Luận văn Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát - Bình Dương) bằng phương pháp RFLP - PCR

ờng vấp phải nhiều trở ngại về số lượng vật liệu di truyền cần sử dụng. Mặc dù đã có những phương pháp để làm tăng số lượng vật liệu di truyền như tạo dòng nhờ vi khuẩn, tuy nhiên các kỹ thuật này thường phức tạp và cần nhiều thời gian. Do đó, việc phát minh ra kỹ thuật PCR là một bước tiến vĩ đại trong lịch sử nghiên cứu sinh học phân tử. Năm 1985, Kary Mullis và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật PCR và đến năm 1988 thì Saiki đã hoàn thiện kỹ thuật này. Việc sử dụng enzyme Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước tiến cực kỳ quan trọng trong các thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Phương pháp PCR sẽ khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer. Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu của phản ứng PCR là phải biết được trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự hai đầu của đoạn DNA cần khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR 2.3.2.1. DNA mẫu Ưu điểm lớn nhất của phản ứng PCR là có độ nhạy cao. Kết quả phản ứng PCR tối ưu khi DNA sử dụng có độ tinh sạch cao. Mặc dù vậy phản ứng PCR cũng cho kết quả tốt đối với những mẫu thu trực tiếp mà không qua tinh sạch hay DNA thu được từ những mẫu không được bảo quản tốt, những mẫu đã bị phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003). Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả. 2.3.2.2. Primer và nhiệt độ lai Primer là yếu tố quyết định đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR. Một phản ứng PCR chuẩn gồm 2 loại primer: primer xuôi và primer ngược. Trong đó, primer xuôi bắt cặp bổ sung trên sợi sen, còn primer ngược bắt cặp trên sợi antisen của phân tử DNA mẫu. Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp ứng được những nhu cầu sau: - Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). - Thành phần các nucleotide phải cân bằng. Nếu tỉ lệ G, C cao thì số lượng nucleotide của mỗi primer sẽ giảm từ 15- 30 nu xuống còn 18 – 20 nu (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Tỉ lệ các nu sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt cặp của primer, nhiệt độ này được tính theo công thức: Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C). Đồng thời nhiệt độ bắt cặp của hai primer không cách biệt quá xa. - Trình tự được khuếch đại là trình tự DNA nằm giữa hai primer xuôi và ngược, trình tự này không được quá lớn. Phải nhỏ hơn 1 Kb đối với phản ứng PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005). - Các primer phải đặc trưng cho trình tự được khuếch đại, không bắt cặp bổ sung với nhiều trình tự trên hệ gene. Trong phản ứng PCR thì nồng độ primer khoảng 1 – 25 pM cho phản ứng 25 – 50 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.3.2.3. Enzyme Enzyme được sử dụng lần đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Tuy nhiên, hiệu quả mang lại không cao do enzyme này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao. Việc phát minh và sử dụng enzyme Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước ngoặc cực kỳ quan trọng trong các thí nghiệm về sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Enzyme Taq polymerase được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Đây là vi khuẩn sống ở suối nước nóng, vì vậy chịu được nhiệt độ cao. Enzyme Taq polymerase thu được từ vi khuẩn này cũng chịu đựng được nhiệt độ cao, đặc điểm này rất phù hợp với điều kiện của phản ứng PCR. 2.3.2.4. Mg2+ Là thành phần trong dung dịch đệm, là chất xúc tác của enzyme DNA polymerase. Do đó, Mg2+ ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Nồng độ cao hay thấp của Mg2+ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme Taq polymerase, ảnh hưởng đến quá trình tách mạch đơn của phân tử DNA. Nếu nồng độ enzyme thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme, còn nếu nồng độ cao tuy giúp mạch kép của DNA ổn định hơn nhưng lại ức chế sự biến tính hoàn toàn chuỗi DNA. Nồng độ Mg2+ ở mức quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn. Nồng độ tối ưu của Mg2+ cho từng phản ứng phải được xác định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.3.2.5. dNTPs Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR. Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M. Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.3.2.6. Số lƣợng chu kỳ Tuy về mặt lý thuyết thì số lượng chu kỳ là không giới hạn, nhưng trên thực tế thì số lượng chu kỳ thường không vượt quá 40 chu kỳ. Khi số lượng chu kỳ quá lớn thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ bị giảm theo số lượng chu kỳ. Nguyên nhân của việc giảm hiệu quả phản ứng PCR là rất nhiều, ví dụ như việc cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ… Do nhiều lý do như vậy, nên việc xác định số lượng chu kỳ phụ thuộc rất nhiều vào số lượng mẫu ban đầu. 2.3.2.7. Nhiệt độ và pH Do liên kết hydro trong phân tử DNA rất nhạy cảm với nhiệt độ nên việc xác định nhiệt độ cho phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Với mục đích biến tính DNA thì thường sử dụng nhiệt độ từ 94 – 96oC. Còn trong giai đoạn bắt cặp thì nhiệt độ thường được sử dụng là 50 – 56oC, tuy nhiên nhiệt độ này còn tùy thuộc vào đặc tính của primer (tỉ lệ G, C). Nếu tỉ lệ G, C cao thì nhiệt độ bắt cặp cũng sẽ cao theo. Ở nhiệt độ 72oC thì enzyme Taq polymerase hoạt động tốt nhất và hiệu quả kéo dài cao nhất. Trong phân tử DNA, pH ảnh hưởng đến liên kết phosphodiester. Khi môi trường có pH = 8 thì DNA sẽ ổn định nhờ sự bền vững của liên kết này. Còn nếu pH là acid thì liên kết này sẽ bị phá vỡ. Tuy nhiên, pH của phản ứng PCR có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. 2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR Yêu cầu đối với thiết bị phản ứng PCR là rất phức tạp. Các thiết bị phải chịu được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên liên tục của nhiệt độ và phải tránh được tối đa sự thoát hơi nước của phản ứng PCR. Mọi dụng cụ dùng trong phản ứng PCR phải hoàn toàn sạch để tránh tạp nhiễm. Dụng cụ phải chịu được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên nhiệt độ cũng như phải truyền nhiệt tốt… 2.3.3. Các bƣớc thực hiện một phản ứng PCR Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ đều gồm 3 giai đoạn: biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài. - Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denature). Trong giai đoạn này thì phản ứng PCR sẽ được đưa lên nhiệt độ 94 – 96oC trong thời gian 30 – 60 giây. Ở nhiệt độ này thì phân tử DNA sẽ tách thành hai chuỗi đơn. - Giai đoạn 2: Giai đoạn lai (annealing). Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 40 – 70oC, và nó tùy thuộc vào Tm của primer. Ở nhiệt độ này, các primer sẽ bắt cặp với khuôn DNA. Thời gian cho sự bắt cặp này từ 30 – 60 giây. - Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (extension). Thông thường nhiệt độ cho giai đoạn này là 72oC, đây là nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme Taq polymerase. Enzyme này sẽ giúp kéo dài mạch mới của phân tử DNA từ primer. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào chiều dài của phân tử DNA. Nhưng thường thì thay đổi từ 30 giây đến một vài phút. Trong phản ứng PCR, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn, và các chu kỳ sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi lần lặp lại như vậy thì lượng DNA sẽ tăng gấp đôi. Như vậy lượng DNA sẽ được khuếch đại theo hàm số mũ: M = m . 2 n Trong đó: M: lượng DNA sau khi khuếch đại. m: lượng DNA mẫu ban đầu. n: số chu kỳ của phản ứng PCR. 2.3.4. Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR Ưu điểm của phản ứng PCR: - Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém. - Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao. Nhược điểm của phản ứng PCR: - Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, hay chí ít cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA. - Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn 3 Kb, tốt nhất là 1 Kb. - Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả). 2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR Do có khả năng khuếch đại một lượng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên kỹ thuật PCR được áp dụng rộng rãi trên rất nhiều lĩnh vực. - Sản xuất các mẫu dò Trước khi kỹ thuật PCR ra đời, việc sản xuất các mẫu dò đòi hỏi phải qua nhiều giai đoạn phức tạp như: tạo dòng, nuôi cấy, sử dụng nick translation hay random priming…. Khi kỹ thuật PCR ra đời việc tạo mẫu dò đơn giản hơn nhiều, đồng thời có thể sản xuất một số lượng lớn mẫu dò. - Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA. - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền. - Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh Kỹ thuật PCR rất nhạy, do đó với một hay nhiều cặp primer ta có thể xác định được sinh vật gây bệnh thông qua các đặc trưng về hệ gene của chúng (Nguyễn Văn Uyển, 1995). 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 2.4.1. Sơ lƣợc về enzyme cắt giới hạn 2.4.1.1. Giới thiệu chung Enzyme cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA sợi đôi một cách đặc hiệu và lặp lại ở những trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Nó đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong phân tích hệ gene, và được xem là một công cụ không thể thiếu để thực hiện kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Trong thế giới các loài vi khuẩn, khi vi khuẩn bị thực khuẩn thể xâm nhiễm thì một số dòng vi khuẩn có khả năng tự bảo vệ mình bằng hệ thống R – M. Hệ thống này có bản chất là enzyme cắt giới hạn. Nó sẽ cắt sợi DNA tại những vị trí rất chuyên biệt trên phân tử DNA ngoại sinh nhưng nó không bao giờ cắt trên bộ gene của nó. Do đó các enzyme có đặc tính này có tên là enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease). Hệ thống R – M bảo vệ sợi DNA bằng cách làm biến đổi (modification) trong thành phần hóa học của phân tử DNA. Phân tử được gắn thêm nhóm methyl vào A hoặc C ở vị trí các enzyme cắt giới hạn. Khi vị trí A hoặc C bị methyl hóa, các enzyme cắt giới hạn sẽ không còn nhận biết được vị trí cắt này. Do vậy vi khuẩn sẽ tránh bị các enzyme RE cắt chính hệ gene của chúng. 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn Tên gọi thống nhất cho các enzyme cắt được quy định như sau: - Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE. - Hai chữ kế không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên. - Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (trong trường hợp nhiều RE cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn). Đôi khi còn sử dụng một chữ viết hoa để chỉ chủng của vi khuẩn sử dụng (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Ví dụ: Escherichia coli Ry13 và được viết tắt là EcoR. Giống Loài Chủng. Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme Trình tự 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Providencia stuartii Seratia marcesens Xanthomonas malvacearum HaeIII Sau3AI BamHI EcoRI HindIII PstI SmaI XmaI GG/CC CC/GG GATC CTAG G/GATCC CCTAG/G G/AATTC CTTAA/G A/AGCTT TTCGA/A CTGCA/G G/ACGTC CCC/GGG GGG/CCC C/CCGGG GGGCC/C (Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.4.1.3. Các loại RE Do đặc tính nhận biết và cắt DNA tại những vị trí khác nhau, người ta chia các enzyme cắt giới hạn thành 3 loại: - Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1.000 – 5.000 nu và giải phóng độ vài chục nu. - Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt luôn tại trình tự đó. - Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự đặc trưng và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nu. Tuy có 3 loại enzyme cắt giới hạn nhưng chỉ có loại 2 là được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE Ở sinh vật nhân thật, việc phân tích cả hệ gene là rất khó khăn. Do đó việc sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt nhỏ bộ gene khổng lồ là cần thiết để dễ dàng hơn trong nghiên cứu. Các nhà khoa học còn sử dụng RE trong nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập bản đồ giới hạn hay so sánh bộ gene ở các loài khác nhau bằng kỹ thuật RFLP. 2.4.2. Sơ lƣợc về phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.4.2.1. Giới thiệu chung RFLP là phương pháp sử dụng một enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt một mẫu DNA, sau đó sẽ so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di để xác định đột biến điểm hay sự khác nhau của các trình tự DNA. Khi trình tự DNA của hai cá thể hoàn toàn khác nhau về kích thước và số lượng thì khi thực hiện cắt bằng cùng một enzyme thì sẽ cho số vạch và kích thước của các vạch khác nhau. Do đó, dựa vào kích thước và số lượng band khác nhau, ta có thể xác định có sự khác nhau trong trình tự đoạn DNA nghiên cứu. 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm các bước sau: - Bước 1: Tách chiết DNA và tinh sạch DNA. - Bước 2: Cắt mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn RE. - Bước 3: Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot. Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng RFLP cần phải thực hiện một phản ứng trung gian là Southern blot (Hình 2.2). Do đó kỹ thuật này rất tốn kém và phức tạp. Hình 2.2: Mô tả phản ứng RFLP (Nguồn: 2.4.3. Sơ lƣợc về kỹ thuật RFLP – PCR Do sự phức tạp, tốn kém và khó khăn khi phải thực hiện Southern blot nên khi nghiên cứu bộ gene người ta thường thực hiện phản ứng RFLP dựa trên PCR. Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme thích hợp. Dựa vào kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt để đánh giá sự đa hình của DNA. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này không phải thiết kế probe. Đồng thời phương pháp này tạo ra ít band hơn phương pháp RFLP nguyên thủy, tạo điều kiện dễ dàng hơn trong phân tích kết quả. Quy trình thực hiện: - Tách chiết DNA. - Thực hiện PCR khuếch đại trình tự đích bằng một cặp primer thích hợp. - Xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn. - Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả. Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả. 2.5. Giới thiệu về vùng ITS Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3). Các trình tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra ribosome có chức năng tổng hợp protein. Trong các vùng này thì vùng rDNA là vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS. Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm (Nguồn: Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000): - Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR. - Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA. - PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng. Các nhà nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài, từ đó giúp xác định loài nhanh chóng. Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996). Năm 1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum. Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997). Đối với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có quan hệ di truyền gần gũi nhau. Ngoài việc sử dụng vùng ITS để phân tích cây phát sinh loài, nó còn được sử dụng với mục đích phát hiện và định danh vi sinh vật (Vandepeer và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng vùng ITS để xác định sự biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). Nazar và cộng sự (1991) đã sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát hiện và định danh nấm Verticillium albo-atrum và V. dabliae. Trong một nghiên cứu tương tự trên dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov và cộng sự (1993) đã định danh được chúng thuộc loài Verticillium. Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao. Với việc phát triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác. Năm 1996, Boysen và cộng sự đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân tích đặc tính bệnh và xác định được 3 nhóm phụ. Với các ưu điểm như vậy, vùng ITS càng ngày càng được nghiên cứu rộng rãi và phổ biến hơn. Nó là vùng đạt được kết quả nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học phân tử của nấm. 2.6. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nƣớc và ngoài nƣớc Đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola. Tuy nhiên, do là loại nấm mới bùng phát nên đa số các nghiên cứu đều là nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh, khả năng sinh độc tố cassiicoline và sự phân bố của chúng trên nhiều lãnh thổ khác nhau. Những nghiên cứu này đã làm thay đổi cách đánh giá về khả năng gây bệnh của loài nấm này. Kết quả của những nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rất rộng, đồng thời khả năng sinh độc tố cũng thay đổi rất lớn tùy thuộc vào các dòng vô tính cao su được ghi nhận (Jayashinge và cộng sự, 1998). Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C. cassiicola là chưa nhiều. Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su. Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C. cassiicola (RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này. Đa số các nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh… của chúng. Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng. Ngoài khả năng sinh độc tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose (C.K. Jayashinge, 2000). Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C. cassiicola khác nhau và đã phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền. Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm. Năm 2003, Safiah Atan và Noor Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. Kết quả là đã xếp chúng vào 2 chủng khi nghiên cứu bằng RAPD. Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu. Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP trên vùng ITS của 32 dòng nấm. Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm này thành 7 nhóm di truyền. PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian nghiên cứu Tiến hành từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu - Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam – Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương. - Nhân sinh khối nấm C. cassiicola tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. - Tiến hành ly trích DNA, chạy PCR, RFLP tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora. 3.2. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola. 2. Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS. 3. Phân tích đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola bằng kỹ thuật RFLP – PCR.. 3.3. Vật liệu và phƣơng pháp 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, giấy thấm, bông gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, máy lắc, bút lông… Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar. Thuốc nhuộm Methylene Blue. Nước cất. Cách pha môi trƣờng PGA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong. Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc. Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút. 3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…) 3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora theo các bước sau: - Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần. - Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70o rồi cấy vào môi đĩa môi trường PGA. - Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới. - Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola. Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử. 3.3.1.4. Phƣơng pháp tách đơn bào tử Sau khi phân lập được dòng nấm C. cassiicola thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: - Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm. - Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng. - Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar. - Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ. - Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA. - Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc. 3.3.1.5. Phƣơng pháp nhân sinh khối - Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA (Mục 3.3.1.1) nhưng không bỏ agar. - Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường PGA lỏng. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở 26 – 30oC). - ......................................................................................................... Sa u 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên giấy lọc tiệt trùng. Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở -20oC. 3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA của nấm 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm - Nitơ lỏng. - Phenol. - Chloroform. - Isoamyl alcohol. - Isopropanol. - Ethanol 100%, 70% - TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0. - Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% - mecaptoethanol. - Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex… 3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990). Quy trình cụ thể - Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. - Chuyển bột nghiền vào eppendorf. - Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. - Ủ ở 65oC trong 1giờ. - Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt. - Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong