Luận văn Phát hiện một số gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng kỹ thuật multiplex - PCR

chế lại phản ứng. + Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau. Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. Số bản mẫu 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, số bản mẫu 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40. 2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR - DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại. - Mồi (primer): Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi. Chiều dài các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai mồi “xuôi” và “ngược” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1Kb. - Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến Download» Agriviet.com 20 cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 - 720 C. - Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide triphosphate): Là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Dung dịch đệm: Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tuỳ loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phứp hợp hoà tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho emzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl2 trong hổn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Download» Agriviet.com 21 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ A B C AND KHUÔN MẪU Lặp lại n vòng Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR A : Biến tính – tách rời 2 mạch của phân tử DNA B : Ủ bắt cặp – cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với khuôn C : Kéo dài – DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp dưới sự hiện diện của 4 loại dNTP và chất đệm thích hợp Thời gian (phút) Nhiệt độ (0C) 40 50 60 70 90 100 80 1 2 3 4 5 6 Lặp lại n lần 1 chu kỳ A B C 94 – 95 0C 40 – 60 0C 72 0C Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR Download» Agriviet.com 22 2.2.4 Phân tích kết quả PCR Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng phân tử (tức là số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel agarose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng λ = 300 nm) thành vạch màu đỏ da cam. Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder). 2.3 Multiplex – PCR Multiplex - PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dùng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phản ứng. Multiplex - PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex - PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online). Download» Agriviet.com 23 Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ™ Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 01/03/2004 đến ngày 30/11/2004. ™ Địa điểm - Mẫu khảo sát được lấy từ các chợ lẻ, lò mổ, hộ - trại chăn nuôi ở TP. Hồ Chí Minh và Long An. - Việc nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại Phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản và môi trường, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. - Việc xác định các gen độc lực của E. coli được thực hiện tại Trung tâm Phân tích thí nghiệm Hóa sinh, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Nội dung - Phân lập vi khuẩn E. coli trong phân và thịt bò, heo bằng phương pháp định lượng. Từ đó đánh giá mức độ vệ sinh thực phẩm bằng cách so sánh với tiêu chuẩn Việt Nam về số lượng E. coli trên thịt tươi (TCVN 7046 - 2002). Sử dụng kỹ thuật multiplex - PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn E. coli phân lập được bằng qui trình định lượng. - Phân lập định tính vi khuẩn E. coli trong phân bê tiêu chảy, phân heo con tiêu chảy, thịt bò và thịt heo. Phát hiện các gen độc lực của E. coli đã phân lập định tính bằng kỹ thuật multiplex - PCR. Download» Agriviet.com 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn E. coli ™ Đối tượng lấy mẫu - Thịt bò, heo được lấy từ các chợ lẻ (dùng cho qui trình định lượng). - Bề mặt quày thịt bò, thịt heo được lấy trong lò mổ (dùng cho qui trình phân lập định tính). - Phân bê và phân heo con tiêu chảy được lấy từ một số trại và hộ chăn nuôi. - Phân bò và phân heo bình thường được lấy từ một số trại và hộ chăn nuôi. ™ Cách lấy và bảo quản mẫu - Mẫu thịt: Chọn ngẫu nhiên miếng thịt để lấy mẫu. Khối lượng mẫu là 50 g thịt. - Mẫu bề mặt quày thịt: Chọn ngẫu nhiên quày thịt ở giữa ca giết mổ. Dùng gạc vô trùng lau bề mặt quày thịt với tổng diện tích khoảng 200 cm2. - Mẫu phân bình thường: Dùng muỗng múc khoảng 25 g ở phần giữa cục phân gia súc mới thải. - Mẫu phân tiêu chảy: Phân được lấy từ trực tràng bằng tăm bông (± 0,1 g) rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair. Tất cả các loại mẫu sau khi lấy đều được đựng trong dụng cụ vô trùng và giữ lạnh ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ). ™ Số lượng mẫu Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy. Download» Agriviet.com 25 Số lượng mẫu khảo sát STT Đối tượng mẫu Phân lập định tính Phân lập qua định lượng 1 Thịt heo 49 23 2 Thịt bò 34 8 Bình thường 25 10 3 Phân heo Tiêu chảy 22 - Bình thường 21 10 4 Phân bò Tiêu chảy 10 - Tổng cộng 161 51 ™ Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli - Từ mẫu thịt và mẫu phân bình thường, vi khuẩn E. coli được phân lập, định lượng theo qui trình FAO (1992). - Mẫu phân bê và heo con tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường EMB hoặc MAC, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khuẩn lạc E. coli điển hình trên môi trường EMB sẽ dẹp, có màu tím ánh kim với tâm sậm màu, và trên môi trường MAC có màu hồng, tròn, lồi. - Mẫu bề mặt quày thịt (200 cm2) được làm đồng đều trong 180 ml pepton đệm phosphate và dập mẫu trong 60 giây. Bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l (FDA, 2002). Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Pha loãng canh tăng sinh 10 lần với nước sinh lý vô trùng. Hút 100 μl canh tăng sinh ở nồng độ 10-1 dàn đều lên bề mặt đĩa thạch CT-SMAC. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Vi khuẩn E. coli O157:H7 điển hình thường phát triển trên môi trường CT-SMAC tạo khuẩn lạc không màu hoặc màu xám với tâm đục. Download» Agriviet.com 26 Mẫu (thịt, phân bình thường) Làm đồng đều mẫu Pha loãng LTB (350C / 24h) EC (44,50C / 24 - 48h) EMB (350C / 24h) Thử IMVC (350C / 24h) Kết quả tổng số E. coli MAC (370C / 24h) Chọn khuẩn lạc Cấy NA (350C / 24h) LY TRÍCH DNA QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG QUI TRÌNH ĐỊNH TÍNH Mẫu phân Mẫu thịt Peptone + Cefixime (370C / 24h) CT - SMAC (370C / 24h) Chọn khuẩn lạc điển hình Chọn khuẩn lạc điển hình Làm đồng đều mẫu MULTIPLEX - PCR Sơ đồ 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn E. coli Download» Agriviet.com 27 Ghi nhận kết quả tổng số vi khuẩn E. coli có trong 1 g phân và 1 g thịt tươi. Đối với mẫu thịt, so sánh kết quả tổng số vi khuẩn E. coli với chỉ tiêu của tiêu chuẩn thịt tươi (TCVN 7046 - 2002) do Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ-BKHCN. TCVN qui định sản phẩm thịt tươi đạt TCVN có số lượng E. coli không quá 100 vi khuẩn / gam. 3.3.2 Ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được Theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E. coli của Cerna (2003) và Botteldoorn (2003), chúng tôi tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: - Chọn khoảng 20 khuẩn lạc E. coli trên môi trường thạch cho vào eppendorf đựng sẵn 1 ml nước cất 2 lần vô trùng. - Đun sôi trong 10 phút. - Chuyển ngay vào tủ –70 oC, giữ trong 10 phút. - Rã đông hoàn toàn. - Ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 3 phút. - Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu. 3.3.3 Xác định gen độc lực eae, hly, stx1, stx2, stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli phân lập được từ thịt và phân Việc phát hiện các gen độc lực của E. coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler): - Multiplex – PCR1: phát hiện các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. - Multiplex – PCR2: phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với những mẫu khảo sát. + EDL933 là đối chứng dương với các gen eaeA, hlyA, stx1, stx2. + H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I. Download» Agriviet.com 28 Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Trường Đại học Thú y Toulouse (Pháp). ™ Số mẫu xét nghiệm các gen độc lực của E. coli Mẫu E. coli phân lập được Số mẫu thực hiện PCR Phương pháp phân lập Đối tượng mẫu Multiplex – PCR1 Multiplex – PCR2 Phân bò 10 10 Phân bình thường Phân heo 10 10 Thịt bò 8 8 ĐỊNH LƯỢNG Thịt Thịt heo 23 23 Phân bê 10 10 Phân tiêu chảy Phân heo con 22 22 Phân bò 21 21 Phân bình thường Phân heo 25 25 Thịt bò 34 34 ĐỊNH TÍNH Thịt Thịt heo 49 49 TỔNG CỘNG 212 212 ™ Multiplex – PCR1 * Trình tự các primer được sử dụng trong multiplex – PCR1: Gen độc lực Primer Trình tự primer (5’ → 3’) Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp) stx1 Stx1-F Stx1-R ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC AGAACGCCCACTGAGATCATC 180 stx2 Stx2-F Stx2-R GGCACTGTCTGAAACTGCTCC TCGCCAGTTATCTGACATTCTG 255 eaeA EaeA-F EaeA-R GACCCGGCACAAGCATAAGC CCACCTGCAGCAACAAGAGG 384 hlyA HlyA-F HlyA-R GCATCATCAAGCGTACGTTCC AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT 534 (Dẫn liệu của Paton và Paton, 1998) Download» Agriviet.com 29 * Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR: STT Thành phần Nồng độ 1 PCR Buffer 1 X 2 MgCl2 2 mM 3 dNTPs 200 μM 4 Mồi Stx1-F 250 nM Stx1-R 250 nM Stx2-F 250 nM Stx2-R 250 nM EaeA-F 250 nM EaeA-R 250 nM HlyA-F 250 nM HlyA-R 250 nM 5 Taq - polymerase 0,5 UI 6 DNA khuôn mẫu 1 μl 7 Nước cất 2 lần Vừa đủ 50 μl * Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998): Bước 1 Bước 3 95 oC / 1 phút 95 oC / 1 phút 65 oC / 2 phút 63 oC / 2 phút 72 oC / 1,5 phút 72 oC / 1,5 phút Bước 2 Bước 4 95 oC / 1 phút 95 oC / 1 phút 64 oC / 2 phút 62 oC / 2 phút 72 oC / 1,5 phút 72 oC / 1,5 phút 10 chu kỳ 1 chu kỳ 1 chu kỳ 1 chu kỳ Download» Agriviet.com 30 Bước 5 Bước 7 95 oC / 1 phút 95 oC / 1 phút 61 oC / 2 phút 60 oC / 2 phút 72 oC / 1,5 phút 72 oC / 2,5 phút Bước 6 95 oC / 1 phút 60 oC / 2 phút 72 oC / 1,5 phút ™ Multiplex – PCR2 * Trình tự các primer được sử dụng trong multiplex – PCR2: Gen độc lực Primer Trình tự primer (5’ → 3’) Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp) lt-I LT-F LT-R GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC 696 sta STa-F STa-R TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC 147 stb STb-F STb-R ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC 172 stx2e Stx2e-F Stx2e-R CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA 230 (Dẫn liệu Blanco và ctv, 1997) 1 chu kỳ 10 chu kỳ 11 chu kỳ Download» Agriviet.com 31 * Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2: STT Thành phần Nồng độ 1 PCR Buffer 1 X 2 MgCl2 1,5 mM 3 dNTPs 200 μM 4 Mồi Stx2e-F 225 ng Stx2e-R 225 ng STa-F 150 ng STa-R 150 ng STb-F 45 ng STb-R 45 ng LT-I-F 150 ng LT-I-R 150 ng 5 Taq - polymerase 0,5 UI 6 DNA khuôn mẫu 3 μl 7 Nước cất 2 lần Vừa đủ 50 μl * Chu trình nhiệt trong phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002): 94 oC / 5 phút 94 oC / 45 giây 52 oC / 45 giây 72 oC / 1 phút 72 oC / 10 phút 3.3.4 Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di Sau phản ứng multiplex - PCR, 10 μl sản phẩm PCR + 2 μl loading dye được điện di trên gel agarose 1,5% trong TBE. Thang ladder cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di là 35 – 40 phút ở 100 V và 250 mA. Gel điện di được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidium bromide 1 mg/ml TBE. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng 25 chu kỳ Download» Agriviet.com 32 máy chụp gel (phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các băng DNA được xác định bằng cách so với các băng của đối chứng dương và thang ladder 100 bp (AB gene, UK). Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR1 EDL933: đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hly); 1, 2, 4, 5, 6 là các mẫu xét nghiệm. Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR2 H44: đối chứng dương (lt-I, stb, stx2e); Lad:thang chuẩn; 1, 4, 5, 6 là các mẫu xét nghiệm 1 2 EDL 4 5 6 993 534 bp (hly) 255 bp (stx2) 384 bp (eae) 180 bp (stx1) 1 H44 Lad 4 5 6 500 bp 230 bp (stx2e) 696 bp (lt-I) 172 bp (stb) Download» Agriviet.com 33 Chương 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 4.1 Tổng số vi khuẩn E. coli và kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân và thịt bò, heo bằng qui trình định lượng Xác định tổng số vi khuẩn E. coli của 10 mẫu phân bò bình thường, 10 mẫu phân heo bình thường, 8 mẫu thịt bò và 23 mẫu thịt heo theo qui trình định lượng, kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn E. coli trong phân và thịt bò, heo Đối tượng mẫu Số mẫu Tổng số E. coli (X ± SE) (MPN/g) Kết quả phát hiện gen độc lực Phân bò 10 9,5*106 ± 7,4*106 Không phát hiện PHÂN Phân heo 10 102*106 ± 46,3*106 Không phát hiện Thịt bò 8 14,8*104 ± 4,2*104 Không phát hiện THỊT Thịt heo 23 0,4*104 ± 1,1*104 Không phát hiện E. coli là vi khuẩn thuộc nhóm coliforms sống thường trực và chiếm ưu thế trong đường ruột của người và gia súc, theo phân phát tán vào môi trường bên ngoài. Số lượng E. coli trong phân biến thiên giữa các loài. Ngoài ra số lượng E. coli còn phụ thuộc vào lứa tuổi, tình trạng tiêu chảy, cách chăm sóc quản lý, tình trạng sinh lý của cá thể… Kết quả xác định tổng số E. coli trong phân bò và phân heo trong 20 mẫu phân của khảo sát này cho thấy tổng số vi khuẩn E. coli trong phân bò tương đối thấp hơn Download» Agriviet.com 34 trong phân heo. Paton và Paton (1998) khẳng định E. coli trong phân chính là nguồn vấy nhiễm quan trọng xâm nhập vào sản phẩm thịt trong quá trình giết mổ, chế biến thịt; và theo Keel và Parmelee (1968), E. coli được xem là chỉ tiêu chắc chắn để đánh giá mức độ vấy nhiễâm phân vào thịt (dẫn liệu Doyle và Padhye, 1989). Thật vậy, trong quá trình giết mổ, E. coli từ phân dễ dàng vấy nhiễm nền sàn, dụng cụ giết mổ, nước sử dụng, phương tiện vận chuyển… Do đó nếu qui trình giết mổ gia súc, vận chuyển và phân phối thịt không tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện vệ sinh thì nguy cơ vấy nhiễm E. coli từ phân vào thịt càng tăng. Chúng tôi đã tiến hành định lượng tổng số vi khuẩn E. coli theo qui trình định lượng của FAO (1992) cho 8 mẫu thịt bò và 23 mẫu thịt heo thu thập từ các chợ lẻ (bảng 4.1). Kết quả định lượng cho thấy tổng số vi khuẩn E. coli trung bình trên thịt bò là 14,8*104 ± 4,2*104 MPN/g biến thiên từ 1,1*104 đến 35*104 MPN/g. So sánh với tiêu chuẩn TCVN 7046 – 2002 qui định số vi khuẩn E. coli trên 1 gam thịt tươi không quá 100 vi khuẩn thì trong tổng số 8 mẫu khảo sát, không có mẫu thịt bò nào đạt TCVN. Tổng số E. coli trung bình trên thịt heo là 0,4*104 ± 1,1*104 MPN/g, biến thiên từ 0,4*102 đến 4,5*104 MPN/g. Trong tổng số 23 mẫu thịt heo khảo sát thì có 6/23 mẫu đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu E. coli (chiếm tỉ lệ 26,1%). Tổng số E. coli trung bình trên 1 gam thịt heo tương đối thấp hơn trên thịt bò mặc dù số lượng E. coli trung bình trên 1 gam phân heo cao hơn trên phân bò. Điều này có thể là do sự khác nhau trong cách giết mổ, vận chuyển và bày bán. Bò được giết mổ khô, hoàn toàn không được rửa nước trong suốt quá trình giết mổ. Thịt bò được công nhân giết mổ pha lọc tại lò mổ và vận chuyển đến chợ lẻ bằng các phương tiện thô sơ. Trong khi đó, trong quá trình giết mổ heo, quày thịt heo được rửa thường xuyên và nửa Download» Agriviet.com 35 thân thịt được vận chuyển đến chợ lẻ rồi mới pha lọc, ngoài ra người bán thịt cũng thường cạo sạch bề mặt thịt trước khi pha lọc, do đó thịt heo hạn chế được sự vấy nhiễm tại lò mổ, dẫn đến số lượng E. coli trên thịt heo ít hơn trên thịt bò. Mặc dù số lượng E. coli trong các mẫu phân bò, heo là rất cao, kể cả E. coli trên thịt bò, heo. Tuy nhiên với 51 mẫu E. coli phân lập được từ phân và thịt theo qui trình định lượng nhưng chúng tôi đều không phát hiện được gen độc lực bằng kỹ thuật multiplex - PCR. Lưu ý rằng trong qui trình định lượng, E. coli được tăng sinh chọn lọc trong môi trường EC ở 44,5oC trong 24 giờ. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng ở nhiệt độ cao (≥ 44oC) những chủng E. coli gây bệnh phát triển yếu dần, còn những chủng E. coli cộng sinh (flora) phát triển nhanh hơn. Ngoài ra Hill và Carlisle còn ghi nhận rằng nếu tăng sinh trong môi trường ở 44,5oC có thể làm mất plasmide mã hóa những yếu tố độc lực và làm giảm số lượng những dòng E. coli gây bệnh có trong thực phẩm (theo dẫn liệu của Doyle và Padhye, 1989) Cũng theo dẫn liệu của Doyle và Padhye (1989), nhằm đánh giá khả năng phát hiện các E. coli gây bệnh có trong thực phẩm theo qui trình của FDA, một nghiên cứu khác của Hill và các cộng tác viên nhận thấy rằng mỗi loại thực phẩm bán lẻ có khoảng 4,7 dòng E. coli khác nhau, nhưng sau quá trình tăng sinh trong EC ở 44,50C thì 30% chủng E. coli không thể phát hiện được (không sinh gas sau 48 giờ), những E. coli tồn tại được trong quá trình tăng sinh có khoảng 20 – 95% E. coli tạo độc tố LT bị mất plasmide. Như vậy quá trình tăng sinh theo qui trình của FDA thì không thích hợp cho việc phát hiện có hiệu quả và đáng tin cậy đối với những dòng E. coli gây bệnh có trong thực phẩm. Thí nghiệm giảm nhiệt độ tăng sinh (< 44oC) trong quá trình phân lập E. coli theo qui trình của FDA lại cho thấy việc giảm tính Download» Agriviet.com 36 chọn lọc của môi trường do có quá nhiều vi khuẩn khác trong canh tăng sinh phát triển lấn át vi khuẩn E. coli gây bệnh. Từ những lý do trên, chúng tôi cho rằng ưu điểm của phương pháp phân lập E. coli theo qui trình định lượng có thể xác định được tổng số vi khuẩn E. coli trong mẫu khảo sát, nhưng E. coli phân lập được hoàn toàn không bao gồm những chủng E. coli gây bệnh (do không thể vượt qua giai đoạn tăng sinh ở nhiệt độ 44,5oC), đặc biệt là nhóm EHEC với thành viên đặc trưng là O157:H7 – tác nhân gây ngộ độc thực phẩm được quan tâm hàng đầu. Đây có lẽ là lý do ảnh hưởng đến kết quả không phát hiện được các gen độc lực của E. coli thu thập từ qui trình định lượng. Do vậy tổng số vi khuẩn E. coli xác định được bằng qui trình định lượng chỉ phản ánh mức độ vấy nhiễm E. coli vào thực phẩm nhưng không thích hợp cho việc phát hiện các gen độc lực. 4.2 Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy và phân heo con tiêu chảy Nhằm bước đầu thử nghiệm qui trình phân lập định tính và qui trình phát hiện các gen độc lực của E. coli, chúng tôi chọn 2 đối tượng có khả năng phát hiện các dòng E. coli gây bệnh cao nhất là phân bê tiêu chảy và phân heo con tiêu chảy để khảo sát. ™ Ở phân bê tiêu chảy Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ 10 mẫu phân bê tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.2. Download» Agriviet.com 37 Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli trong phân bê tiêu chảy Gen độc lực Mẫu eae hly stx1 stx2 stx2e sta stb lt-1 1 - - + - - - - - 2 + - + - - - - - 3 - - - - - - - - 4 - - - - - - - - 5 + + + + - - - - 6 - + + - - - - - 7 - - - - - - 8 + + - + - - - - 9 - - - - - - + - 10 - - - - - - + - Cộng 3 3 4 2 0 0 2 0 Tỷ lệ (%) 30,0 30,0 40,0 20,0 0 0 20,0 0 Trong tổng số 10 mẫu E. coli phân lập từ phân bê tiêu chảy, có 7/10 mẫu (70%) phát hiện có gen độc lực, bao gồm: - 5/10 mẫu (50%)phát hiện được gen stx (stx1 hoặc/và stx2) - 3/10 mẫu (30%) phát hiện được gen eae - 3/10 mẫu (30%) phát hiện được gen hly - 2/10 mẫu (20%) phát hiện được gen stb Như vậy với 10 mẫu E. coli từ phân bê tiêu chảy, có 7/10 mẫu (70%) phát hiện được ít nhất 1 gen độc lực, có mẫu phát hiện được 3 – 4 gen độc Download» Agriviet.com 38 lực. Gen stx được phát hiện với tỉ lệ cao nhất (5/10 mẫu – 50%). Smith (1988) và Gyles (1992) cho rằng nhiều loài gia súc mang STEC không có biểu hiện triệu chứng, một vài dòng STEC có khả năng gây tiêu chảy cho bò, đặc biệt là bê. Trong 5 mẫu E. coli của phân bê tiêu chảy mang gen stx, có 3 mẫu đồng thời mang gen eae và 3 mẫu đồng thời mang gen hly. Theo Barrett (1992), độc tố Stx là điều kiện cần chứ chưa phải là điều kiện đủ để gây bệnh tiêu chảy. Do đó sự xuất hiện đồng thời các gen eae, hly với các gen s