae Codium C. adhaerens C. cylindricum C. dwarkense C. fragile C. istmocladum C. latum C. pugniformis C. tomentosum C. vermilara 18 C. yezoense - Nhóm rong lục cho sulfate arabinogalactan: Bao gồm các loài rong lục thuộc chi Codium nhƣ C. fragile, C. adhaerens, C. cylindricum Thành phần đƣờng chủ yếu trong phân tử sulfate arabinogalactan là Ara, Gal với lƣợng nhỏ Glc, Man, Xyl và nhóm sulfate tạo thành cấu trúc chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau: β-(1→3)-D-Gal và β-L-Ara với hàm lƣợng sulfate cao, Gal bị sulfate hóa ở carbon C-2 và C-4 hoặc chỉ ở C-4 và phần nhỏ ở C-6; β-(1→3)-D-Gal và lƣợng nhỏ β-(1→3,6)-Gal, với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí carbon C-4, phần nhỏ ở C-6. - Nhóm rong lục cho sulfate galacotan: Bao gồm các loài thuộc chi Caulerpa, chủ yếu là loài C. cupressoides và C. racemosa. Sulfate galacotan là một loại polysaccharide hỗn hợp từ nhiều loại monosaccharide khác nhau với thành phần chủ yếu là đƣờng Gal, lƣợng nhỏ các đƣờng Glc, Man, Xyl và nhóm sulfate tạo thành chuỗi với nhiều kiểu liên kết glycoside: (1→3)- và (1→3,6)-Gal, (1→4)-và (1→3,4)-Ara, (1→4)-Glu, với nhóm sulfate ở vị trí carbon C-3 của (1→4)-Ara và C-6 của (1→3)-Gal, (1→3)-β-D-Gal và (1→6)-β-D-Gal, nhóm sulfate ở vị trí carbon C-2. 1.1.4.4. Polysaccharide chiết xuất từ rong lục chi Chaetomorpha [37] Arabinogalactan là polysaccharide tan trong nƣớc đƣợc tìm thấy chủ yếu từ các loài rong thuộc chi Chaetomorpha nhƣ: Chaetomorpha linum, C. area, C. capillaris Các nghiên cứu chỉ ra rằng, arabinogalactan bao gồm các thành phần đƣờng chủ yếu nhƣ: arabinose, galactose, với lƣợng nhỏ glucose, xylose, mannose, rhamnose và nhóm sulfate tạo thành chuỗi các disaccharide lặp lại với tỉ lệ khác nhau, tạo nên cấu trúc rất đa dạng, phức tạp gồm nhiều kiểu liên kết glycoside nhƣ: β-(1→3)-D-Galactose và β-L- Arabinose với hàm lƣợng sulfate cao, Galactose bị sulfate hóa ở carbon C-2 và C-4 hoặc chỉ ở C-4 và phần nhỏ ở C-6; β-(1→3)-D-Galactose và lƣợng nhỏ β-(1→3,6)-Galactose, với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí carbon C-4, phần 19 nhỏ ở C-6. Các liên kết glycoside trên vòng pyranose với cấu hình C-2, C-3, C-4 là 2S, 3R, 4R hoặc 2R, 3S, 4S đối với galactose, fucose, arabinose. Mặc dù rất khó để mô tả cấu trúc hoàn chỉnh của loại dị chất sunfat hóa này, nhƣng nhiều nghiên cứu đã nhấn mạnh các hoạt tính sinh học nhƣ: trong điều trị các bệnh về gan, chống đông máu hoặc khả năng chống oxy hóa của polysaccharide sulfate đƣợc chiết xuất từ rong biển chi Chaetomorpha. Trong đó: Gal: galactose, Pyr: pyranose, p: pyrannosyl. Hình 1.5. Cấu trúc một số phân đoạn của arabinogalactan chiết từ rong lục chi Chaetomorpha 1.1.4.5. Hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết xuất từ một số loài rong lục chi Chaetomorpha Các polysaccharide từ rong lục thuộc chi Chaetomorpha, đƣợc biết đến là các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên với nhiều hoạt tính sinh học quý báu nhƣ là kháng khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, chống đông tụ máu, điều chỉnh hệ miễn dịch, chống loét, hạ huyết áp, giảm đau, hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng và kháng vi sinh vật [30, 35]: Hoạt tính chống oxy hóa: Polysaccharide chiết tách từ các loài chi Chaetomorpha thể hiện hoạt tính oxy ở khả năng làm sạch gốc tự do superoxide, khả năng quét gốc hydroxyl và gốc DPPH (1,1-diphenyl-2- 20 picrylhydrazyl), khả năng oxy hóa tổng và khả năng khử sắt. Khả năng chống oxy hóa của các polysaccharide này phụ thuộc chủ yếu vào thành phần và cấu trúc hóa học của chúng, đặc biệt phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử, hàm lƣợng sulfate và sự phân bố của nhóm sulfate trong phân tử. Hoạt tính chống đông tụ máu: Hoạt tính này phụ thuộc vào thành phần đƣờng tự nhiên, vị trí nhóm sulfate và hàm lƣợng sulfate trong phân tử và nhóm sulfate là yếu tố cần thiết cho hoạt tính chống đông tụ máu. Ngoài ra, khối lƣợng phân tử cũng là yếu tố quan trọng tác động đến khả năng chống đông tụ máu của polysaccharide, những polysaccharide có khối lƣợng phân tử lớn hơn có khả năng ức chế sự nghẽn mạch máu tốt hơn. Acid uronic không có hoạt tính chống đông tụ máu trực tiếp, nhƣng có thể làm tăng khả năng chống đông tụ máu thông qua việc cải thiện độ linh hoạt của chuỗi đƣờng. Một số loài cho polysaccharide có hoạt tính này nhƣ C. fracta, C. glomerata Hoạt tính điều chỉnh hệ miễn dịch: Polysaccharide chiết tách từ các loài thuộc chi Chaetomorpha đã đƣợc công bố là có khả năng hoạt hóa bạch huyết cầu chuột và đƣợc chứng minh là do trong thành phần có chứa các nhóm sulfate. Tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của sulfate polysaccharide từ rong lục nói chung chủ yếu dựa trên sự thay đổi bạch huyết cầu. Một vài nghiên cứu trên thí nghiệm in vitro chỉ ra rằng, sulfate polysaccharide từ rong lục thể hiện hoạt tính chống sự tăng sinh quá mức, ngăn chặn khối u phát triển trên chuột rất tốt ở vài dạng tế bào ung thƣ. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau: Polysaccharide chiết tác từ chi Chaetomorpha cũng đã đƣợc công bố là có tính chất kháng viêm, tác dụng làm giảm phù nề ở chuột. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các polysaccharide phân lập từ rong biển nói chung đều phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý và điều kiện xử lý sau thu hái. Do đó, việc sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ galactan tự nhiên phục vụ cho mục đích chữa bệnh đang đƣợc chú ý nhiều hơn. Tuy nhiên, chúng lại có cấu trúc đa dạng và 21 không đồng nhất, làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, cản trở sự phát triển của các sản phẩm chữa bệnh. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE 1.2.1. Phƣơng pháp sắc kí thẩm thấu gel (GPC) Phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography – GPC) là một kỹ thuật phân tích phân tách các đại phân tử hòa tan theo kích thƣớc dựa trên sự rửa giải của chúng từ các cột chứa đầy một loại gel xốp. Khi GPC đƣợc kết hợp với tán xạ ánh sáng, máy đo độ nhớt và máy dò nồng độ , nó có thể đo trọng lƣợng phân tử tuyệt đối, kích thƣớc phân tử và độ nhớt nội tại và tạo ra thông tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, tập hợp và phân nhánh. Bằng cách sử dụng GPC để đo trọng lƣợng phân tử và các tính chất khác này, các nhà khoa học có thể mô tả các phân tử nhƣ polymer tổng hợp, cũng nhƣ các polymer tự nhiên nhƣ polysaccharide. GPC còn tách một hợp chất cao phân tử phức tạp thành các bộ phận cấu thành của nó - polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia [22]. Thiết bị GPC bao gồm một máy bơm để đẩy dung môi qua thiết bị, cổng phun để đƣa mẫu thử lên cột, một cột để giữ pha tĩnh, một hoặc nhiều máy dò để phát hiện các thành phần khi chúng rời khỏi cột và phần mềm để điều khiển các phần khác nhau của thiết bị và tính toán và hiển thị kết quả [23]. Mẫu tự động Dung môi Van phun Bơm Lò nhiệt Cột Bộ kit chuẩn Cảm biến Ghi và phân tích số liệu Hình 1.7. Sơ đồ khối thiết bị GPC 22 1.2.2. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR) Phƣơng pháp quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR) là một trong những kỹ thuật hữu ích nhất để nghiên cứu xác định cấu trúc polysaccharide trong thành tế bào thực vật dựa trên phân tích các đỉnh hấp thụ ở các số sóng nhất định. Phƣơng pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharide nhƣ pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển [24]. Phổ IR là một kỹ thuật dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử trong phân tử. Nói chung, phổ IR nhận đƣợc bằng cách cho tia bức xạ IR đi qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lƣợng nhất định. Năng lƣợng tại pick bất kì trong phổ hấp thụ xuất hiện tƣơng ứng với tần số dao động của một phần của phân tử mẫu [2]. Một trong các lợi thế của phổ IR là hầu nhƣ bất kỳ mẫu nào và trạng thái nào cũng có thể nghiên cứu đƣợc [5]. Kỹ thuật này cũng thể hiện hai ƣu điểm chính: lƣợng mẫu sử dụng để đo phổ nhỏ (miligam) và kết quả cho độ chính xác đáng tin cậy. Tuy nhiên, quang phổ hồng ngoại thông thƣờng đòi hỏi các thủ tục tốn nhiều công sức để thu đƣợc phổ với tỷ lệ tín hiệu / nhiễu tốt [24]. Hạn chế này đã đƣợc khắc phục với sự phát triển của kỹ thuật phổ kế IR biến đổi Fourier (đƣợc gắn với máy tính) nên chất lƣợng phổ cải thiện đáng kể và giảm bớt thời gian đo mẫu, đƣợc gọi là quang phổ FT - IR (Fourier Transform IR). Phân tích phổ hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên kết điển hình trong cấu trúc của polysaccharide: các dải sóng hấp thụ ở 820 – 850, 1220 – 1260 và 1640 – 1650 cm-1 là đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết C – O – S của nhóm sulfate ở vị trí axial, liên kết S=O của nhóm sulfate, liên kết COO- của acid uronic và các dải hấp thụ ở 3420 – 3450 và 1050 – 1070 cm-1 đƣợc gán cho dao động của liên kết O – H và C – O – C tƣơng ứng [7]. 23 Bảng 1.3: Một số nhóm đặc trƣng của phổ FT-IR của polysaccharides. Tần số (cm-1) Nhóm đặc trƣng Liên kết Chất đặc trƣng 1740 ν(C=O) Ester, pectin 1426 δ CH2 Cellulose 1371 δ CH2 Xyloglucan 1362, 1317 δ CH2 Cellulose 1243 ν(C-O) Pectin 1160 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin 1146 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin 1130 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Xyloglucan 1115 ν(C-O), ν(C-C) C-2-O-2 Cellulose 1100 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Pectin 1075 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Xyloglucan 1060 ν(C-O), ν(C-C) C-3-O-3 1042 ν(C-O), ν(C-C) Vòng 1030 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6 1015, 1000 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6 Cellulose 1019 ν(C-O), ν(C-C) C-2-C-3, C-2-O-2, C-1- O-1 Pectin 960 δ(CO) Pectin 944 δ(C-1-H) Cellulose Xyloglucan 895 Vòng Β-anomeric 833 Vòng Pectin 24 1.2.3. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là phƣơng pháp hữu hiệu trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, phổ NMR [3, 21] đƣợc thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TPP, DSS). Đặc trƣng phổ 1H- và 13C-NMR của polysaccharide đƣợc thể hiện theo Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [12]. Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các tín hiệu cộng hƣởng proton anomer với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ4,4-5,8 ppm. Nhƣ vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tƣơng đối của các tín hiệu cộng hƣởng ở vùng anomeric cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích thành phần hoá học của polysaccharide có thể phù hợp với kết quả phân tích phổ 1H-NMR. Dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1 H- 1 H NMR, các nhóm thế có thể đƣợc xác định hoặc dự đoán đƣợc sự có mặt của chúng. Tiếp theo, số lƣợng của các monosaccharide có thể đƣợc khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomeric của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC. 25 Hình 1.6. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ 13C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan 26 So với tín hiệu cộng hƣởng từ phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR thƣờng có tín hiệu yếu hơn nhƣng nó có lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide là do độ dịch chuyển hóa học (δ) trong phổ 13C-NMR đƣợc trải rộng trên thang đo (từ 0 ppm đến 200 ppm), nên đã khắc phục đƣợc hiện tƣợng chồng chéo của các tín hiệu trên phổ 1H-NMR (thang đo chỉ từ 0- 12 ppm). Thực vậy, trên phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (δ4,4 – 5,8 ppm) đƣợc tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các tín hiệu cộng hƣởng ở các vị trí nonanomeric proton (δ3,2 – 4,5 ppm) trong khi đó, trên phổ 13C-NMR, độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu anomeric carbon (δ90–110 ppm) lại tách biệt rất rõ và không hề trùng chập với các tín hiệu cộng hƣởng của các nonanomeric carbon (δ60 – 85 ppm). Với polysaccharide có nhóm de-oxygen nhƣ nhóm –CH3, tín hiệu xuất hiện tại vùng trƣờng cao hơn (δ15–20 ppm). Bảng 1.4. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose Monosacc haride H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6a C-6 H-6b -D-Glc 5,11 0,30 97,5 4.5 3.520,06 72,51,0 3,760,10 73,80,4 3,410,05 70,70,6 3,740,10 72,90,5 3,640,16 61,40,4 3,780,08 -D-Glc 4,840,46 102,92,4 3,310,05 74,11,1 3,550,07 76,31,4 3,510,13 70,41,0 3,550,09 76,01,3 3,770,05 61,51,0 3,940,05 -D-Gal 5,160,35 99,13,1 3,890,12 68,91,3 3,930,16 70,21,7 4,120,19 68,61,9 4,110,29 71,02,0 3,730,07 61,70,8 3,730,04 -D-Gal 4,680,26 103,52,4 3,530,17 71,72,1 3,800,16 73,51,7 4,080,18 67,92,0 3,740,20 75,51,1 3,740,05 61,80,7 3,740,05 27 Độ chuyển dịch hóa học của các proton anomer và carbon anomer của mỗi monosaccharide đều đƣợc nhận biết riêng, phụ thuộc vào cấu hình α hay β: tín hiệu α-proton anomer sẽ xuất hiện tại vùng có độ chuyển dịch hóa học δ5–6 ppm trong khi đó với α-proton anomer là tại vùng δ4–5 ppm; tín hiệu của α-carbon anomer xuất hiện tại vùng δ95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết α-carbon anomer xuất hiện tại vùng δ100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa thành phần acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại vùng δ170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl nhƣ C-6 trong pyranose và C-5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng trƣờng cao (δ60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C- 2, 3, 4 trong pyranose và C-2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng δ65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkxoylate (C-5 trong pyranose và C-4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía trƣờng yếu với δ5–10 ppm. Trong phân tử polysaccharide, các vị trí đƣợc thế của monosaccharide đƣợc gọi là vị trí aglycon, tƣơng ứng với nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu phổ NMR, vị trí liên kết đƣợc suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monosaccharide không thế. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharide đƣợc xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu đƣợc từ hai loại phổ HMBC và NOESY. Một cách tổng quát về độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide theo Hình 1.7 28 Hình 1.7. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide 29 1.2.4. Phƣơng pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) Hiện nay, các phƣơng pháp tán xạ là rất hữu hiệu đƣợc các nhà khoa học ứng dụng hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung dịch, nguyên tắc của các phƣơng pháp này là dựa vào đƣờng cong tán xạ, có thể biết đƣợc các thông số cấu trúc nhƣ trọng lƣợng, kích thƣớc và hình dạng của phân tử chất tan. Các quá trình tán xạ đều tuân theo phƣơng trình Bragg: =dsin Với  d và  là bƣớc sóng của tia tới, kích thƣớc của vật tán xạ và góc tán xạ. Nhƣ vậy, với góc tán xạ nhỏ thì có thể nghiên cứu đƣợc phân tử lớn. Đƣờng tán xạ phản ánh sự phụ thuộc của cƣờng độ tán xạ vào góc tán xạ. Hình 1.8. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS Phƣơng pháp SAXS với bƣớc sóng nhỏ (λ = 0,154 nm) có thể đo đƣợc các kích thƣớc của phân tử ở kích thƣớc cỡ nano, là phƣơng pháp rất hữu hiệu trong việc nghiên cứu kích thƣớc, hình dạng của các chất ở kích thƣớc nhỏ từ 1-100 nm trong dung dịch, dựa vào giá trị của bán kính từ hồi chuyển để xác định hình dạng của phân tử chất tan. Ví dụ: với phân tử chất tan có dạng hình trụ đƣờng tán xạ biểu diễn bằng phƣơng trình: 30 I(q) = exp (-q 2 R 2 gc/2) Với Rgc là bán kính hồi chuyển của mặt cắt; I(q) là cƣờng độ tán xạ và q là biên độ của vector tán xạ. Rgc đƣợc xác định bởi độ dốc của đƣờng ln(q.I(q)) và q2 – đƣợc gọi là “Guinier plot”, với điều kiện qRgc<1. 31 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu là sulfate polysaccharide chiết tách từ loài rong lục Chaetomorpha linum đƣợc thu thập từ vùng biển Nha Trang của Việt Nam. Ngoài ra sulfate polysaccharide từ loài Chaetomorpha ligustica cũng đƣợc nghiên cứu nhằm so sánh về 2 loài rong phổ biến nhất của chi này 2.2. THU THẬP VÀ XỬ LÝ RONG a) b) Hình 2.1. Hình ảnh rong Chaetomorpha linum a) và Chaetomorpha ligustica b) 32 Thu thập mẫu: Mẫu rong lục Chaetomorpha linum và Chaetomorpha ligustica đƣợc thu thập ở Nha Trang, ngày 8/3/2018. Mẫu rong nghiên cứu đƣợc định danh bởi TS. Võ Thành Trung (Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang) và đƣợc lƣu trữ tại Trung tâm các phƣơng pháp phổ và ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu rong lục sau khi thu hái đƣợc làm sạch sơ bộ bằng nƣớc biển để loại bỏ các chất bẩn cơ học, sau đó đƣợc rửa sạch và phơi trong bóng râm. Rong đƣợc sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C. Rong sau khi sấy có màu xanh lục, hơi ngả nâu. Rong khô đƣợc nghiền nhỏ và cất giữ, bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát. 2.3. CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ SULFATE POLYSACCHARIDE Quy trình chiết tách [8]: Chiết tách polysaccharide từ rong lục đƣợc thực hiện theo quy trình đã công bố: 10g bột rong khô, đƣợc xử lý với hỗn hợp MeOH-CHCl3 để loại màu và chất béo, sau đó đƣợc chiết với dung dịch HCl tại pH=6, ở nhiệt độ 85-900C trong 3h, với tỷ lệ dung môi:nguyên liệu = 30:1, lọc lấy dung dịch chiết. Bã tảo đƣợc chiết tiếp lần 2 ở điều kiện nhƣ trên. Gộp dịch chiết trong 2 lần đƣợc 800ml, rồi cô quay để giảm thể tích, ly tâm lấy dịch trong. Cô quay tiếp dịch trong thu đƣợc cho đến khi thể tích còn 100ml. Lọc qua giấy lọc, rồi cho cồn vào để tủa polysaccharide (Vcồn : Vdịch = 4 : 1). Gạn lọc rồi ly tâm lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng cồn 960 thu đƣợc polysaccharide thô. Quy trình tinh chế: Hòa tan mẫu thô thu đƣợc trong nƣớc (2%wt), thẩm tách với 10 mM EDTA sau đó cho qua cột IR-120 và IR-400J và trung hòa ngay lập tức với NaOH 1N, đông khô thu đƣợc polysaccharide. Quy trình chiết tách và tinh chế thể hiện trên sơ đồ khối nhƣ sau: 33 Quy trình chiết tách: Lọc Kết tủa Dung dịch chiết lần 1 Lọc Bã tảo Chiết Lọc 85-90 0 C trong 3h Dung dịch chiết lần 1 và lần 2 10g bột rong khô Xử lý (loại bỏ màu và chất béo) MeOH-CHCl3 Chiết 85-90 0 C trong 3h Cô quay Ly tâm Cô quay Lọc Cồn (Vcồn:Vdịch=4:1) Ly tâm Polysaccharite thô Rửa tủa bằng cồn 960 34 Quy trình tinh chế: 2.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 2.4.1. Phân tích thành phần hóa học 2.4.1.1. Phương pháp xác định thành phần hóa học của rong Phân tích độ ẩm, hàm lƣợng tro, protein thô, chất béo thô, carbohydrate theo phƣơng pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC [32]. a) ác định độ m của rong: - Nguyên tắc của phƣơng pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi nƣớc có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy, tính đƣợc độ ẩm của mẫu. - Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu vào trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ 100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lƣợng không đổi. Độ ẩm của mẫu đƣợc tính theo công thức: Hòa tan Plysaccharite thô Nƣớc (2%wt) Thẩm tách 10mM EDTA IR-120 và IR-400J Trung hòa NaOH 1N Đông khô 35 Độ ẩm (%) = khối lƣợng mẫu trƣớc sấy (g) - khối lƣợng sau sấy (g) X 100 khối lƣợng mẫu trƣớc sấy (g) b) Hàm lượng tro: - Nguyên tắc của phƣơng pháp xác định hàm lƣợng tro: Mẫu đƣợc nung ở nhiệt độ 550º - 600°C để nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, đem cân phần tro của mẫu sau khi nung và tính ra phần trăm tro có trong mẫu. - Tiến hành thí nghiệm: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung 550º – 600°C đến khối lƣợng không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến 0,0001g. Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác nhƣ trên, cho tất cả vào lò nung và nâng nhiệt độ từ từ cho đến 550º - 600°C. Nung cho đến tro trắng, nghĩa là đã loại hết các chất hữu cơ, thƣờng khoảng 6-7 giờ. Trƣờng hợp còn tro đen, lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3 đậm đặc và nung lại đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ chính xác nhƣ trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ nhƣ trên trong 30 phút rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân cho đến khối lƣợng không đổi. - Tính toán kết quả: Hàm lƣợng tro theo % đƣợc tính theo công thức: X = ((G2 - G)/(G1 - G)) × 100 Trong đó G: khối lƣợng chén (g) G1: khối lƣợng chén và mẫu trƣớc khi nung (g) G2: khối lƣợng chén và mẫu sau khi nung (g) c) Protein thô: Lƣợng nitơ có trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp micro- Kjeldahl, đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cân khoảng 2g mẫu rong khô, cho vào bình cầu 100ml, cho thêm vào 30ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10g K2SO4 và 1g CuSO4.5H2O. Hỗn hợ