Luận văn Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR-RFLP

luận văn thạc sĩ sinh họcPhân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR-RFLP Chuyên ngành: di truyền học Mã số: 62.42.70 Luận văn thạc sĩ khoa học Học viên thực hiện: Nguyễn Thị Hoa Lớp: cao học k16 Trường: ĐHSP Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Cường Viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Nội dung Mở đầu 1.Tính cấp thiết của đề tài 2.Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài * Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Chỉ thị di truyền 1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lượng ở lợn 1.3. Gen Heart-fatty acid binding protein (H-FABP) 1.4. Gen Lipin1 (Lpin1) * Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 2.2. Phương pháp nghiên cứu * Chương 3: Kết quả và thảo luận 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn 3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP 3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR-RFLP Kết luận và đề nghị Mở đầu 1.Tính cấp thiết của đề tài Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp với sản lượng thịt chiếm 80% lượng thịt được tiêu thụ và chiếm 25% giá trị sản suất nông nghiệp của Việt Nam [7]. Sự phát triển của ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáng kể trong việc nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân. Các giống lợn nội của Việt Nam rất đa dạng, chúng thích nghi với điều kiện khí hậu, nguồn thức ăn ở VN, lợn nội cho chất lượng thịt tốt, ngon khi chế biến…song nhược điểm: tăng trưởng chậm, trọng lượng thấp, thành phần mỡ nhiều, trong thịt xẻ và tỉ lệ tiêu tốn thức ăn cao. Do vậy đã có nhiều hướng nghiên cứu cải tạo giống lợn nội cho năng suất cao mà vẫn giữ được những ưu điểm trên. Trong công tác lai tao và chọn giống truyền thống còn nhiều hạn chế, để khắc phục những hạn chế đó, nhờ vào thành tựu về giải mã gen người và động vật làm sáng tỏ nhiều locus tính trạng số lượng có ý nghĩa kinh tế. Thành tựu này mở ra khả năng ứng dụng chỉ thị di truyền phân tử hỗ trợ chọn giống trong nghành nuôi lợn. Tại viện cnsh vn kết hợp với viện chăn nuôi Thụy Phương HN, trong những năm vừa qua, để cải thiện năng suất các giống lợn nội đã tiến hành lai giữa lợn thuần ngoại với lợn nội. Trong chương trình nghiên cứu này lợn ngoại là Y và lợn nội là MC. Chúng tôi xác xác định tính đa hình của một số ứng cử gen liên quan đến chất lượng thịt lợn, góp phần phát triển chỉ thị di truyền phân tử phục vụ cho công tác chọn giống chúng tôi tiến hành nghiên cứu “ Phân tích đa hình một số gen liên quan đến chất lượng thịt lợn bằng phương pháp PCR -RFLP’’. Mở đầu 2. Mục tiêu và nhiệm vụ của đề tài Mục tiêu Xác định các biến thể DNA của gen Lpin1, H-FABP liên quan đến chất lượng thịt lợn, nhằm hỗ trợ công tác chọn giống. Nhiệm vụ Phân tích đa hình gen Lpin1, H-FABP ở lợn Móng Cái và Yorshire bằng phương pháp PCR-RFLP. Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Chỉ thị di truyền (Genetic marker) Chỉ thị di truyền phân tử (genetic marker) là một gen hay một trình tự DNA đã được xác định vị trí trên nhiễm sắc thể, và có tương quan với một gen hoặc một tính trạng cụ thể. Nó được biết như một biến dị được sinh ra do đột biến hoặc do sự biến đổi vị trí trong hệ gen. Một chỉ thị di truyền có thể là một trình tự DNA ngắn như trình tự lặp lại xung quanh một base-pair hoặc một đoạn dài như minisatellites [28]. 1.1.1. Chỉ thị loại 1 (known function) Còn gọi là các ứng cử gen (candidate gene) - là những chỉ thị đối với những gen đã biết chính xác sản phẩm biểu hiện. 1.1.2. Chỉ thị loại 2 (unknown function) Là những chỉ thị nằm ngoài vùng mã hóa của gen, nó có thể nằm gần hoặc cách xa đoạn gen đã biết sản phẩm biểu hiện. Chỉ thị loại này chưa được biết sản phẩm của nó. 1.2. Ứng dụng các chỉ thị di truyền đến các tính trạng số lượng ở lợn Thời gian qua, số lượng gen và chỉ thị di truyền liên quan đến tính trạng có ý nghĩa kinh tế đã đem lại hiệu quả to lớn trong điều khiển năng suất giống lợn. Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.2.1. Nghiên cứu gen lợn ở nước ngoài Nghiên cứu này được bắt đầu từ những năm 90 ở những nước trong khối EU, Mỹ, Úc, Trung Quốc… Các vạch ghi trên bản đồ gen lợn đã nhanh chóng được tăng lên Đến tháng 1/2009 ngân hàng dữ liệu bản đồ gen lợn đã có 4928 QTLs liên quan đến 499 tính trạng khác nhau, trong đó 3711 QTLs liên quan đến tính trạng chất lượng thịt [27]. 1.2.2. Nghiên cứu gen lợn ở Việt Nam Nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này đang được quan tâm Tại viện công nghệ sinh học, viện khoa học và công nghệ Việt Nam từ năm 2001 đã hợp tác với trường đại học Stuttgart, CHLB Đức nghiên cứu đa hình gen trong một số giống lợn thuần nội Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cho thấy các giống lợn nội Việt Nam có tính di truyền cao. Tuy nhiên tần suất kiểu gen liên quan đến tốc độ sinh trưởng cao, chất lượng thịt tốt ở lợn Việt Nam là thấp. Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.3. Gen Heart- fatty acid binding protein (H-FABP) 1.3.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen H-FABP vị trí: Gen H-FABP là gen mã hóa cho protein gắn axit béo ở cơ, nằm trên nhiễm sắc thể số 6 ở lợn, tại vị trí 6q21 -> 6q26 [19], Ovilo đã xác định được gen H-FABP nằm trong khoảng giữa marker SW316 và SO228 (SW316- 3,4cM – H-FABP – 12,5cM – SO228) [39, 40]. Cấu trúc: Gồm 4 exon mã hóa lần lượt cho các đoạn polypeptit gồm 24, 58, 34, 17 aa và 3 intron có kích thước 4,2; 2,5; 1,5 kb[19] Hình 1.1. Vị trí gen mã hóa H-FABP trên nhiễm sắc thể số 6 ở lợn Chương 1: Tổng quan tài liệu Chức năng của gen H-FABP Gen H-FABP là gen mã hóa cho một protein H-FABP liên kết axit béo ở cơ, có kích thước là 15kDa. + H-FABP có mặt ở các mô có nhu cầu cao về các axit béo: mô cơ, mô tim, mô cơ xương, tuyến sữa + H-FABP là các protein nhỏ nội bào liên kết với các axit béo để vận chuyển các axit béo này qua màng tế bào chất, để cung cấp năng lượng hoặc tổng hợptriacylglycerol (TAG) hay phospholipid [62]. + Hơn thế nữa, H-FABP có thể điều chỉnh hàm lượng axit béo trong cơ và thông qua con đường này chúng điều khiển quá trình tổng hợp lipid. H-FABP và A-FABP được coi là hai ứng cử gen cho tính trạng hàm lượng mỡ ở lợn. 1.3.2. Đa hình di truyền gen H-FABP Gen H-FABP nằm trên nhiễm sắc thể số 6, chúng được giải trình tự và có 3 vị trí cắt của enzym giới hạn. Ba vị trí đa hình độ dài đoạn giới hạn đã được xác định trên trình tự gen H-FABP: điểm cắt của enzyme HaeIII tại nucleotit 1811 (G bị thay thế bằng C), điểm cắt của enzyme HaeIII nằm trên intron của gen H-FABP [19]. Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của H-FABP trong tế bào Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.4. Gen Lipin1 (Lpin1) 1.4.1. Vị trí, cấu trúc, chức năng của gen Lpin1 Vị trí: Gen Lpin1 nằm trên nst số 3, Trên nhiễm sắc thể gen Lpin1 nằm ở vị trí SW 717 (LOD = 7,55, Dics = 50cR) ( [29] Cấu trúc: Trình tự cDNA 5,559 bp thu được bằng phương pháp RT-PCR và 3’ RACE (genbank mã số 164.847 E.U) chuỗi này bao gồm: + 5’- UTR là vùng không dịch mã có kích thước 111 bp + vùng dịch mã, quy định mã hóa protein gồm 894 aa với phân tử lượng 98,83 kDa +Vùng 3’- UTR có kích thước 2763 bp [30, 37] Hình 1.4. Vị trí gen Lpin1 của lợn trên nhiễm sắc thể số 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu Chức năng phân tử của gen Lpin1 Lpin1: chức năng như enzyme trong tổng hợp Triacylglycerol (TAG) và sinh tổng hợp phospholipid. Gen Lpin1 hoạt động như một enzyme phosphatidate phosphatase (PAP), chuyển đổi phosphatidate để hình thành chất béo trung tính diacylglycerol, phosphatidylcholine, và sinh tổng hợp phosphatidylethanolamine [13]. Lpin1 là coactivator phiên mã Lpin1 trực tiếp tương tác với các thụ thể hạt nhân Peroxisome proliferator (PPARα) và coactivator-1α (PGC-1α).Dẫn đến hình thành một phiên mã gen. Hình 1.5. Chức năng phân tử của gen Lipin 1, 2, 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu Lpin1 là cần thiết cho sự phát triển của adipocytes trưởng thành. Tăng cường biểu hiện Lpin1 ở chuột biến đổi gen gây béo phì. Lpin1 trong mô mỡ ảnh hưởng tới độ nhạy cảm insulin và biểu hiện cytokine giảm viêm ở người. Lpin1 là cần thiết cho trao đổi chất bình thường giữa các mô mỡ và gan. Lpin1 và chức năng thần kinh ngoại vi .  Hình 1.6. Các loại gen Lpins: Lpin-1A, Lpin-1B, Lpin-2, Lpin-3. Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.4.2. Đa hình di truyền gen Lpin1 Kết quả nghiên cứu của Zhao và cs (3/2008) nghiên cứu trên 162 con lợn: Tong Cheng (42), Large White (25) và con lai Large White * (Landrace * Tong Cheng) (47), Landrace* (Large White * Tong Cheng) (48). Kết quả phân tích về sự lắng đọng chất béo được phân tích trong thịt. Lipid tập trung ở thịt vai, thăn, mông, mỡ lưng, xương xườn, mỡ lá.... Phân tích đa hình C93T trong exon 2 ở vị trí 93 của chuỗi mã hóa không gây ra sự thay đổi aa. Sử dụng enzyme Msp1 trên đoạn DNA được nhân lên 316 bp, độ dài đoạn cắt tương ứng là: 316 bp cho alen T, 256 bp và 60 bp cho alen C [56]. Kết quả phân tích cho thấy là kiểu gen: CC có hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt thấp hơn so với hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt của lợn có kiểu gen TT, TC. Trên đối tượng là con người, đa hình gen Lpin1 liên quan với nhiều đặc điểm trao đổi chất, hàm lượng insulin, mức độ glucose [52], quá trình trao đổi chất và ảnh hưởng đến huyết áp tâm thu. Đa hình gen Lpin1 có liên quan đến bệnh nhân tiểu đường loại 2. Một đa hình đặc biệt đáng chú ý Lpin1 gây ra một sự thay thế acid amin trong miền C-Lip và được kết hợp với statin gây ra bệnh cơ [58]. CHƯƠNG 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hoá chất và trang thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Mẫu mô tai của giống lợn Móng cái (MC, n=97) và Yorshire (Y, n=53). Được lấy từ viện chăn nuôi Thụy Phương, Hà Nội. Mẫu mô tai được bảo quản trong cồn 750, ở -200C, được sử dụng phân tích các gen trong nghiên cứu. 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất sử dụng được mua từ các hãng nổi tiếng trên thế giới. Danh mục các hoá chất đã sử dụng trong luận văn được trình bày trong bảng 2.1. Các cặp mồi trong nghiên cứu được tổng hợp bởi hãng Fermantas có trình tự như bảng 2.2. Các dung dịch và đệm đã pha chế sử dụng trong luận văn được trình bày trong bảng 2.3. 2.1.3. Máy móc, trang thiết bị Các máy móc, trang thiết bị dùng trong nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.4. CHƯƠNG 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xác định nồng độ và độ tinh sạch DNA 2.2. Phương pháp nghiên cứu Quy trình thí nghiệm được trình bày tóm tắt như sau:  CHƯƠNG 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô tai lợ Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Bước 2: Loại bỏ các thành phần không có bản chất DNA Bước 3: Tủa DNA 2.2.2. Phương pháp kiểm tra DNA bằng điện di gel agarose 2.2.3. Định lượng DNA bằng quang phổ kế 2.2.4. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Thành phần phản ứng PCR của gen H-FABP và Lpin1 ở bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR thể hiện ở bảng 2.7. 2.2.5. Phương pháp phân tích đa hình đoạn cắt giới hạn (RFLP) Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR thể hiện ở bảng 2.8. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu mô tai lợn DNA đã được tách từ 150 mẫu mô tai lợn được kiểm tra bằng 2 phương pháp là điện di và đo quang phổ. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm DNA tách chiết từ mô tai lợn Hình 3.2. Phổ hấp thụ tử ngoại của DNA của lợn Móng cái và Yorshire CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR-RFLP 3.2.1. Phân tích đoạn gen H-FABP bằng phương pháp PCR Dựa trên trình tự gen H-FABP được công bố trên ngân hàng gen GenBank- Y15180 để thiết kế cặp mồi dùng cho phản ứng PCR. Đoạn gen H-FABP được nhân lên có kích thước phù hợp với lý thuyết là 816 bp, bắt đầu từ vị trí nucleotit 1401 đến vị trí số 2216 của intron thứ 2. Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen H-FABP. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2.2. Phân tích đoạn genH-FABP bằng enzyme cắt giới hạn HaeIII Bảng 3.2. Các điểm cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP Sơ đồ vị trí cắt của enzyme HaeIII trên đoạn gen H-FABP 117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 683 bp Alen D GG CC GG CC 117 bp HaeIII 16 bp HaeIII 287 bp HaeIII 405 bp Alen d GG CC GG CC GGCC CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme HaeIII. Kết quả phân tích đa hình RFLP gen H-FABP với enzyme HaeIII thể hiện ở hình 3.4. (M: chỉ thị DNA 100 bp, 1- sản phẩm PCR; 2-5 sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP. Trong đó giếng 2- kiểu gen dd; giếng 3, 4- kiểu gen Dd; giếng 5- kiểu gen DD). Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen H-FABP bằng enzyme HaeIII CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân tích cho thấy lợn Móng Cái chỉ có kiểu gen DD và Dd, trong đó DD (99%) cao hơn nhiều kiểu gen Dd (1%). Đa hình RFLP ở gen H-FABP ở lợn Yorshire cao hơn giống lợn nội với 3 kiểu gen: DD, Dd, dd tần suất tương ứng là: 37,7%, 54,7%,7,6%. Điều này chứng tỏ rằng, tỷ lệ xảy ra đột biến ở vị trí 1811 ở lợn Móng Cái thấp hơn ở lợn Yorshire. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR- RFLP 3.3.1. Phân tích gen Lpin1 bằng phương pháp PCR Để phân tích gen Lpin1 bằng PCR-RFLP ta tiến hành nhân đoạn gen Lpin1 bằng phương pháp PCR sau đó cắt sản phẩm thu được bằng enzyme MspI. Sử dụng chu trình nhiệt và thành phần phản ứng PCR thích hợp như phần vật liệu và phương pháp, chúng tôi tiến hành nhân đoạn gen Lpin1. Theo trình tự Genbank EU 164847, đoạn gen được nhân lên có kích thước 316 bp được thể hiện ở hình 3.5. 8 7 6 5 4 3 2 1 M 500bp 316bp Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen Lpin1 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3.2. Phân tích gen Lpin1 bằng enzyme cắt giới hạn MspI Bảng 3.4. Điểm cắt của MspI ở đoạn gen Lpin1 Sơ đồ vị trí cắt của MspI trên đoạn gen Lpin1 316 bp Alen T CTGG 60 bp MspI 256 bp Alen C CCGG CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN M 1 2 3 4 5 6 7 8 500bp 316bp 256bp 60bp Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm cắt đoạn gen Lpin1 bằng enzyme MspI Kiểu gen TT, TC, CC đều xuất hiện ở Yorshire với tần số tương ứng là: 5,7%; 45,3%; 49% và ở lợn Móng Cái chỉ xuất hiện kiểu gen TC và CC với tần số tương ứng là: 15,5% và 17,5%. Như vậy kiểu gen Lpin1 ở lợn Yorshire là đa hình hơn lợn Móng Cái. (M: Chỉ thị DNA 100 bp, 1-8 sẳn phẩm cắt đoạn gen Lpin1. Trong đó: giếng 1, 2 kiểu gen TT; giếng 3, 5, 7, 8 kiểu gen TC; 4, 6 kiểu gen CC). CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả này cũng tương tự như kết quả nghiên cứu của Zhao và cs (3/2008) [56], nghiên cứu trên 162 con lợn: Tong Cheng (42), Large White (25) và con lai Large White * (Landrace * Tong Cheng) (47), Landrace* (Large White * Tong Cheng) (48). Theo kết quả nghiên cứu thì kiểu gen CC có hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt thấp hơn so với hàm lượng mỡ lá và mỡ giắt của lợn có kiểu gen TT, TC. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN Đã tách chiết DNA hệ gen từ mô tai lợn từ 53 mẫu Yorshire, và 97 mẫu Móng Cái. 150 mẫu mô tai lợn trên là một phần của bộ sưu tập mẫu, sử dụng phân tích nhiều gen khác nhau trong việc phát triển chỉ thị phân tử, hỗ trợ cho công tác chọn giống lợn lai. 2. Đã nhân đặc hiệu đoạn gen Lpin1 có kích thước 316 bp, và đoạn gen H-FABP có độ dài 816 bp. 3. Phân tích đa hình gen H-FABP bằng enzyme HaeIII RFLP cho kết quả: * Ở lợn Yorshire: + 37,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=20) +54,7% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=29) + 7,6% cá thể mang kiểu gen đồng hợp dd (n=4) * Ở lợn Móng Cái: + 99% cá thể mang kiểu gen đồng hợp DD (n=96) + 1% cá thể mang kiểu gen dị hợp Dd (n=1) + 0% cá thể mang kiểu gen đông hợp dd (n=0) 4. Phân tích đa hình gen Lpin1 bằng MspI RFLP cho kết quả: * Ở lợn Yorshire: + 5,7% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=3) + 45,3% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=24) + 49% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=26) * Ở lợn Móng Cái: + 0% cá thể mang kiểu gen đồng hợp TT (n=0) + 15,5% cá thể mang kiểu gen dị hợp TC (n=15) +74,5% cá thể mang kiểu gen đồng hợp CC (n=72) Đây là kết quả bước đầu làm cơ sở nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình . KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 2. ĐỀ NGHỊ Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi đưa ra một số đề nghị sau: * Đánh giá sự tương quan giữa kiểu gen và hàm lượng mỡ giắt dựa trên mô hình lai phân tích. * Phát triển chỉ thị phân tử gen H-FABP và Lpin1, sử dụng tiên đoán sớm chất lượng thịt của những con lợn.