Luận văn Phát hiện người mang gen bệnh tăng sản thượng thận thể thiếu enzym 21 - Hyroxylase bằng kỹ thuật mlpa

khác. Tần xuất người mang gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là 1/60 tùy thuộc vào chủng tộc. Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có cả hai đột biến về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nên xác xuất xảy ra vô cùng nhỏ. Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả năng sinh con bị bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể [3],[19],[32]. 2.3. Biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng của người mang gen dị hợp tử Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử chứa các đột biến gen CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng thận cao hơn những người bình thường không mang gen [19], [26]. Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét định lượng nồng độ 17- OHP, testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21A2. Trong đó, nồng độ 17-OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất để tổng hợp enzym 21- OH nên giá trị 17- OHP tăng sớm và tăng cao ở trên bệnh nhân và người mang gen, người ta còn ứng dụng giá trị này để làm sàng lọc chẩn đoán sớm bệnh ở các nước phát triển [1]. 2.4. Phát hiện người lành mang gen bệnh Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện không biểu hiện tính trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Định lượng 17- OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh, với 17- OHP 300 - 1499 ng/ml được chứng minh là dị hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000). Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng cách phân loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu 21-OH hoặc người lành mang gen với độ tin cậy cao [4], [19]. Nồng độ 17-OHP sau nghiệp pháp kích thích ACTH Nồng độ 17-OHP ng/dl Hình 1.6. Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [36]. Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để quản lý người mang gen và người bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn trong cùng dòng họ cũng như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa người mang gen bệnh với người bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn giữa các đối tượng có nguy cơ cao thì cần phải được tư vấn, quản lý thai nghén về phương diện di truyền và làm sàng lọc sơ sinh [4]. 3. CHẨN ĐOÁN BỆNH TSTTBS 3.1. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng 3.1.1. Chẩn đoán xác định - Định lượng 3 sản phẩm cuối cùng của hormon vỏ thượng thận: Aldosteron, cortisol, và testosteron; 3 chất chuyển hóa trong nước tiểu là 17- CS, 17- OHCS, pregnanetriol. Các xét nghiệm này không đặc hiệu bởi vì những thay đổi nồng độ các chất chuyển hóa trên có thể gặp trong u tuyến yên và u vỏ thượng thận [27], [28]. - Định lượng 17- OHP: 17- OHP là chỉ số đặc trưng để chẩn đoán TSTTBS do thiếu enzym 21- OH và tăng nồng độ trong máu hoặc tăng nồng độ qua nghiệm pháp ACTH [28]. Chẩn đoán TSTTBS sớm trong giai đoạn sơ sinh: + Trẻ sơ sinh có triệu chứng nôn nhiều, nhất là từ 2- 3 tuần tuổi. + Trẻ có bộ phận sinh dục ngoài không rõ ràng, không sờ thấy tinh hoàn. + Điện giải đồ: natri máu giảm, kali máu tăng. + Nồng độ 17- OH tăng. Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ lớn: + Trẻ trai 2-3 tuổi có các dấu hiệu dậy thì sớm giả, dương vật phát triển nhanh. + Trẻ gái 2-3 tuổi có âm vật phì đại nhanh như dương vật, không có tinh hoàn. + Cả 2 giới: Chiều cao tăng nhanh, có lông mu, trứng cá, phát triển cơ bắp. + Xét nghiệm: Định lượng 17- OHP tăng cao, testosteron tăng, FSH và LH giảm. + Xét nghiệm nhiễm sắc thể để xác định giới tính. 3.1.2. Chẩn đoán phân biệt - Dậy thì sớm thật đồng giới, trẻ trai có tinh hoàn phát triển cùng với dương vật, thể tích tinh hoàn > 4 ml. Nồng độ FSH và LH tăng cao, không có các rối loạn hormon khác. - Dậy thì sớm giả khác giới ở trẻ gái do u thượng thận nam hóa (Carcinome). U thường lớn 3- 6 cm. Phát hiện u nhờ các chẩn đoán hình ảnh. 17- CS nước tiểu tăng cao. Dehydroepiandosterone (DHEA) huyết tương tăng. 17- OHP máu không tăng. Khi làm test ức chế bằng dexamethason, nồng độ DHEA huyết tương và nồng độ 17- CS niệu đều không giảm, giúp chẩn đoán phân biệt với TSTTBS [28]. - U buồng trứng gây nam hóa: Ít gặp, DHEA huyết tương và 17- CS niệu không tăng. - Buồng trứng đa nang: Nguyên nhân thường gặp nhất do tăng tiết androgen do buồng trứng, triệu chứng nam hóa ít gặp. Hay gặp nhất là triệu chứng rậm lông, bệnh nhân có thể mập phì, tăng insulin máu, rối loạn dung nạp glucose. FSH và LH tăng, testosterol tăng ít, andostenedion huyết tương tăng cao [28]. * Các đối tượng cần được xác định người mang gen, tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS: + Những bà mẹ đã được phát hiện là dị hợp tử mang gen đột biến CYP21A2 khi mang thai cần được chẩn đoán trước sinh. + Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH có thai cần thiết chẩn đoán trước sinh. + Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại có cô, chú, bác ruột, cậu ruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trước sinh. + Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi. 3.2. Các phương pháp sinh học phân tử phát hiện đột biến gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS 3.2.1. Kỹ thuật PCR Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Enzym Taq polymerase (DNA ployme chịu nhiệt) dùng các đoạn mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi DNA mới bổ sung và cần phải có các mồi oligonucleotid để khởi đầu quá trình tổng hợp. Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 giai đoạn khác biệt nhau và điều hòa bởi nhiệt độ: - Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút. - Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp dưới nhiệt độ nóng chảy Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn DNA khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Trong quá trình gắn mồi, enzym DNA polymerase bền với nhiệt sẽ được hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo mồi, thường nhiệt độ khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc vào kích thước và Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút. - Giai đoạn 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi đôi mới được tạo thành sẽ tiếp tục được dùng làm DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong các chu kỳ tiếp theo. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [13]. Giống như nhiều bệnh lý di truyền, PCR được sử dụng rộng rãi để khuếch đại gen CYP21A2 xác định các đột biến xoá đoạn và phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác để xác định đột biến đặc hiệu. Tuy nhiên do gen giả CYP21A2P có tính tương đồng cao với gen thật CYP21A2 nên việc khuếch đại gen CYP21A2 không dễ thực hiện do đó việc thiết kế mồi phải có trình tự đặc hiệu với gen CYP21A2 mà không đặc hiệu CYP21A2P [22]. Hình 1.7. Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR 3.2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA Sequencing) Đoạn DNA cần giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi. Hỗn hợp của cả deoxynucleotid và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp. Sự gắn các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau. Nucleotid tận cùng trên các sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy đồng thời 4 phản ứng riêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại dideoxynucleotid (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang đặc hiệu khác nhau. Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phân tách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn DNA kém nhau 1 nucleotid. Trình tự các nucleotid được xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loại dideoxynucleotid [12]. 3.2.3. Kỹ thuật Souther blot Souther blot là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện đột biến xóa đoạn gen lớn, đột biến lặp đoạn Đây là phương pháp mất nhiều thời gian và công sức nhưng lại rất hiệu quả. Các đoạn dò DNA đặc hiệu được sử dụng để phát hiện đoạn gen CYP21A2 sau khi DNA được cắt bằng enzym giới hạn, điện di trên gel agarose và được biến tính trên màng nilon hay nitrocellulose, màng đã được lai với đầu dò được xác định nhờ film có độ nhạy đặc biệt với phóng xạ. So sánh kết quả lai giữa người bình thường và người bệnh để có thể xác định được vị trí đột biến [12], [13]. 3.2.4. Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Aplification) Nguyên tắc của MLPA là sử dụng các đoạn dò DNA (probe) có khả năng lai đặc hiệu với các phân tử DNA đích. Mỗi probe gồm 2 chuỗi oligonucleotid dài và ngắn [32]. + Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn: · Đoạn 1 có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích và sẽ lai với DNA đích khi tiến hành phản ứng lai. Đoạn này có khoảng 21¸30 nucleotid nằm ở đầu 3’ của probe. · Đoạn 2 nằm ở đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid. Trình tự nucleotid của đoạn này giống nhau cho các probe. Đây là vị trí gắn với mồi Y để khuếch đại probe khi tiến hành phản ứng PCR [32]. Hình 1.8. Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA + Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn: · Đoạn 1’ chứa 25 ¸ 43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ở đầu tận 5’. · Đoạn 2’ gồm 36 nucleotid ở đầu 3’, trình tự nucleotid giống nhau cho các probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe. · Đoạn 3’ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1’ và 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid không đặc hiệu với DNA đích nên nó không gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau. Do đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽ được phân tách bằng điện di. Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình thường, chạy song song cùng mẫu bệnh nhân để so sánh [32]. Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó [32]. Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với các đột biến mất đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Vị trí và kích thước của các probe được mô tả như bảng 1.3. Bảng 1.3. Tên, kích thước và vị trí của các sản phẩm PCR trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) STT Tên probe Vị trí của probe trên gen Kích thước (bp) 1 X-fragment X chromosome 100 2 C4B probe 02357-L02586 C4B Exon 19 154 3 CYP21A2 probe 01974-L01507 Exon 3 172 4 C4A probe 04802-L04177 C4A Exon 26 178 5 CYP21A2 probe 04804-L04179 Exon 1 202 6 CYP21A2 probe 01975-L01508 Exon 4 210 7 CYP21A2 probe 01976-L01509 Exon 6 229 8 UTY probe 01071-L00464 Yq11 240 9 CYP21A1P probe 04805-L04180 5’ exon 1 265 10 CYP21A2 probe 05477-L04895 Exon 8 283 11 CYP21A1P probe 04807-L04182 Exon 10 352 12 CYP21A1P probe 04806-L04181 Intron 2 382 Ex 1 Hình 1.9. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 Chú thích: Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các probe tương ứng với các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các probe tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là probe tương ứng với gen C4A, C4B. Hình 1.10. Hình ảnh minh họa kết quả MLPA Chú thích: Trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái sang phải. Trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của các đỉnh. Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn khi không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xóa đoạn và là người lành mang gen bệnh khi chiều cao đỉnh bằng ½ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng. Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2. E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P. C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B. Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y. CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase được chẩn đoán và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương; các thành viên trong gia đình bệnh nhân bao gồm bố, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân. Tiêu chuẩn chẩn đoán: Bệnh nhân có biểu hiện mất muối, mất nước từ nhẹ đến nặng, Na+ giảm và K+ tăng; biểu hiện mơ hồ giới tính sau sinh ở trẻ gái và dậy thì sớm ở trẻ trai. Nồng độ 17- OH tăng trên 10.000 ng/dl ở thể cổ điển và tăng từ 200-10.000 ng/dl ở thể không cổ điển [2] [28]. Tất cả các thành viên trong gia đình gồm: Cha, mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân được khám xét lâm sàng theo phương pháp mô tả, tư vấn để tiến hành xét nghiệm phát hiện đột biến gen CYP21A2. 2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA). Pipet, đầu côn các loại dùng cho kỹ thuật sinh học phân tử. Tủ lạnh sâu: -30°C; -80°C (SANYO). Máy điện di: Mupid (Nhật Bản). Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA). Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Eppendorf (Đức). Lò vi sóng. Máy giải trình tự gen ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Hoa Kỳ). 2.2.2. Hoá chất Hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử như để tách chiết DNA, điện di DNA được cung cấp từ hãng invitrogen). Hóa chất để thực hiện phản ứng MLPA: - SALSA MLPA Kit P050- B2- CAH. - Hãng MRC - Holland, Amsterdam, HàLan. - Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland): Kit này gồm các Probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21 gọi là P050- B2. - Thành phần hóa chất: SALSA MLPA Buffer: KCl, Tris- HCl, EDTA và PEG- 6000, pH 8,5 SALSA Ligase- 65: Glycerol, BRIJ 0,05%, EDTA, KCl, Tris- HCl, Beta-Mercaptoethanol 0.1%, pH 7,5, Ligase- 65 enzyme (từ vi khuẩn). Ligase buffer A: NAD (nguồn gốc vi khuẩn), pH 3,5 Ligase buffer B: Tris- HCl, non- ionic detergents, MgCl2, pH 8,5 SALSA PCR Primer Mix: Chứa oligonucleotides tổng hợp có gắn huỳnh quang Cy5, dNTPs, Tris- HCl, KCl, EDTA, BRIJ 0.04%, pH 8,0 SALSA Polymerase: Glycerol, BRIJ 0,5%, EDTA, DTT 0,1%, KCl, Tris- HCl, Polymerase enzyme (nguồngốc vi khuẩn), pH 7,5 Probemix: Chứa oligonucleotides tổng hợp, oligonucleotides tinh chế từ vi khuẩn, Tris- HCl, EDTA, pH 8,0 Bảo quản: Hóa chất được bảo quản ở nhiệtđộ -250C đến -150C, bảo quản trong hộp và tránh ánh sáng. Thành phần hỗn hợp probe (probemix): Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho exon 1, 3, 4, 6 và 8 của gene CYP21A2, tương đương với các đột biến mất đoạn 8bp, I172, E6 cluster and Q318. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gene CYP21A2P. 19 probe đặc trưng cho gene của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng trong đó có 3 probe trên nhiễm sắc thể số 6 nhưng ngoài vùng 6p21.3. Kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán trước sinh còn có thể xác định chính xác giới tính của thai nhi dựa vào probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể X (có độ lớn là 100 bp) và 1 probe đặc trưng cho nhiễm sắc thể Y (gene UTY- có độ lớn là 105 bp). 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Đề tài được tiến hành tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền và Phòng Xét nghiệm Sinh hóa, Huyết học, Chẩn đoán hình ảnh của Bệnh viện Nhi Trung ương là nơi chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân. - Các xét nghiệm sinh học phân tử thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu 1 năm: từ tháng 9 năm 2014 đến 9 năm 2015. 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng ý của đối tượng nghiên cứu: Tham gia tự nguyện vào nghiên cứu. Bệnh nhân và các thành viên gia đình bệnh nhân được giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu, được thông báo về kết quả xét nghiệm gen, đồng thời giải thích về khả năng điều trị và phòng bệnh của con họ để gia đình sẵn sàng hợp tác với các bác sĩ trong quá trình điều trị và thực hiện tư vấn di truyền. Bác sĩ di truyền sẽ lập hồ sơ theo dõi lâu dài cho thai nhi và các thành viên gia đình. Các thông tin của bệnh nhân và gia đình sẽ được đảm bảo bí mật. Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức trong nghiên cứu Y- sinh học. 2.5. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiến cứu mô tả, cắt ngang. 2.5.1. Thiết kế nghiên cứu Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 2.5.2 Tiến hành xét nghiệm 2.5.2.1. Quy trình thu thập mẫu nghiên cứu và tách chiết DNA Bệnh nhân và các thành viên của gia đình bệnh nhân lấy 2 - 5 ml máu ngoại vi. Tách chiết DNA bằng Phenol/Chloroform theo phương pháp thường quy của Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein. Đo và kiểm tra nồng độ DNA bằng máy đo nồng độ Nano Drop 1000, chỉ những mẫu DNA có độ tinh sạch 1,8 - 2 mới được sử dụng phát hiện đột biến gen. Quy trình tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform: Bước 1: Phá vỡ hồng cầu Cho vào ống Eppendorf 1.5 ml: 1 ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer – RBC) + 0,5 ml máu toàn phần được chống đông bằng EDTA. Lắc nhẹ , Voltex, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút/ 4ºC. Loại dịch nổi, thu cặn. Lặp lại quy trình từ 2 - 3 lần cho tới khi thấy có tủa trắng (Bạch cầu). Bước 2: Rửa bạch cầu Cho thêm 1 ml dung dịch phá vỡ bạch cầu (PBS) vào ống Eppendorf chứa cặn tế bào. Lắc nhẹ, Voltex, để 5 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút/ 4ºC. Loại dịch nổi, thu cặn. Bước 3: Phá vỡ bạch cầu Cho thêm 650 µl lysis buffer HD + 5 µl protein K. Ủ ở 56ºC cho tới khi tủa tan hết. Bước 4: Loại bỏ protein Sau khi ủ, cho thêm 500 µl dung dịch PCI (Phenol: Chloroform: Isoamyl tỷ lệ 25: 24: 1) là dung dịch tủa protein. Trộn đều. Ly tâm 15000 vòng/10 phút/ 4ºC. Hỗn hợp phân thành 3 lớp. Thu lớp trên trong suốt ra một ống Eppendorf 1.5 ml sạch đã được đánh dấu sẵn. Cho thêm vào ống Eppendorf 500 µl dung dịch CI( Chloroform: Isoamyl tỷ lệ: 24: 1). Trộn đều. Ly tâm 15000 vòng/ 10 phút/ 4ºC. Hỗn hợp phân thành 2 lớp. Thu lớp trên cùng trong suốt chứa DNA ra một ống Eppendorf mới. Bước 5: Tủa DNA và thu DNA Cho thêm vào ống Eppendorf 2.5V Ethanol 100% + 0.1V Sodium acetate (CH3COONa). Lắc đều, quan sát tủa. Ủ dung dịch ở -20ºC trong 2 - 3h để kết tủa DNA. Sau 2 - 3h, lấy sản phẩm đem ly tâm 15000 vòng/ 15 phút/ 4ºC → Loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Cho thêm 1 ml Ethanol 70% để rửa tủa. Trộn đều → Ly tâm 15000 vòng/ 15 phút/ 4ºC. Thu tủa DNA, để khô tự nhiên. Cho thêm 60 µl dung dịch TE để hòa tan tủa. 2.5.2.5. Kỹ thuật MLPA xác định đột biến xóa đoạn - Nguyên tắc: Trong phản ứng MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) việc thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau. Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn lên đỉnh tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình thường, chạy song song cùng mẫu bệnh nhân để so sánh. Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó. Bệnh nhân có đột biến xóa đoạn khi không xuất hiện đỉnh tương ứng với exon bị xóa đoạn và là người lành mang gen bệnh khi chiều cao đỉnh bằng ½ so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng. Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2. E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P. C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B. Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y. Hình 2.2. Sơ đồ và vị trí một số probe của Kit MLPA P050B2 [4] Chú thích: Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các probe tương ứng với các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các probe tương ứng với vị trí exon 1, intron2, exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là probe tương ứng với gen C4A, C4B. Trục hoành biểu hiện kích thước sản phẩm PCR tăng dần theo chiều từ trái sang phải. Trục tung thể hiện nồng độ của các sản phẩm phẩm PCR tỉ lệ thuận với chiều cao của các đỉnh. Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8) tương đương với các đột biến mất đoạn Δ8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể C4A, C4B (C4A, C4B). Ngoài ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. - Tiến hành phản ứng MLPA + Bước 1: Biến tính DNA. Cho 5 ml dung dịch DNA (nồng độ 10 ¸ 20 ng/ml) cần phân tích vào ống PCR, biến tính ở 98°C trong 5 phút, chuyển về giữ ở 25°C. + Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích. · Chuẩn bị hỗn hợp lai: Thành phần Thể tích Dung dịch đệm MLPA 1,5 ml Hỗn hợp probe 1,5 ml Tổng số 3 ml · Cho 3 ml hỗn hợp lai vào mẫu DNA đã biến tính, nâng nhiệt độ lên 95°C trong 1 phút để biến tính probe, hạ nhiệt độ xuống 60°C, ủ qua đêm (12¸24h). Đây là nhiệt độ để probe gắn đặc hiệu vào đoạn gen đích. + Bước 3: Nối 2 đầu probe · Chuẩn bị dung dịch đệm gắn probe: các dung dịch hóa chất cần vortex nhẹ cho đều trước khi pha dung dịch đệm Thành phần Thể tích Dung dịch đệm A 3 ml Dung dịch đệm B 3 ml Nước 25 ml Enzym ligase 65 1 ml Tổng số 32 ml · Cho 32 ml dung dịch đệm gắn probe vào hỗn hợp lai ủ qua đêm ở trên khi mẫu ở 54oC, tiếp tục chạy theo chu trình nhiệt sau: 54oC/ 15 phút→ 98oC/5 phút→ 4oC/ ∞. Sản phẩm lai này sẽ lưu trữ được 1 tuần/ 4oC, hoặc lâu hơn ở -20oC. + Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe). · Dung dịch đệm phản ứng PCR: 4 ml dung dịch đệm PCR, 26 ml nước. Cho thêm vào hỗn hợp 10 ml sản phẩm lai, đưa vào máy giữ ở 60oC. · Pha hỗn hợp phản ứng PCR gồm primer (có gắn huỳnh quang) 2 ml, dung dịch đệm 2 ml, nước 5,5 ml, Tag polymerase 0,5 ml. Cho 10 ml hỗn hợp phản ứng PCR này vào hỗn hợp đang trong máy giữ ở 60oC. Tiếp tục chu trình nhiệt: (95oC/30 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút) x 35 chu kỳ, 72oC/ 20 phút, giữ ở 4oC. Sản phẩm khuếch đại probe sẽ được điện di mao quản huỳnh quang trên máy giải trình tự gen để phân tích kết quả. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA DNA mẫu máu của 10 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh và 22 thành viên gia đình sau khi tách chiết theo quy trình Phenol/ Chloroform/ Isoamyl Alcohol được đo nồng độ và độ tinh sạch đồng thời điện di đánh giá chất lượng DNA. Kết quả đo mật độ quang Các mẫu DNA được kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang học trên máy Nano-drop. Hình 3.1. Kết quả kiểm tra chất lượng DNA tách từ mẫu bệnh phẩm Kết quả hình 3.1 cho thấy đường biểu diễn độ hấp thụ của DNA là một đường cong parabol, không gấp khúc, đứt gãy, có đỉnh hập thụ quang cực đại tại bước sóng 260 nm, nồng độ và độ tinh sạch đạt yêu cầu nằm trong giới hạn. Kết quả đo nồng độ của các mẫu DNA giao động trong khoảng 100 - 200 ng/µl và độ tinh sạch giao động trong khoảng 1,8- 2,0. Kế