Luận văn Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật Elisa và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR

i đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác cao (Phạm Văn Ty, 2001). Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là: - Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). - Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 11 - Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple antibody sandwich). Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đoán SCMV. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng. Quy trình các bƣớc thực hiện DAS ELISA đƣợc sơ đồ hóa nhƣ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá trị OD của các giếng ở bƣớc sóng 405 nm. Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả 12 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA. 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phƣơng pháp này do K. Mullis và ctv phát minh năm 1985 và đƣợc sử dụng rộng rãi nhất, trở thành một công cụ cần thiết trong các thí nghiệm phân tử. Năm 1993, Henson và French đã đƣa kỹ thuật PCR vào việc chẩn đoán bệnh hại thực vật và phát triển đến nay. PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzym chịu nhiệt (thƣờng dùng enzym “Taq” đƣợc chiết xuất từ vi khuẩn từ suối nƣớc nóng Thermus apquaticus), có 2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Đối với một số loại virus có cấu trúc acid nucleic là RNA nói chung và virus SCMV nói riêng thì bƣớc phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase - RT) là cần thiết để tồng hợp nên complementary DNA (cDNA) trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR. Phản RT - PCR gồm 2 quá trình: (Sơ đồ 2.2)  Quá trình reverse transcriptase (RT) 13 Để chuyển RNA thành DNA, phản ứng này dựa trên khả năng của enzyme phiên mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung (first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuôn mẫu.  Quá trình PCR Để khuyếch đại cDNA vừa tạo thành ở quá trình Reverse Transcriptase Complementary DNA đƣợc xem nhƣ DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Khởi đầu quá tình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ từ 6 - 30 nucletides). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và đƣợc enzym DNA- polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù. Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005). Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid. 14 Nhƣ vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới đƣợc tổng hợp, các sợi này sau đó đƣợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thƣờng từ 25-35 chu kỳ), tính theo lý thuyết ta có: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA định trƣớc đƣợc nhân lên với một số lƣợng rất lớn. 2.4. Bệnh cằn mía gốc 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh cằn mía gốc hiện nay đƣợc xếp vào loại bệnh có tầm quan trọng kinh tế lớn trên thế giới (Davis và Bailey, 2000). Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nó trên thế giới, sự thiếu các triệu chứng có thể nhận diện đƣợc ở cây kí chủ, thiếu các đặc tính của tác nhân gây bệnh, sự nghiên cứu về bệnh, và những chiến lƣợc cần thiết để kiểm soát bệnh có hiệu quả. Do vậy bệnh cằn mía gốc hiện đang là một trong những bệnh đang gây hậu quả nghiêm trọng cho các vùng trồng mía trên thế giới. Bệnh cằn mía gốc đƣợc phát hiện đầu tiên ở Queensland trong thời gian từ năm 1944 - 1945, lúc này trên giống mía Q28 đang trồng ngƣời ta phát hiện ra có hiện tƣợng bị hủy hoại bất thƣờng. Sau đó ngƣời ta phát hiện ra rằng RSD đã phân bố khắp vùng Queensland, và có mặt ở hầu hết các vùng trồng mía trên thế giới. 2.4.2. Triệu chứng 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài Hầu nhƣ không có triệu chứng bên ngoài có thể nhận ra đƣợc từ cây mía bị bệnh ngoại trừ sự cằn cọc và phát triển kém của cây. Tuy nhiên những đặc điểm trên đều có thể thấy đƣợc ở những vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị thiếu dinh dƣỡng. Về sự phát triển của chồi thì cây bị bệnh phát triển chậm hơn cây sạch bệnh đặc biệt là trong mùa khô khi mà các gốc mía dƣờng nhƣ không phát triển trong vài tuần hay cả khi cả tháng. Những gốc mía này thƣờng rất khỏe và không có sự bất thƣờng nào ở hệ thống rễ cũng nhƣ ở thân hay chồi ở dƣới đất. Sự cằn cỗi biểu hiện không đồng nhất giữa các chồi nhiễm bệnh, và ruộng nhiễm bệnh biểu hiện cả sự đi lên và đi xuống của sự phát triển, ngay cả khi tất cả các cây đều bị nhiễm bệnh. 15 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây Khi chẻ đôi thân cây bị nhiễm bệnh bằng một con dao sắc thì sẽ thấy ở phần dƣới các mắt mía có những chấm đổi màu hình dấu chấm hay dấu phẩy. Sự đổi màu thƣờng diễn ra từ đốt dƣới rồi mới lên đến các nốt bên trên, thƣờng định vị ở những vùng dƣới bẹ lá ngay tại vị trí của nơi xuất dịch cây. Trong vùng này là nơi phát sinh ra lá và các nhánh của các bó mạch. Sự đổi màu do RSD không diễn ra ở phẩn giữa đốt. Màu của mô nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cƣờng độ phụ thuộc vào mức độ nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nó cũng có thể khác nhau bên trong các giống. Một vài giống thì không biểu hiện các triệu chứng này. Các vùng bị biến đổi màu này rất đa dạng có thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu này thƣờng nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mô tế bào. Có trƣờng hợp bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khó có thể phân biệt trong toàn bộ đốt khi so sánh với mô của cây khỏe mạnh. Nhƣng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận lại không biểu hiện thì vẫn không chắc là nó có bị bệnh cằn mía gốc hay không. Để chẩn đoán chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây. Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt còn non, nhƣng nó diễn ra chỉ trong vài dòng mía và dƣới những điều kiện canh tác khác nhau. Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trƣởng của nốt kết cận. Phần đầu của đỉnh sinh trƣởng không liên kết với RSD. Những triệu chứng ban đầu đƣợc thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc. A B C Hình 2.6. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999). Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu trong thân cây mía bị bệnh. 16 Các triệu chứng khác xảy ra trên cây mía bị bệnh cằn mía gốc là cây còi cọc, kém phát triển hơn so với các cây cùng độ tuổi, đốt thân ngắn đƣờng kính thân nhỏ hơn so với cây mía bình thƣờng (Hình 2.6). 2.4.3. Tác nhân gây bệnh Đẩu tiên ngƣời ta cho rằng tác nhân gây bệnh là virus. Tuy nhiên Davis (1980) đã chứng minh đƣợc bệnh là do vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli gây ra khi ông nuôi cấy thành công vi khuẩn này. Vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli có kích thƣớc 0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm (đôi khi dài đến 10μm) và sinh sản theo cách thức nhân đôi. Hình dạng thẳng hay gậy mảnh, nhƣng một vài tế bào lại căn phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào. Mesosome thƣờng hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn. Gần đây vi khuẩn Clavibacter xyli subsp. xyli đƣợc phân loại trở lại sang một giống mới, là Leifsonia xyli subsp. xyli (Evtushenko, 2000) (Hình 2.7). Vi khuẩn Lxx vẫn giữ nguyên đƣợc khả năng xâm nhiễm và gây bệnh khi đã đƣợc lọc, ly tâm, qua quá trình đông lạnh và rã đông, ly tâm, điện di. Lxx có thể chữa trị đƣợc bằng cách đốt nóng và nó nhạy cảm với các dung môi hữu cơ và có ái lực ion cao đƣợc ứng dụng trong việc lọc và tinh sạch mẫu virus. Chữa trị bằng tetracycline không có hiệu quả đối với RSD, điều này có nghĩa là phytoplasma không có trong thành phần cấu tạo. Protein của Lxx điện di với gel polyacryamide giống với băng điện di của các chủng vi khuẩn nhƣ Corynebacterium michiganensis, và các tác nhân gây bệnh có chứa 2,4 - diaminobutyric acid. 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh Bệnh lây truyền giữa các ruộng mía thông qua các dụng cụ thu hoạch nhƣ dao, máy cắt mía,.v.v. do dịch chiết nƣớc mía từ cây bị bệnh vẫn còn dính trên dụng cụ khi chuyển sang ruộng khác thu hoạch. Bởi vì bệnh thƣờng khó nhận ra đƣợc bằng các triệu chứng bên ngoài nên các vi khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc gia khác thông qua các chƣơng trình trao đổi giống cây trồng. Hình 2.7. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002) 17 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế Hình hƣởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây, tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết. Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và có thể giảm đáng kể trong điều kiện đƣợc tƣới tiêu hợp lí. Bệnh trầm trọng hơn khi mía bƣớc vào vụ mía gốc do đó bệnh làm giảm tốc độ phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía. Hàm lƣợng đƣờng thƣờng không bị ảnh hƣởng ngoại trừ khi cây bị chết. 2.4.6. Kiểm soát bệnh Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trƣớc và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải làm sạch các dụng cụ thu hoạch trƣớc khi cắt sang vƣờn cây sạch bệnh. Chúng ta có thể dùng cách đốt, hay sử dụng hóa chất không lây nhiễm. Làm sạch cây giống trƣớc khi trồng ta dùng phƣơng pháp ngâm chúng trong dòng nƣớc nóng ở 52OC trong vòng 4 tiếng là có thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng. Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc. 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc bằng cách đẩy khí từ đầu này sang đầu kia của một đoạn thân cây mía và xem trực tiếp dƣới kính hiển vi (không cần nhuộm). Kết quả dƣơng tính trong chẩn đoán phụ thuộc vào kinh nghiệm của ngƣời quan sát rất nhiều, nguyên nhân ở đây là rất khó để nhận ra vi khuẩn trong dịch chiết nƣớc mía, đặc biệt là khi nồng độ của chúng trong dịch chiết thấp. 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học  Nhuộm kháng thể huỳnh quang (flourescent antibody staining) Harris và Gillaspie (1978) là những ngƣời đầu tiên đƣa ra phƣơng pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (indirect flourescent antibody technique - FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán RSD. Brlansky và ctv (1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). 18 Davis (1985) tăng độ nhạy của FAT lên 100 lần bằng kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF). Màng lọc đƣợc kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần.  Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu (Tissue Blot Enzym Immunoassay) Kỹ thuật Tissue Blot Enzym Immunoassay (TBIA) là một dạng thay đổi của kỹ thuật dot - blot assay, trong đó vi khuẩn đƣợc tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm và dính lên màng nitrocellulose (NCM). Sau đó vi khuẩn sẽ đƣợc nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dƣơng tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.  Dot Blot Assay Thu dịch chiết từ đốt mía (50 μl) trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 về thể tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80OC trong 60 phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.  Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA) Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đoán RSD. Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm. Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 350C. Sau khi ủ mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể. Phƣơng pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng với mật độ thấp hơn 105 tế bào/ml và 5.105 tế bào/trong dịch nhiễm.  Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA) Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đoán RSD và so sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật độ 5.101 tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF có khả năng phát hiện 5.10 1 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khó có khả năng thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lƣợng mẫu lớn. 19 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) Cắt chéo vào mắt mía của một cây mía trƣởng thành bị nhiễm Lxx để xử lý với dung dịch thuốc nhuộm có chứa Safranin. Quan sát sự chuyển màu bên trong thân mía: vùng chuyển thành màu đỏ là không có vi khuẩn Lxx và vùng chuyển màu vàng là có chứa vi khuẩn Lxx. 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử  Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các đầu dò DNA Chung và ctv (1994) đã sử dụng kỹ thuật lai tại vết bệnh (dot blot hybridization) với 7 đầu dò DNA đặc hiệu cho Lxx.  Kỹ thuật PCR. Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển nhằm phát hiện Lxx (Pan và các cộng sự, 1998; Taylor và các cộng sự, 2003). Mồi cho các phản ứng này đƣợc thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới  Bệnh khảm lá mía - Năm 1927, bệnh khảm virus ở Australia làm giảm năng suất khoảng 39 - 46%, thiệt hại trên giống Q28 là năng suất vụ tơ giảm 27% và ở vụ gốc giảm 67% (Koike và Gillaspie,1989). - Theo Koike và Gillaspie (1989), dòng A của virus gây bệnh khảm lần đầu tiên đƣợc phát hiện năm 1943 trên giống SP34-120 ngoài sản xuất, và cho đến nay ngƣời ta đã tìm thấy 13 dòng virus gây bệnh khảm này tại Mỹ. Trong lịch sử Hawaii là vùng bị bệnh virus tàn phá nặng nề nhất. - Theo nghiên cứu của Salomon và ctv (2000), bệnh khảm virus làm giảm năng suất mía 30 - 40% tại quốc gia này. - Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc bằng phƣơng pháp RT - PCR.  Bệnh cằn mía gốc - Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia. - Năm 1980, Davis tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx 20 - Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đoán Lxx dựa vào cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía. - Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch chiết nƣớc mía có tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là có độ nhạy cao. - Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía. - Viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR. 2.5.2. Trong nƣớc  Bệnh khảm lá mía Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nói chung và bệnh khảm lá mía nói riêng còn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực, cụ thể là: - Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm. Bệnh sau đó đƣợc công bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) - Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía, trong đó có bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phòng trừ. - Gần đây có một nghiên cứu sơ về thành phần bệnh hại trên cây mía ở vùng Đông Nam Bộ (Hà Đình Tuấn, 2004) cũng có đề cập đến sự xuất hiện không nhiều của bệnh khảm lá mía. - Trƣơng Lê Bạch Liên (2005) cũng đã thực hiện việc điều tra trên quy mô nhỏ các giống mía trồng tại TTNCMĐ và một số vùng lân cận. Kết quả chỉ ra rằng tình hình nhiễm bệnh là rất ít.  Bệnh cằn mía gốc RSD là một loại bệnh đã đƣợc phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại năng nề do RSD gây ra. Tuy nhiên tình hình nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trên cây mía của nƣớc hiện nay vẫn chƣa đƣợc chú ý đi sâu nghiên cứu nhiều. Cụ thể là: - Năm 1967 – 1986, đã có cuộc điều tra về bệnh học của cây mía ở miên Bắc và lúc này ngƣời ta phát hiện có 22 bệnh (Nguyễn Huy Ƣớc, 1999). 21 - Năm 1963 trạm thực nghiệm mía Quảng Ngãi xác đinh đƣợc 11 loại bệnh hại mía, trong đó bệnh đốm vàng và cháy lá gây thiệt hại nặng nhất. - Tổng kết của Hoàng Thị Mỹ năm 1966 thì ở khu vực phía Nam có 13 loại bệnh trên mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv, 1987). - Theo Phan Gia Tân (1999) thì có 12 loại bệnh xuất hiện phổ biến trên cây mía do tác nhân virus, vi khuẩn, và nấm và 6 loại bệnh khác do yếu tố dinh dƣỡng. - Tổng kết của Rott và ctv (2000) qua điều tra sơ bộ năm 1999, ở Việt Nam có 21 bệnh phổ biến gây hại trên cây mía. - Mới đây, ngƣời ta thống kê lại lần nữa số bệnh trên các giống mía miền Đông Nam Bộ là 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chƣa biết tác nhân và một số bệnh khác do yếu tố môi trƣờng gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). 22 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm có 2 nội dung chính sau: - Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng. - Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực. + Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. + Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy. + PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006. Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427, ROC26. 10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92, K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2. 5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực: My55-14, VN84-4137, QĐ368, VĐ85-177, VN85-1427. 3.3.2. Virus gây bệnh Virus Sugarcane Mosaic (SCMV) gây bệnh khảm lá mía. 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây bệnh cằn mía gốc. 23 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm - Các hóa chất nằm trong kít DAS-ELISA (Biorad) gồm: Dung dịch đệm li trích, dung dịch đệm cho kháng thể, kháng thể, đối chứng âm, đối chứng dƣơng, kháng thể gắn enzym, P-nitrophenyl phosphate (pNPP). - Dung dịch đệm rửa PBS- Tween. - Dầu khoáng dùng để xem kính ở độ phóng đại 1000 lần. - Hóa chất pha môi trƣờng nuôi cấy Lxx gồm: Bacto agar, pepton đậu nành, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, glucose, bovine serum albumin (BSA), cysteine, nalidixic acid, methionine. - Hóa chất cho phản ứng PCR gồm: Taq DNA polymerase, dung dịch đệm (buffer), MgCl2, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2. - Hóa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích). 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ - Cối chày, eppendorf, bình cồn, bông gòn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm. - Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại). - Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in. - Nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow). - Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sóng, máy ly tâm. - Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vô trùng (0,2 và 0,45 μm) - Máy PCR, bồn điện di, lò viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì công tác điều tra lấy mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Liên hệ bộ môn Bảo vệ thực vật và bộ môn giống ở TTNCMĐ để xác định các giống mía cần thu thập và lấy mẫu. - Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát. - Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên 24 từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5 hay hàng 2, 4, 6) (xem Sơ đồ 3.1). 5 điểm lấy mẫu theo đƣờng chéo góc H1 x x … o x H3 o x … x x H5 x x … o x Chọn ngẫu nhiên 3 cây trên 3 hàng để lấy mẫu điều tra Tại 1 điểm điều tra Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra Chú thích: H1,3,5: Hàng mía điều tra; O: Bụi được kiểm tra; X: Bụi không điều tra. - Mẫu thân mía sau đó đƣợc chiết lấy dịch bằng cách đẩy khí: 1 đoạn thân cây mía (khoảng 10 – 20 cm) đƣợc chặt ra, dùng một ống bơm đẩy dịch chiết từ đầu này sang đầu kia, thu dịch chiết cho vào eppendorf có ghi nhãn cẩn thận về mẫu nhƣ giống, tuổi cây, triệu chứng. - Mẫu lá và dịch chiết nƣớc mía đƣợc cho vào thùng xốp giữ lạnh và đem về trữ ở TTPT Đại học Nông Lâm. 3.4.6. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm Chuẩn bị chày cối (hấp nƣớc DEPC) để khô ở tủ âm trƣớc khi nghiền mẫu, pha dung dịch đệm ly trích mẫu (từ 20X xuống 1X). Khi nghiền mẫu thì cắt nhỏ mẫu ra bằng kéo (có sự vô trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ thể quy trình làm đƣợc tóm tắt ở Sơ đồ 3.2. 1 2 5 4 3 25 Mẫu lá mía Cân 0,5 g Cắt nhỏ Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml) Nghiền Cho dịch nghiền vào eppendorf Li tâm ở 4OC, 3 phút, 7000 vòng/phút Hút dịch trong chuyển sang eppendorf mới Trữ ở tủ mát 4OC Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA Chú thích: Subs: Substrate; PC: Positive control; BF: Buffer extraction; 1, 2, 3,.v.v.: Mẫu chẩn đoán; NC: Negative control 26 Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu trên đĩa, mỗi đĩa đƣợc bố trí: 2 giếng đối chứng dƣơng, 2 giếng đối chứng âm, 2 giếng dung dịch đệm (buffer), 6 giếng chứa chất nền (substrate), còn lại là các giếng chứa mẫu cần phân tích. Tuy nhiên để đảm bảo tính chính xác cao trong quá trình thực hiện phản ứng, chúng chúng tôi chỉ tiến hành vô mẫu lá phân tích trong 54 giếng (từ B3 - G11). Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 2 lần trên 2 giếng kề nhau theo chiều dọc của đĩa ELISA (Sơ đồ 3.3). 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA  Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau: -