Luận văn Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (vigna radiata (l.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

t sau chọn lọc được nhiều khi đó chỉ là các mô sẹo được trải qua quá trình huấn luyện. Hệ thống tế bào được sử dụng là các tế bào nuôi dịch lỏng hoặc trộn tế bào vào môi trường thạch chứa chất chọn lọc hoặc cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc. Điều kiện chọn lọc ở đây là sự có mặt của tác nhân chọn lọc với nồng độ hay mức độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào. Những tế bào sống sót phân chia thành cụm mô sẹo mới. Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này. Điểm hạn chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô. Vì vậy để đạt được hiệu quả cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau [25]. Chọn lọc gián tiếp: Chọn lọc gián tiếp đôi khi là chọn lọc mô sẹo có khả năng sống sót nhờ một khuyết tật nào đó của tế bào trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc. Chọn lọc tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thường được chọn theo phương pháp xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết. 1.2.4. Tái sinh cây Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong chọn dòng tế bào, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào sống sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguyên nhân là chưa xác định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây. Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu tiên khi bắt tay vào công việc chọn dòng biến dị soma. Theo Raghava và Nabors (1985) [32] cần phải chú ý đến các yếu tố sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 (1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân sinh, phôi non…). (2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chiếu sáng, nhiệt độ… (3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp của auxin và cytokinin. (4) Số lần cấy chuyển. (5) Tỷ lệ giữa khối lượng mô sẹo và điều kiện chọn lọc. (6) Sự có mặt của các yếu tố bắt buộc ở môi trường chọn lọc. Tái sinh cây được xem là khâu quyết định thành công trong chọn dòng tế bào. Nhiều tác giả sau khi chọn được dòng tế bào đột biến từ nuôi cấy mô sẹo đã không tái sinh được cây hoàn chỉnh. Nguồn gốc mô sẹo là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh [12]. Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây nên sự khác nhau trong quá trình tái sinh cây. Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của Dautura innoxia tái sinh chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây lưỡng bội. Ở cây khoai lang tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, cuống lá là rất thấp. Mô sẹo có nguồn gốc từ củ khoai lang bị lục hoá mạnh, tạo nhiều rễ và hầu như không có khả năng tái sinh cây [4]. Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đối tượng cây trồng khi bổ sung các chất sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin. Theo nghiên cứu của Dix (1990), mô sẹo có khả năng phân hoá tốt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung α – NAA (0,4mg/l) BAP (10mg/l). Sau đó chuyển sang nuôi cấy ở môi trường MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn có khả năng tái sinh cao [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Khả năng tái sinh cũng chịu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy. Nghiên cứu của Poddar (1998) cho thấy, hàm lượng amonium nitrat có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cây ở cây Eleusine coracana [39]. Bổ sung Spemidine trong quá trình nuôi cấy mô sẹo lúa với thời gian dài 12 tháng đã làm tăng khả năng tái sinh cây [9], Abdul và cs (1999) đã phát hiện sự gia tăng hàm lượng α – amylase ở những mô có khả năng tái sinh cao ở lúa [18]. Khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên ở các mô sau khi xử lý các điều kiện cực đoan đã được nhiều tác giả đề cập (Nabors và cs, 1983) [37]. Nguyễn Hoàng Lộc, 1992 cũng thu được kết quả tương tự khi tái sinh cây ở các mô chịu muối và mất nước ở thuốc lá [9]. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là dưới tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào “yếu” thường chết, chỉ còn những tế bào có sức sống cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao. 1.3. NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA VÀ HỆ THỐNG TÁI SINH Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU XANH 1.3.1. Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu stress môi trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [2]. Mundy và cs (1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [35]. Bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105, Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và ổn định ở thế hệ R2 [19]. Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị Phòng và cs (1998, 2001) đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12]. Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8. Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 – 2,71, tác giả cũng chọn được một số giống địa phương như pokaly, cườm, chiêm bầu và một cố giống lúa lai như tép lai, CR203 có khả năng chống chịu [2]. Ngoài ra khi xử lý nhiệt độ thấp tác giả cũng chọn được một số dòng lúa từ các loài phụ Japonica, Javanica và Indica có khả năng chịu lạnh (10C). Xử lý nhiệt độ cao ở giai đoạn mô sẹo của một số giống lúa, Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400C, 420C và 520 dòng cây xanh [14]. Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA, manitol và saccharose, Nguyễn Hoàng Lộc (1993) [9] cũng thu được 3 dòng thuốc lá SC1, SC2, SC3 (của các giống BV23-5, BG, NTH tương ứng) có khả năng chịu được sự mất nước cực đoan (mô mất nước trên 90% so với khối lượng tươi). Kết quả phân tích về các đặc điểm sinh lý – sinh hoá ở các dòng thuốc lá này cho thấy tính chịu mất nước được điều khiển bởi một nhóm gen. 1.3.2. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh. Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [41]. Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây Sorghum; tạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma từ tế bào nuôi cấy huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [33] và bằng phương pháp này đã thu tần số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [38] … Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6]. Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [42], [43]. Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [32], Ignacimuthu và Franklin (1999) [31], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [16], Sita và cs (2006) [44], Kaviraj và cs (2006) [34]. Sonia và cs (2007) [45] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi khuẩn Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm. Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả của phương pháp này [36]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Tám giống đậu xanh do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu là: VN93-1; VN99-1; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A; ĐX06. Đặc điểm của các giống đậu xanh trên được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt Hình dạng hạt Khả năng chịu hạn 1 VN93 - 1 Giống lai trong nước (Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo) Xanh - không bóng Tròn Khá 2 VN99- 3 Giống lai khác loài trong nước (Viện Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna mungo) Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 3 VC1973A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 4 ĐX06 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – không bóng Tròn Trung bình 5 VC3902A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 6 VC6148 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình 7 VC 6372 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình 8 VC 2768A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 2.1.2. Hoá chất và thiết bị - Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác. - Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH … 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát Tạo đa chồi từ mắt lá mầm Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro HẠT ĐẬU XANH Tạo mô sẹo Xử lý thổi khô Tái sinh cây Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro * Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh Khử trùng hạt Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ. - Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất. - Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ. Tạo mô sẹo Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức: t cp N N Ci  (%) Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Tái sinh cây Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển. Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy Kéo dài chồi đậu xanh Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn. Tạo cây hoàn chỉnh Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức: f df L W WW W   (%) Trong đó: WL: độ mất nước (%) Wf: khối lượng mô tươi (mg) Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg) 2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7). + Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S  (%) Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv:số mô sống sót Nt:tổng số mô xử lý + Tỷ lệ tái sinh cây: sv r c N N R  (%) Trong đó: Rc:khả năng tái sinh cây (%) Nr:số mô tái sinh cây Nsv: số mô sống sót Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 25 0 C  10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6. 2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên. Các bước ra cây được tiến hành như sau: - Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch. - Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm. - Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc. - Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần. Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm. Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy. Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7. Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l. Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2) 2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu ( x ), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 trung bình mẫu ( x S ), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO 3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao. 3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo 3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%) Công thức Nồng độ 2.4D (mg/l) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50 Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm. Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn. Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh Công thức Nồng độ 2,4D mg/l VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2) Công thức 2.4-D (mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40  0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55  0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75  0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20