Luận văn Phân tích hàm lượng và cấu trúc của hoạt chất bortezomib tổng hợp được làm nguyên liệu thuốc điều trị bệnh đa u tuỷ xương

ình triển khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi triển khai. Đậy kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi chạy đến đường giới hạn, lấy bản mỏng ra khỏi bình và sấy khô bản mỏng rồi hiện vết. Hiện vết trên bản mỏng: Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bước sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong đồ án là Ce(SO4)2). Hình 2: Các bước tiến hành sắc ký bản mỏng Hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thước 20×20 cm, dày 0,2 mm. Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dược liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao. Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, được trải mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử 6 trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 3). Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Rf. Hình 3: Cách tính giá trị Rf 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao: (High-performance liquid chromatography); viết tắt: HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp. Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký. Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột 7 . Hình 4: Sơ đồ hệ thống HPLC HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [6]. Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ. HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu. Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ. Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động". Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột. Phân tích HPLC nhanh, hiệu quả và có khả năng dò tìm lượng mẫu nhỏ đến 200pg, tách những hỗn hợp phức tạp với độ phân giải cao. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Những cơ hội áp dụng HPLC hầu như 8 không giới hạn, do đó HPLC đã trở thành một công cụ không thể thiếu trong khoa học và công nghiệp [7-11]. 1.2.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [12]. Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì: )(10. 6 ppm o xTMS      Trong đó: νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau: )(10. 6 ppm o xchuan      Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học 9 của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [13]. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [13]. Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [12]. 1.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối z = m/e. Sau đó phân tách các ion này theo số khối và ghi nhận được phổ khối lượng. Dựa vào phổ khối này có thể xác định phân tử khối và cấu tạo phân tử của chất nghiên cứu. [10,14]. Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh. Đây là một trong những thông số 10 quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau. 1.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 1.3.1 Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,) có trong mẫu thử. Phương pháp HPLC được coi là chọn lọc đối với chất phân tích nếu: Sắc ký đồ của mẫu thử cho pic có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu nền không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn [15-18]. 1.3.2 Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng biệt so với giá trị trung bình thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện. Độ chính xác cũng còn được coi là mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với giá trị trung bình [15-18]. Phương pháp xác định Độ lặp lại: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử trong miền giá trị của quy trình phân tích (3 lần phân tích/ nồng độ × 3 nồng độ) hoặc định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Yêu cầu Tiêu chuẩn cho giá trị RSD phụ thuộc nhiều vào loại phân tích mẫu phân tích. Đối với các quy trình định lượng thường quy, RSD dễ dàng đạt trên dưới 2%. Đối với phân tích các mẫu sinh học, độ chính xác ở khoảng 20% ở 11 giới hạn định lượng dưới và 15% ở các nồng độ khác cao hơn. Giá trị RSD càng nhỏ, quy trình càng có độ chính xác cao [19]. 1.3.3. Độ đúng Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy so với giá trị thực thu được khi áp dụng phương pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng một điều kiện [15-18]. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống. Phương pháp xác định Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu ba nồng độ của miền giá trị trong quy trình phân tích (3 lần phân tích/nồng độ × 3 nồng độ khác nhau). Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi được xác định theo công thức sau: Độ đúng hay tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi x 100 % Lượng hoạt chất thêm vào Trong đó: 𝑋 là giá trị mẫu đo được µ là giá trị mẫu theo lý thuyết. Yêu cầu Tỷ lệ phục hồi được chấp thuận dựa vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ phân tích. Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2% [15,16]. Tỷ lệ phục hồi càng gần giá trị 100% quy trình có độ đúng càng cao. 1.4.4. khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được như chiều cao hoặc diện tích pic (y) và nồng độ (x). Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, khoảng tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R2 [15-18] 12 Phương pháp xác định - Khoảng tuyến tính cần được khảo sát ở khoảng 10 (ít nhất 5 [16, 18] hoặc 6 [15, 17]) mức nồng độ khác nhau. - Nồng độ cao nhất và thấp nhất phải nằm trong khoảng xác định của phương pháp. Các mẫu được pha loãng từ mẫu chuẩn ban đầu. Khi thẩm định phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo ít nhất 3 lần [15].để kiểm tra độ lặp của các nồng độ chuẩn. Đánh giá khoảng tuyến tính bằng các phương pháp thống kê thích hợp: trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình Yêu cầu Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,90 ≤ R2 ≤ 1 [16]. 1.4.5. Miền giá trị Miền giá trị của một quy trình phân tích là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử với bất kì nồng độ nào trong khoảng này đều phải đáp ứng về độ chính xác lẫn độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp [15-18]. Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn còn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ [15-18]. Phương pháp xác định Khảo sát và đánh giá tính tuyến tính của một khoảng nồng độ nhất định. Sau đó thiết lập bằng cách khẳng định là khoảng này có đáp ứng độ tuyến tính có thể chấp nhận, độ đúng, độ lặp lại hay không. Yêu cầu Với quy trình định lượng nguyên liệu và thuốc, yêu cầu tối thiểu của miền giá trị là phải đạt 80% – 120% nồng độ của mẫu thử [15-18]. 13 1.4.6. Giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện (LOD) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được và không cần phải xác định chính xác hàm lượng [15-18]. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu nhỏ nhất: LOD được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn phát hiện được. - Phương pháp lập tỷ số tín hiệu phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng với quy trình có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOD là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị 2 – 3. - Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 3,3 × SD a Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn định lượng SD: độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường chuẩn định lượng. 1.4.7. Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng (LOQ) của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể định lượng với độ đúng và độ chính xác phù hợp [15-18]. Phương pháp xác định - Pha loãng nồng độ đến mức tín hiệu vẫn đáp ứng độ đúng và độ chính xác: LOQ được xác định bằng cách phân tích mẫu có hàm lượng biết trước và thiết lập mức nồng độ nhỏ nhất mà khi đó tiến hành bằng quy trình phân tích đang thẩm định vẫn định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được. 14 - Lập tỷ số phát hiện của mẫu trắng và mẫu thử: áp dụng cho phương pháp có sử dụng thiết bị và có hiện tượng nhiễu đường nền. Giả sử tín hiệu thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn là S. LOQ là nồng độ mà tại đó tỷ lệ S/N đạt giá trị khoảng 10. Phương pháp dựa trên độ lệch chuẩn và độ dốc: LOD = 10 x SD a Trong đó: a là độ dốc của đường chuẩn độ SD độ lệch chuẩn của độ đáp ứng. SD được tính bằng hai cách: dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng hoặc dựa vào đường cong chuẩn độ 15 CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ).Bột silicagel cho sắc ký cột 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silicagel đế nhôm Art. 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).Chất chuẩn bortezomib, các dung môi ACN, Axit formic để chạy sắc ký HPLC đều của hãng Merch, độ tinh khiết trên 99%. 2.1.2 Thiết bị nghiên cứu Để xác nhận cấu trúc chúng tôi tiến hành bằng các phương pháp được sử dụng trên các thiết bị sau: Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp của Anh, Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz, Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Hewlett Packard Mass Spectrometer 5989 MS hoặc LC- MSD- Trap- SL, Hệ thống HPLC - DAD 3000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ tiêm mẫu tự động. Cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3m) thiết bị xử lý tín hiệu là hệ thống máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478. 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Chuẩn bị mẫu Bortezomib tổng hợp Mẫu bortezomib tổng hợp được chuẩn bị bằng cách tiến hành tìm hiểu những ưu và nhược điểm các phương pháp nghiên cứu của một số tác giả và phương pháp tổng hợp sau: 16 - Tổng hợp bortezomib đi từ pinanediol boronic este[20]. - Tổng hợp bortezomib từ N-pyrazinoyl-L-phenylalanine[21]. - Tổng hợp bortezomib bằng phương pháp Ellman[22]. - Tổng hợp bortezomib anhydride từ pinacol 2-methylpropane-1- boronate[23]. Từ các kết quả nghiên cứu bước đầu của nhóm tác giả, nhận thấy rằng mỗi phương pháp tổng hợp bortezomib đều có ưu điểm và nhược điểm nhất định. Các phương pháp tổng hợp bortezomib đã được công bố cho thấy, để tổng hợp bortezomib phải thực hiện qua phản ứng Matteson tổng hợp muối ammoni chlorid trong điều kiện nhiệt độ rất thấp (dưới -20oC). Đây là vấn đề khó khăn khi thực hiện để nâng quy mô, hiệu suất. Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đề xuất quy trình đơn giản qua 4 bước phản ứng phù hợp với quy mô nghiên cứu tại phòng thí nghiệm và điều kiện tại Việt Nam như hinh 5.Từ đó mẫu bortezomib tổng hợp được dùng làm nguyên liệu để phân tích xác định cấu trúc và xây dựng phương pháp xác định hàm lượng. Hình 5: Sơ đồ cải tiến tổng hợp Bortezomib 17 Quy trình tổng hợp chất 2: (1R)-(S)-pinanediol 1-ammonium trifluoroacetate-3-methylbutane-l-boronate 1 (100mg, 1mmol) được hòa tan trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (60mg, 1,2 mmol), HOBt (42mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5mmol) và Boc-L-phenylalanine (70 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL), dung dịch K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước được chiết lại 2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 2 dưới dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm 2 sạch với hiệu suất phản ứng là 80%. Quy trình tổng hợp chất 3: hợp chất 2 (200mg, 1mmol) được hòa tan trong 5ml CH2Cl2 ở nhiệt độ 0oC, sau đó TFA (3mmol) được nhỏ giọt từ từ vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC trong 3h. Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm dung môi toluen, cô quay phản ứng để loại bỏ dung môi triệt để. Sản phẩm sau khi cô quay có dạng bột trắng là muối 3 (hiệu suất 90%) được sử dụng cho phản ứng tiếp theo mà không cần tinh chế. Quy trình tổng hợp chất 4: Muối ammonium chloride 3 (100mg, 1mmol) được hòa tan trong 5ml CH2Cl2, sau đó cho lần lượt tác nhân EDC.HCl (51mg, 1,2 mmol), HOBt (36mg, 1,2 mmol) và diisopropyletylamin DIPEA (0,1ml, 2,5 mmol) và pyrazine-2-carboxylic acid (27 mg, 1 mmol) vào bình phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ 0oC 12 giờ. Sau đó, loại bỏ diclometan ở áp suất thấp, thêm vào hỗn hợp phản ứng 60 ml etyl axetat. Pha hữu cơ được rửa lần lượt với nước DI (2 x 40 mL), dung dịch acid phosphoric 1% (2 x 40 mL), 18 dung dịch K2CO3 2% (2 x 40 mL), và nước muối (2 x 40 mL). Mỗi pha nước được chiết lại 2 lần bằng etyl axetat. Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất 4 dưới dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm 4 sạch với hiệu suất phản ứng là 85%. Quy trình tổng hợp hợp chất Bortezomib 5: N-(2-pyrazinecarbonyl)-L- phenylalanine-L-leucine borate 4 (100 mg, 1 mmol) được hòa tan bằng MeOH (0,4ml) trong bình cầu đáy tròn. Sau đó thêm isobutyl boronic acid (35 mg, 1,8 mmol) trong hexan (0,4ml), acid HCl 1N (0,3 ml) được nhỏ giọt từ từ vào và hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 4h. Hỗn hợp phản ứng được chia làm 2 lớp riêng biệt, sau phản ứng được chiết với hexan (30ml x 3 lần). Phân lớp MeOH cô quay loại dung môi, thêm NaOH 2N để trung hòa đến pH = 6-6,5 và được chiết bằng EtOAc (30ml x 3 lần). Pha hữu cơ sau đó được gộp lại, làm khan bằng muối natri sulfat, lọc và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được hợp chất bortezomib 5 dưới dạng chất bọt màu trắng. Sau khi tinh chế bằng cột silica gel, thu được sản phẩm bortezomib 5 (44 mg) sạch với hiệu suất phản ứng là 60%. 2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc 2.2.2.1 Phương pháp đo phổ hồng ngoại Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch ta tiến hành đem đo phổ hồng ngoại bằng cách trộn mẫu Bortezomib thật đồng đều với KBr theo tỉ lệ 1:10 hoặc 1:100 rồi ép thành viên mỏng hầu như trong suốt bằng máy ép thuỷ lực sau đó tiền hành đo phổ trên thiết bị FT-IR spectrum TWO DTGS tại phòng Hoá Dược – Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. 19 2.2.2.2 Phương pháp phổ MS Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch ta tiến hành đem đo phổ HR-MS tại Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam. 2.2.2.3 Phương pháp phổ NMR Mẫu sau khi được tiến hành kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng TLC là đã sạch ta tiến hành đo phổ 1H-NMR và 13C-NMR .Mẫu bortezomib được hoà tan trong dung môi CDCl3 sau đó cho mẫu được hoà tan vào ống NMR và tiến hành đặt đo trên máy thiết bị cộng hưởng từ hạt nhân phân giải cao tại Viện Hoá Học – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam 2.2.3 Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC 2.2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký Dựa trên cơ sở tham khảo một số tài liệu định lượng bortezomib bằng phương pháp HPLC [7,24] và có một số thay đổi nhỏ, đã chọn ra được điều kiện như sau: Pha tĩnh cột sắc ký RP-C18( kích thước cột 4,6 x 250 nm, kích thước hạt 3m), pha động Methanol:H2O:Acid formic tỉ lệ 63:37:0,1 thể tích tiêm mẫu 20 μl, tốc độ dòng 1 ml/phút, thời gian sắc ký 10 phút, nhiệt độ cột được duy trì ở 350C bước sóng 270nm. 2.2.3.2 Chuẩn bị mẫu Dung môi Acetonitril dùng làm mẫu trắng, pha dung dịch thử gốc bằng cách cân chính xác 25 mg Bortezomib vào bình định mức 50 ml tương ứng với nồng độ định lượng là 100%, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu và lắc đều.Dung dịch thử được xác định bằng cách hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 20 Để xác định dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 25 mg Bortezomib chuẩn vào bình định mức 50 ml hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi Acetonitril lắc đều. Sau đó pha dung dịch chuẩn bằng cách hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 2.2.3.3 Tính thích hợp của hệ thống Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic Bortezomib giữa các lần tiêm lặp lại ≤ 2,0 %. Lần lượt tiêm dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký. 2.2.3.4 Khoảng tuyến tính và miền giá trị Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng dung môi pha mẫu để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ Bortezomib biến thiên trong khoảng 0,025 – 0,075 mg/ml Bortezomib (tương ứng 50 – 150 % nồng độ định lượng). Tiêm các dung dịch này vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Tiến hành phân tích các mẫu, xác định phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác đinh giá trị R2. Khoảng xác định được suy ra từ kết quả độ đúng và độ tuyến tính (Từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng). 2.2.3.5 Độ đúng và khoảng xác định của phương pháp Sử dụng dung dịch chuẩn ở phần chuẩn bị mẫu ta chuẩn bị các mẫu thử sau mỗi mức nồng độ tiến hành 3 mẫu thử. + Dung dịch mẫu 80 %: Cân chính xác khoảng 20 mg Bortezomib chuẩn vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm 21 + Dung dịch mẫu 100 %: Cân chính xác khoảng 25 mg Bortezomib chuẩn vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm + Dung dịch mẫu 120 %: Cân chính xác khoảng 30 mg Bortezomib chuẩn vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 2.2.3.6 Giới hạn phát hiện và Giới hạn định lượng Giới hạn phát hiện được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn Bortezomib đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền. Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD. Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch thu được, ghi lại các sắc ký đồ và xác định RSD của diện tích píc. 2.2.3.7 Độ chính xác Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt với giá trị thực khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần. Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ đúng. Độ lặp lại: Acetonitril được sử dụng làm dung dịch chuẩn.Pha dung dịch thử bằng cách cân chính xác 25 mg mẫu bortezomib tổng hợp vào bình định mức 50 ml, hòa tan và làm vừa đủ bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, thêm dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Hàm lượng (%) của Bortezomib (C19H25BN4O4) tính theo chế phẩm đã làm khô được tính theo công thức: 22 Trong đó: ST: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch thử SC: Diện tích pic Bortezomib trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn C: Nồng độ Bortezomib trong mẫu chuẩn (mg/ml) mT: Lượng cân mẫu thử (mg) a: Hàm lượng nước trong chế phẩm (%) Tiến hành định lượng phân tích 6 mẫu bortezomib dung dịch thử độc lập.Xác định hàm lượng các hoạt chất có trong các mẫu thử theo trung bình diện tích pic Bortezomib của dung dịch chuẩn .Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) giữa giá trị các lần định lượng 2.2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu Để xử lý số liệu kết quả của các giá trị đo được qua mỗi lần đo. Dùng toán thống kê để xử lý số liệu các kết quả với phần mềm