Luận văn Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯƠNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH TỪ MÔ SẸO PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [GLYCINE MAX(L.) MERRILL] Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Học viên: Nguyễn Thị Tú Lan MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương là loại cây trồng chiến lược của nhiều quốc gia trên thế giới.Hạt đậu tương có hàm lượng chất dinh dưỡng cao là nguồn năng lượng cần thiết cho cuộc sống con người. Ở Việt Nam, tạo giống đậu tương bằng công nghệ sinh học đang mới bắt đầu quan tâm nghiên cứu. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào được xem như nguồn vật liệu phong phú cho việc chọn dòng tế bào có tính chống chịu ở cây trồng Vì vậy, phát triển hệ thống tái sinh là một trong những khâu quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong việc cải tạo giống theo hướng tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho cây đậu tương. Xuất phát từ lí do trên chúng tôi đã lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: Phát triển hệ thống tái sinh từ mô sẹo phục vụ chọn dòng chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill] 2. Mục tiêu nghiên cứuTạo dòng đậu tương từ mô sẹo chịu mất nước bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro 2. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu điều kiện tối ưu khử trùng hạt sử dụng trong nuôi cấy in vitro. Khảo sát môi trường tạo mô sẹo từ phôi hạt đậu tương. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây đậu tương bằng kĩ thuật kĩ thuật thổi khô ở các ngưỡng thổi khô khác nhau: 3, 5, 7 giờ Khảo sát môi trường tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh. Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự thay đổi hệ gen của các dòng đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. Thiết lập sơ đồ hình cây và xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng đậu tương nghiên cứu. Tuyển chọn một số dòng dòng đậu tương để tiếp tục theo dõi và đanh giá ở các thế hệ tiếp theo NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU Hai giống đậu tương là ĐVN5 và ĐVN6 do trung tâm thực nghiệm đậu đỗ, Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam chọn tạo cung cấp làm vật liệu nghiên cứu PHƯƠNG PHÁP Phương pháp nuôi cấy in vitro và chọn dòng chịu hạn Phương pháp xử lí kết quả và tính toán số liệu Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô 2. Độ mất nước của mô sẹoHình 3.1. Tốc độ mất nước của mô sẹo của các giống đậu tương sau xử lý bằng thổi khô 3. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xứ lý bằng kỹ thuật thổi khôBảng 3.2 Tỷ lệ sống của mô sẹo của các ngưỡng thổi khô khác nhau 4. Tỷ lệ tái sinh chồi của mô sẹo sống sót Hình 3.2. Tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô 5. Ảnh hưởng cua nồng độ BAP đến khả năng tái sinh câyBảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây 6. Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA tới khả năng hình thành và phát triển hệ rễBảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng hình thành rễ Nhận xét về khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn trong hệ thống tái sinh in vitro Cả hai giống đậu tương nghiên cứu đều có khẳ năng tạo mô sẹo. Giống ĐVN5 có khả năng tạo mô sẹo cao hơn giống ĐVN6. Mô seọ tạo ra từ giống ĐVN5 Có khả năng chịu mất nước cao hơn giống ĐVN6 ở tất cả các ngưỡng thổi khô 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ. Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh. Mô sẹo sống sót sau chọn lọc ở ngưỡng 3 giờ có khả năng tái sinh cao hơn đối chứng. Tỷ lệ tái sinh cao nhất ơ cả hai giống đậu tương ở nồng độ BAP là 3 mg/l. Nồng độ NAA là 0,3mg/l cho tỷ lệ hình thành rễ cao nhất ở cả hai giống. Đã tạo ra 47 dòng mô và 147 dòng cây xanh. Hình 3.3. Một số hình ảnh trong chọn dòng tế bào soma có khả năng chịu hạn ở cây đậu tương Hình 3.4. Một số hình ảnh cây đậu tương tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước trồng ngoài đồng ruộng (A) Dòng đậu tương chịu hạn từ giống gốc ĐVN5; (B) Dòng đậu tương chịu hạn từ giống gốc ĐVN6; (C) Hình ảnh ra hoa kết quả của dòng đậu tương chọn lọc từ giống ĐVN5; (D) Hình ảnh ra hoa kết quả của dòng đậu tương chọn lọc từ giống ĐVN6 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC DÒNG CHỌN LỌC R0 BẰNG KỸ THUẬT RAPD Kết quả tách chiết và tinh sạch AND từ lá của các dòng chọn lọc Bảng 3.5. Độ tinh sạch và hàm lượng AND của mẫu đậu tương 2. Kết quả phân tích đa hình một số dòng chọn lọc ở thế hệ R0 có nguồn gốc từ mô seo chịu mất nước của hai giống ĐVN5 và ĐVN6 bằng kỹ thuật RAPD.Bảng 3.6.Tổng số phân đoạn AND được nhân bản từ And hệ gen của các dòng đậu tương với 10 mồi ngẫu nhiên Bảng 3.7. Tỷ lệ phân đoạn AND đa hình với 10 mồi ngẫu nhiên Kêt quả điện di sản phẩm RAPD trên gel agarose 1,5% với mồi M16 3. So sánh sự khác nhau giữa các dòng chọn lọc và giống gốc ở mức độ phân tử.Bảng 3.8. Hệ số đồng dạng di truyền của các dòng chọn lọc D7, D13, D21 D23, D34 và các giống gốc ĐVN5 và ĐVN6  Biểu đồ so sánh các dòng chọn lọc và 2 giống gốc ĐVN5 và ĐVN6Hệ số giống nhau 4. Nhận xét về kết quả phân tích tính đa hình ADN trong hệ gen của các dòng chọn lọc và giống gốc Các dòng chọn lọc từ 2 giống đậu tương khác nhau đã có những thay đổi đáng kể ở mức độ phân tử trong hệ gen. Sự thay đổi này tạo ra những vật liệu khởi đầu cho công tác cải tạo giống đậu tương theo hướng tăng cường khả năng chịu hạn. Phân tích các phân đoạn ADN được nhân bản khi sử dụng các mồi ngẫu nhiên M4, M5, M7, M8, M9, M10, M11, M15, M16, M18 đã xác định được khoảng cách di truyền của các dòng chọn lọc và giống gốc, dòng D7, D13 có hệ số sai khác so với giống gốc ĐVN5 lớn nhất là 0,2266, các dòng D21, D23, D34 sai khác với giống giống ĐVN6 với hệ số từ 0,3286 đến 0,4429. Khoảng cách di truyền của các dòng chọn lọc D7, D13, D21, D23, D34 và giống ĐVN5 so với giống ĐVN6 là 37%. ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC CỦA MỘT SỐ DÒNG TỪ THẾ HỆ R0 Bảng 3.9. Một sột số đặc điểm của của các dòng chọn lọc và 2 giống gốc ĐVN5, ĐVN6  KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1. Cả hai giống đậu tương đều có khả năng tạo mô sẹo, giống ĐVN5 có tỷ lệ tạo mô sẹo lớn nhất ở nồng độ 2,4 D là 11mg/l, giống ĐVN6 là 10mg/l. Ngưỡng chọn dòng tế bào chịu hạn phụ thuộc vào khả năng chịu mất nước của mô sẹo của từng giống. Mô sẹo chịu mất nước của giống ĐVN5 có tỷ lệ tái sinh cao hơn giống ĐVN6. Tỷ lệ tái sinh cao nhất ở cả hai giống ở nồng độ BAP là 3mg/l. Nồng độ NAA là 0,3mg/l cho tỷ lệ hình thành và phát triển hệ rễ cao nhất ở cả 2 giống. Đã chọn tạo 47 dòng mô có khả năng chịu mất nước và 123 dòng cây xanh. 2. Sử dụng kỹ thuật RAPD sàng lọc với 20 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các dòng chọn lọc so với giống gốc cho thấy: (i) có 10 mồi biểu hiện sự đa hình; (ii) Các dòng chọn lọc D7, D13 có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc ĐVN5 là 22,86%; Các dòng chọn lọc D21, D23, D34 có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc ĐVN6 từ 32,86% đến 44,29%. Các dòng chọn lọc từ mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN hệ gen. 3. Các dòng chọn lọc D7, D13, D21, D23, D34 phân bố trong cùng một nhóm với giống ĐVN5 (chịu hạn tốt) có khoảng cách di truyền với giống ĐVN6 (chịu hạn kém) là 37%. 4. Kết hợp đánh giá một số đặc điểm nông học và phân tích khoảng cách di truyền của một số dòng chọn lọc so với giống gốc đã chọn được ba dòng tiêu biểu là D13, D21, D23. Đề nghị Tiếp tục theo dõi và phân tích đặc điểm nông học, hóa sinh và khả năng chịu hạn của 3 dòng chọn lọc D13, D21, D23 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của 2 giống ĐVN5 và ĐVN6 ở các thế hệ tiếp theo để khẳng định giá trị làm vât liệu chọn giống.