Luận văn Polyphenol và hoạt độ ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ vang (caesalpinia sappan l.) và một số cây thuốc khác

cũng có khả năng ức chế các enzyme trong phản ứng viêm [65]. Nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa khả năng ức chế proteinase và khả năng chữa trị các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa, chúng tôi đã thu thập và chọn lọc các mẫu nghiên cứu là những cây thuốc nam thường dùng chữa các bệnh này được ghi trong nhiều tài liệu [3, 9]. 1.4.2 Cây gỗ Vang (Tô mộc) 1.4.2.1 Đặc điểm phân loại, phân bố, thành phần hóa học và công dụng Hình 1.5. Tô mộc Hạt xanh Gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) là cây mọc hoang hay được trồng nhiều nơi ở Việt Nam, Trung Quốc cũng như nhiều nước Đông Nam á, và được dùng làm thuốc với tên gọi Tô mộc… Theo Đỗ Tất Lợi, nước sắc Tô mộc có tác dụng kháng sinh mạnh đối với nhiều vi sinh vật: Staphylococcus 209P, Samonella typhi, Shiga flexneri, Shigella sonnei, Shigella dyseteria Shiga, Bacillus subtilis. Theo Đông y, Tô mộc có tác dụng hành huyết, thông lạc, khử ứ, chỉ thống, tán phong, hòa huyết, kinh nguyệt bế. Nhân dân ta còn dùng Tô mộc làm thuốc săn da và cầm máu, chữa lị ra máu, chảy máu trong ruột, ho... Tô mộc cũng được dùng kết hợp trong các bài thuốc Đông y. Các công trình nghiên cứu trên thế giới cho thấy hợp chất brazilin và brazilein có trong Tô mộc có tác dụng kháng histamin, tác dụng làm mạnh và kéo dài tác dụng của hormone tuyến thượng thận, ức chế histidine carboxyl-lyase, và nhiều tác dụng sinh lý khác [9]. Tài liệu cho thấy gỗ vang có các loại polyphenol như tannin, acid gallic, saponin, brazilin, ngoài ra còn có tinh dầu. Brazilin là chất có tinh thể màu vàng, trong môi trường kiềm chuyển màu đỏ, khi bị oxy hóa cho brazilein [9]. 1.4.2.2 Các nghiên cứu về gỗ Vang trên thế giới Các hợp chất hóa học trong Tô mộc đã được nghiên cứu khá kĩ trên thế giới. Năm 1985, hai hợp chất vòng thơm là dẫn xuất của brazilin đã được các nhà khoa học Nhật Bản chiết xuất từ gỗ Vang [17]. Năm 1986, các nhà khoa học Nhật Bản khác đã phát hiện được protosappanin, một hợp chất biphenyl từ lõi gỗ Tô mộc [41]. Năm 1987 một số homoisoflavonoid mới cũng được tìm thấy trong cây gỗ Vang [42, 43]. Năm 2008, các nhà khoa học Trung Quốc cũng phát hiện được một homoisoflavonoid mới trong cây Tô mộc thu thập tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [67]. Gần đây các nghiên cứu đã tập trung vào các hoạt tính sinh học, đặc biệt là khả năng chống oxy hóa, khả năng ức chế tế bào ung thư, chức năng bảo vệ…Các nghiên cứu tập trung vào khả năng chống oxy hóa, chống viêm, tác động tới cơ tim của brazilein và các chất khác trong gỗ Vang [64, 68]. Các nhà nghiên cứu Trung Quốc cho thấy dịch chiết ethanol từ gỗ Vang có thể có tác dụng ức chế miễn dịch, ức chế tế bào lympho T, brazilein cảm ức apoptosis các lympho lách chuột [63]. Brazilin và caesalpine J từ cây Tô mộc còn có khả năng kích thích phân cắt sợi DNA, một quá trình có thể chống ung thư [36]. Năm 2008, nhóm các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã thực hiện các thí nghiệm về khả năng chống oxy hóa, quét dọn các gốc tự do của dịch chiết cồn và các chất chiết xuất từ gỗ Vang như protosappanin A, protosappanin B và brazilein. Thí nghiệm cho thấy các chất này đều có khả năng chống oxy hoá nhưng ở mức độ khác nhau [29]. Năm 2004, nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy dịch chiết n-butanol, methanol, nước, chloroform gỗ Vang có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều chủng Staphylococcus aureus kháng kháng sinh [33]. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy dịch chiết gỗ Vang cũng như các chất được chiết xuất từ gỗ Vang có khả năng ức chế nhiều vi sinh vật khác [34]. Brazilin cũng có khả năng ức chế cảm ứng caspase-3, một proteinase có vai trọng quan trọng trong hệ thống miễn dịch và quá trình apoptosis [32]. Nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết nước và dịch chiết cồn cây gỗ Vang cũng như một số loài thực vật khác trong họ Caesalpiniaceae đều có khả năng ức chế HIV-1 protease. Đây là một protease thuộc về nhóm protease aspartic có vai trò quan trọng trong sự nhân lên của HIV [55]. 1.4.2.3 Các nghiên cứu tại Việt Nam Cũng như các nghiên cứu ngoài nước, các nghiên cứu ở Việt nam cũng tập trung vào khả năng chống oxy hóa của gỗ Vang. Nghiên cứu của các tác giả Việt Nam cho thấy dịch chiết gỗ Vang có khả năng ức chế mạnh xanthine oxidase là một enzyme có liên quan đến hình thành bệnh gout trong đó sappanchalcone có khả năng ức chế mạnh nhất. Các tác giả cũng tìm được 3 hợp chất mới trong cây gỗ Vang và đặt tên là neoprotosappanin, neosappanone A và protosappanin A dimethyl acetal [45]. Các nghiên cứu khác cũng đã xác định được nhiều hợp chất có mặt trong cây gỗ Vang tại Việt Nam [4]. Nhìn chung, những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các thành phần hóa học trong Tô mộc đã được tiến hành rộng rãi trên thế giới, tuy nhiên những nghiên cứu về khả năng ức chế proteinase (PIA) vẫn còn rất sơ lược. Công trình nghiên cứu gần đây đã phát hiện được dịch chiết từ gỗ, vỏ thân, vỏ hạt cây Tô mộc có tác dụng ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA), proteinase của Pseudomonas aeruginosa (PsIA) và cho rằng hoạt tính ức chế này có thể do các chất không phải protein mà có thể là do các hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ [6]. Polyphenol là các hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn protein và có nhiều hoạt tính sinh học, chúng có thể tương tác với các protein nói chung và các proteinase nói riêng, vì vậy công trình này chủ yếu nhằm làm sáng tỏ khả năng ức chế một số proteinase serine (trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ P. aeruginosa và Stalphylococcus aureus) của polyphenol và flavonoid trong các bộ phận cây gỗ Vang. Mục tiêu của đề tài luận văn Nghiên cứu điều tra hoạt tính ức chế proteinase, polyphenol của một số cây thuốc chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa. Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và hoạt độ ức chế của dịch chiết một số cây thuốc giàu các chất ức chế proteinase. Định tính các thành phần flavonoid và PIA trên bản mỏng và đi sâu nghiên cứu PIA của flavonoid một số cây thuốc. Nghiên cứu flavonoid các bộ phận cây Tô mộc và khả năng ức chế proteinase serine của chúng. Chương 2 NGUYÊN LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 2.1 Nguyên liệu Các mẫu nghiên cứu là các bộ phận cây thuốc nam do Trung tâm Trồng và chế biến cây thuốc, Viện Dược liệu cung cấp. 2.2 Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.2.1 Dụng cụ Máy cô quay chân không Kaki (Đức) Bản mỏng Silicagel DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck. Hệ thống điện di Hoefer SE 260 Máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam (Anh) Tủ ấm WTB Bunder (Đức) Máy ổn nhiệt DT1 (Đan Mạch) Máy li tâm Sigma Và các thiết bị thông dụng khác Hóa chất Thuốc thử Folin-Ciocalteau, trypsin, chymotrypsin, casein của hãng Sigma Proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa và S. aureus Các hóa chất điện di của Fluka, A.G (Thụy Sĩ) Các hóa chất khác đạt độ tinh sạch phân tích 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xử lý mẫu và chuẩn bị dịch nghiên cứu Mẫu tươi: cây thuốc được thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, nghiền nhỏ, chiết trong nước, li tâm thu dịch trong. Mẫu khô: cây thuốc được thu hái, rửa sạch, tách riêng các bộ phận, xử lý nhiệt 110oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme, sấy đến khô trong tủ sấy ở 60oC, ngâm trong ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày, thu phần dịch chiết, lại thêm ethanol, quá trình ngâm chiết lặp lại 3 lần, trộn dịch chiết của 3 lần, cô đặc bằng máy cô quay chân không ở 50oC đến thể tích nhất định. Mẫu nghiờn cứu 2.3.2 Tách chiết flavonoid toàn phần các mẫu nghiên cứu theo phương pháp B. C. Talli [trích theo tài liệu 10] (theo sơ đồ dưới) Xử lý mẫu, Ngõm chiết trong EtOH 96oC Dịch chiết EtOH Đuổi dung mụi, hũa tan vào nước Cặn khụng tan DC1 Pha nước Chỉnh pH 3-4 bằng HCl 1% Chiết với ethyl acetate (3 lần) Pha ethyl acetate DC2 DN Cụ cạn, hoà tan vào ethanol 96% Flavonoid toàn phần Hình 2.1 Sơ đồ tách chiết flavonoid toàn phần 2.3.3 Định lượng polyphenol theo phương pháp Folin-Ciocalteau [61] Nguyên tắc dựa vào phản ứng oxy hoá của các polyphenol với thuốc thử Folin-Ciocalteau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. So màu ở bước sóng 765 nm. Hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid gallic. Hóa chất: Thuốc thử Folin-Ciocalteau Dung dịch Na2CO3 20%: Hòa tan 200g Na2CO3 vào 800 ml nước cất rồi đun sôi. Sau khi dung dịch nguội, thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ, lọc thu dịch trong, dẫn nước cất tới 1000 ml. Đường chuẩn acid gallic: Chuẩn bị các dung dịch acid gallic có các nồng độ khác nhau: 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,25, 0,5 mg/ml. Cho 20 ml mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 1,58 ml nước cất, sau đó cho 100 ml thuốc thử Folin-Ciocalteau vào, trộn đều. Sau khoảng 30 giây đến 8 phút cho vào 300 ml dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 40oC trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng 765 nm. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 OD 765 mg/mL Hình 2.2 Đường chuẩn acid gallic Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid gallic trên. Sắc ký phân chia các thành phần polyphenol, trên bản mỏng silicagel [theo tài liệu 22] Sắc ký là phương pháp phân tích khi một pha di động triển khai trên một pha tĩnh mà từ đó một hỗn hợp các chất khác nhau được phân tách thành từng thành phần. Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography), là một phương pháp được biết đến từ lâu, được E. Stahl giới thiệu vào năm 1957. Tuy nhiên hiện nay vẫn được sử dụng do có nhiều ưu điểm như thời gian khai triển ngắn (20 đến 30 phút), đường khai triển ngắn, khả năng phân tách cao, có thể dùng các thuốc hiện màu mạnh như acid, kiềm mạnh, nhiệt độ cao. Chủ yếu phương pháp này dựa trên phương pháp sắc ký hấp phụ nhưng có tính chất riêng biệt để tách một lượng nhỏ các chất. Sắc ký lớp mỏng có thể vừa là sắc ký hấp thụ vừa là sắc ký phân tách. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng dựa trên sự phân chia của hai pha: một pha tĩnh (có thể là silicagel, aluminum oxide, cellulose, Kieselguhr ...), được trải trên bản kính, thủy tinh hay nhựa, một pha động là hệ dung môi khai triển đựng trong bình có nắp kín, bản mỏng có lớp hấp phụ được nhúng và lớp dung môi, dung môi di chuyển lên trên làm chuyển dịch hỗn hợp mẫu từ vị trí chấm lên trên bản mỏng. ở đây có mối liên quan chặt chẽ giữa chất hấp phụ, hệ dung môi triển khai và chất để phân tích. Để phát hiện các vết dịch chuyển có thể soi dưới ánh sáng tử ngoại, hiện màu bằng các thuốc thử thích hợp. Có thể cạo các vết, rửa giải, tinh chế để tiếp tục nghiên cứu. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng bản mỏng Silicagel 25 DC alufolien 20x20 cm silicagel 60 F254 của Merck để phân chia, xác định các thành phần polyphenol trong các cây mẫu nghiên cứu. Các hệ dung môi triển khai sắc ký đã dùng: TEAF (Toluene: Ethyl acetate: Acetone : acid Formic): (5:2:2:1) TEAF: (5:3:1:1) Chloroform:methanol: (9:1) Chloroform:ethyacetate: acid formic: (5:3:0,4) Hiện màu: H2SO4 10%, 800C Hơi Amoniac bão hòa 2.3.5 Xác hoạt độ ức chế proteinase: dịch chiết mẫu được pha loãng nhiều lần để đạt nồng độ ethanol khi tiếp xúc với enzyme nhỏ hơn 5% (v/v) là nồng độ không ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (điều tra sơ bộ PIA) với cơ chất casein 0,1% giữ ở 37oC trong 4 giờ nhuộm bằng Amido Black 10B 0,1% trong acid acetic 7%, hoạt độ enzyme tỷ lệ thuận với đường kính và độ sáng của vòng phân giải trên đĩa thạch [70]. Phương pháp Anson cải tiến [69] Nguyên tắc dựa vào sự thủy phân cơ chất protein (casein) bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng acid tricloroaxetic (TCA). Định lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau, khả năng ức chế proteinase của mẫu nghiên cứu tỉ lệ với hiệu số giữa sản phẩm tạo thành của ống thí nghiệm không có mẫu nghiên cứu và ống nghiệm có chất nghiên cứu. Một đơn vị ức chế (IU) là lượng chất ức chế làm giảm 50% hoạt độ của 2 mg enzyme. Hóa chất thí nghiệm Thuốc thử Folin-Ciocalteau Đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Cơ chất casein 1% trong đệm Sorensen pH 7,6 nồng độ 1/15M Proteinase: trypsin, chymotrypsin, Pa tách từ Pseudomonas aeruginosa TCA 5% Na2CO3 6% Tiến hành thí nghiệm ống thí nghiệm: lấy hai ống nghiệm, một ống cho vào 400 ml đệm, ống còn lại cho vào 300 ml đệm cùng với 100 ml mẫu nghiên cứu có độ pha loãng thích hợp. Sau đó cho vào mỗi ống 100 ml enzyme, trộn đều, để ở 35,50C trong 10 phút, thêm 1 ml casein 1% và giữ ở 35,50C trong 20 phút. Tiếp theo cho vào mỗi ống 2,5 ml TCA 5%, lắc đều, lọc lấy dịch trong làm phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau. ống kiểm tra: làm tương tự với ống thí nghiệm, nhưng sau khi ủ 10 phút ở 35,50C cho ngay TCA trước rồi để 20 phút, sau đó mới cho cơ chất casein. Phản ứng màu: cho 250 ml dịch lọc vào 1ml Na2CO3 6%, trộn đều rồi cho tiếp vào 250 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần. Sau 30 phút so màu ở bước sóng 750 nm. Hoạt độ ức chế được tính như sau: DEI = E - EI E = Etn - Ekt EI = EItn - EIkt I (mIU/ml) = DEI/E.n.x Etn : Độ hấp thụ ống thí nghiệm không có chất ức chế. Ekt : Độ hấp thụ ống kiểm tra không có chất ức chế. EItn: Độ hấp thụ ống thí nghiệm có chất ức chế. EIkt: Độ hấp thụ ống kiểm tra có chất ức chế. n: độ pha loãng mẫu nghiên cứu x: hàm lượng enzyme (mg/ml) tương ứng với hoạt độ E I : hoạt độ ức chế Thí nghiệm xác định PIA được tiến hành với nhiều độ pha loãng mẫu nghiên cứu khác nhau đến khi tìm được độ pha loãng thích hợp. Độ pha loãng thích hợp là độ pha loãng mẫu nghiên cứu mà ở đó hoạt độ enzyme khi có chất kìm hãm (dung dịch mẫu nghiên cứu) bằng khoảng một nửa so với hoạt độ enzyme khi có đối chứng là nước. Xác định hoạt độ phân giải protein theo phương pháp Anson cải tiến Đơn vị hoạt độ phân giải protein là lượng enzyme mà trong 1 phút ở 35,5 0C có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau tương đương với phản ứng màu của 1 mmol tyrosine với thuốc thử Folin-Ciocalteau. OD750 μmol/ml Hình 2.3 Đường chuẩn tyrosine Hoạt độ phân giải protein (HP/ml) của 1 ml dung dịch enzyme được tính theo công thức: HP/ml = (mmol tyrosine x a x b)/t a: Toàn bộ thể tích hỗn hợp sau phản ứng (4 ml) b: Tính trên 1 ml enzyme xác định (nhân với 10 nếu lượng enzyme xác định là 100 ml) t: Thời gian ủ enzyme với cơ chất (20 phút) 2.3.6 Điện di PA trên gel polyacryamide theo phương pháp của Heussen và Dowdle [26] Các bước thực hiện kỹ thuật điện di phát hiện proteinase trên gel polyacrylamide có SDS như sau: * Chuẩn bị dung dịch a. Dung dịch acryamide 30%: Cân 29,2 g acrylamide, 0,8 g bisacrylamide hòa tan thành 100 ml bằng nước cất 2 lần. Dung dịch đệm Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 Cân 18,15g Tris, pha trong 50 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 8,8 sau đó thêm nước cất đến 100 ml. Dung dịch đệm Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 Cân 3 g Tris, pha trong 40 ml nước cất, điều chỉnh bằng HCl 2N đến pH 6,8 sau đó thêm nước cất đến 50ml Đệm mẫu Gồm 2,5ml Tris-HCl pH 6,8, 2 ml glycerol, 2 mg bromophenol xanh và 1,5 ml nước cất. * Đổ gel a. Gel tách 12,5 % 2,31 ml acrylamide 30% 0,55 ml casein 1% 0,85 ML đệm Tris-HCl pH 8,8 55 mL SDS 10% 1,76 ml H20 27,5 ml pesunphate amon 2,5 ml TEMED Gel cô 5% 0,3 ml acryamide 30% 0,5 ml Tris-HCl pH 6,8 1,2 ml H2O 10 ml SDS 10% 10 ml Amonium persulfate 4 ml TEMED * Tiến hành điện di Lượng mẫu đạt ~40 mg protein trên mỗi giếng. Điện di theo chiều từ âm sang dương với dòng điện 8mA/1 giếng Sau khi điện di, loại bỏ SDS bằng Triton X-100 2,5% để. Rửa sạch bằng nước cất. Sau đó ủ trong đệm Sorensen pH 7,6 có hoặc không có chất ức chế trong 4 giờ ở 37oC. Nhuộm gel bằng dung dịch Amido Black 10B hoặc Coomassie Brilliant Blue. Các băng proteinase là các băng trắng không bắt màu thuốc nhuộm. 2.3.7 Sắc ký cột silicagel Sắc ký cột được sử dụng để tách các hợp chất hữu cơ dựa trên nguyên tắc tương tự như sắc ký lớp mỏng, chất hấp phụ thường được sử dụng là silicagel hoặc alumina. Dung dịch các chất hữu cơ được đưa lên cột và rửa chiết (eluent) bằng một dung môi hữu hoặc hệ dung môi thích hợp. Các phân tử có tính phân cực khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau qua cột. Các phân đoạn khi đó được thu lại và kiểm tra khả năng phân tách trên bản mỏng. Chúng tôi sử dụng silicagel pha thường có kích thước hạt là 0,040-0,063 mm làm chất hấp phụ và rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4) và chloroform : ethylacetate (5:3). Các phân đoạn được kiểm tra trên bản mỏng với hệ dung môi chloroform:ethyacetate:acid formic (5:3:0,4). 2.3.8 Quang phổ hấp thụ tử ngoại [8, trích theo tài liệu 10] Các phân đoạn sắc ký được hoà tan trong cồn tuyệt đối và xác định phổ tử ngoại trên máy quang phổ HeλIOS α Spectronic Unicam. Các nhóm flavonoid khác nhau sẽ có phổ hấp thụ tử ngoại đặc trưng khác nhau trong hai dải hấp thụ của các hợp chất flavonoid. Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính ức chế proteinase ở một số cây thuốc 3.1.1 Điều tra sơ bộ PIA các mẫu nghiên cứu Để thăm dò sơ bộ khả năng ức chế proteinase (PIA) của các mẫu nghiên cứu chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán là phương pháp tương đối nhanh và nhạy. Kết quả điều tra khả năng ức chế 3 loại proteinase serine là trypsin, chymotrypsin và proteinase tách từ vi khuẩn P. aeruginosa (PsA) được chỉ ra ở hình 3.1 và bảng 3.1. Các mẫu có PIA cao sẽ được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 12 4 3 18 11 (b) (a) 1 7 8 16 15 (c) Hình 3.1a. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E (Enzyme)+H2O; 4-6: E+cây Muối; 7-9: E+Sắn thuyền; 10-12: E+Trâm bầu; 13-15: E+Vỏ thân Tô mộc; 16-18: E+Gỗ Tô mộc 4 3 12 6 7 10 9 1 (b) (a) Hình 3.1b. Khả năng ức chế proteinase của một số mẫu (a) trypsin; (b) chymotrypsin; (c) PsA 1-3: E +H2O; 4-6: E+Vỏ hạt Tô mộc chín; 7-9: E+Đơn tướng quân; 10-12: E+Đại hoàng (c) Bảng 3.1. Điều tra sơ bộ PIA (bằng phương pháp khuếch tán) STT Mẫu Bộ phận sử dụng TIA KIA PsIA 1 Muỗng truổng Zanthoxylum avicennae (Lamk.) Họ Cam (Rutaceae) Rễ +++ +++ ++ 2 Dầu giun Chenopodium ambrosioides L. Họ Rau muối (Chenopodiaceae) Lá - - - 3 Tế tân Asarum sieboldii Miq. Họ Mộc thông (Aristolochiaceae) Lá - - - 4 Trâm bầu Combretum quadrangulare Kurz. Họ Trâm bầu (Combretaceae) Lá +++++ +++++ +++++ 5 Khoai nưa Amorphophallus rivieri Dur. Họ Ráy (Araceae) Lá - - - 6 Cây hoa phấn Mirabilis jalapa L. Họ Hoa giấy (Nyctaginaceae) Lá - - - 7 Xoan Melia azedarach Họ Xoan (Meliaceae) Vỏ thân ++ +++ ++ 8 Sử quân tử Quisqualis indica L.Họ Bàng (Combretaceae) Vỏ thân +++ ++ + 9 Cây muối Bischofia Javanica) Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Vỏ thân ++ ++ - 10 Lộc mại Mercuriadis indica Lour. Họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Lá + + + 11 Sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep. Họ Sim (Myrtaceae) Lá +++++ +++++ +++++ Cành +++ +++ +++ 12 Đơn tướng quân Syzygium formosum var. Họ Sim (Myrtaceae) Lá ++++ +++ ++++ 13 Đại hoàng (sapa) Rheum sp. Họ Rau răm (Polygonaceae) Củ ++++ ++++ ++++ 14 Đậu cọc rào Cajanus indicus Spreng. Họ Đậu (Fabaceae) Vỏ quả - - - Lá +++ +++ ++ 15 Xoài Mangifera indica L. Họ Đào lộn hột (Anacadiaceae) Vỏ thân +++ +++ ++ 16 Cây gỗ Vang (Tô mộc) Caesalpinia sappan L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Gỗ ++++ +++++ +++ Vỏ thân ++++ +++++ +++++ Vỏ hạt xanh +++ +++ ++ Vỏ hạt chín +++++ +++++ +++++ 17 Cây me Tamarindus indica L. Họ Vang (Caesalpiniaceae) Vỏ thân + + - 18 Đại Plumeria rubra Họ Trúc đào (Apocynaceae) Lá +++ - - 19 Hạ khô thảo Brunella vulgaris L. Họ Bạc hà (Lamiaceae) Lá ++ +++ ++ Hoa ++ +++ +++ 20 Ngưu bàng Artium lappa L. Họ Cúc (Asteraceae) Rễ + ++ + Ghi chú: + : ức chế < 25% ; + + : ức chế từ 25% đến 50%; + + + : ức chế từ 50% đến 75% ; + + + + : ức chế >75%; + + + + + : ức chế 100% Kết quả điều tra 26 mẫu của 20 cây thuốc thường được sử dụng chữa các bệnh viêm nhiễm, mụn nhọt, mẩn ngứa thuộc 17 họ thực vật khác nhau cho thấy có 21 mẫu của 16 cây có hoạt tính ức chế proteinase, chiếm 80% những cây điều tra. Tỉ lệ trên cho thấy có thể có mối quan hệ giữa khả năng ức chế proteinase của dịch chiết các cây thuốc với khả năng chữa bệnh của chúng. Các mẫu có PIA cao tiếp tục được xác định PIA theo phương pháp Anson cải tiến, kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Hoạt độ ức chế proteinase của dịch chiết nước (xác định theo phương pháp Anson cải tiến) STT Mẫu % chất khô TIA ChIA PsIA mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô mIU/g tươi mIU/g khô 1 Trâm bầu 44,6 7.651 17.155 11.960 26.816 1.789 4.011 2 Cây xoan 43,1 1.375 3.190 2.763 6.411 260 603 3 Sử quân tử 42,5 263 619 1.154 2.715 184 433 4 Lộc mại 20,5 222 1.083 171 834 179 873 5 Sắn thuyền 31,7 11.631 36.691 33.332 105.148 8.195 25.852 6 Đơn tướng quân 33,3 2.465 7.402 3.694 11.093 1.518 4.559 7 Đại hoàng 29,7 759 2.556 2.021 6.805 274 923 8 Đậu cọc rào 27,6 632 2.290 805 2.917 372 1.348 9 Cây xoài 34,7 287 827 1.033 2.977 63 182 10 Thân gỗ tô mộc 57,2 14 24 29 51 22 38 11 Vỏ thân tô mộc 47,8 7 15 19 40 13 27 12 Vỏ hạt tô mộc chín 79,1 2.861 3.617 11.454 14.480 5.183 6.552 13 Vỏ hạt tô mộc xanh 33,6 255 759 3.463 10.307 1.271 3783 Từ bảng 3.2 có thể thấy các dịch chiết đều có khả năng ức chế chymotrypsin (ChIA) tốt hơn khả năng ức chế trypsin (TIA), khả năng ức chế proteinase tách từ P. aeruginosa (PsIA) là kém nhất. Khả năng ức chế PsA kém có thể do proteinase tách từ dịch nuôi cấy P. aeruginosa còn có một số loại proteinase khác, các dịch chiết nghiên cứu chỉ có thể ức chế một loại proteinase nào đó (có thể là các proteinase serine) hoặc cũng có thể do trong dịch nuôi cấy còn có các chất khác ảnh hưởng tới hoạt tính của các chất ức chế. Bảng 3.2 cũng cho thấy có sự khác nhau rất lớn về hoạt độ ức chế proteinase của các mẫu. Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol của 13 mẫu này và nhận thấy các mẫu có hàm lượng polyphenol cao thường có PIA cao như: các mẫu Trâm bầu, Sắn thuyền, tuy nhiên cũng có mẫu có hàm lượng polyphenol thấp nhưng cũng có PIA cao như vỏ hạt Tô mộc chín (bảng 3.3). Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol dịch chiết nước và hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) STT Mẫu Hàm lượng polyphenol (mg/g tươi) TIA (mIU/mg polyphenol) ChIA (mIU/mg polyphenol) PsIA (mIU/mg polyphenol) 1 Trâm bầu 20,1 380,6 5950.0 89,0 2 Cây Xoan 3,3 416,7 837,3 78,8 3 Sử quân tử 5,5 47,8 209,8 33,5 4 Lộc mại 5,7 38,9 30,0 31,4 5 Sắn thuyền 12,3 945,6 2709,9 666,3 6 Đơn tướng quân 8,2 300,6 450,5 185,1 7 Đại hoàng 8,7 87,2 23,2 11,8 8 Đậu cọc rào 3,9 162,0 206,4 95,4 9 Cây Xoài 1,9 151,1 543,7 33,2 10 Gỗ Tô mộc 5,5 2,6 5,3 4,0 11 Vỏ thân Tô mộc 7,5 0,9 2,5 1,7 12 Vỏ hạt Tô mộc chín 2,1 1362,4 5454,3 2468,1 13 Vỏ hạt Tô mộc xanh 1,4 182,1 2473,6 907,9 Bảng 3.3 cũng cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa các mẫu Tô mộc, các mẫu gỗ và vỏ thân có hàm lượng polyphenol cao hơn các mẫu vỏ hạt khoảng 2 đến 5 lần nhưng hoạt độ riêng (mIU/mg polyphenol) lại thấp hơn rất nhiều. Do đó có thể thấy có sự khác nhau về thành phần polyphenol của các mẫu Tô mộc. 3.1.2 Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid trong dịch chiết ethanol Ethanol được sử dụng để chiết rút polyphenol tổng số vì là một dung môi phân cực tốt, có khả năng chiết rút tốt các hợp chất tự nhiên, hơn nữa, ở nồng độ cao có thể loại bỏ một số tạp chất và các chất ức chế có bản chất là protein (có thể có). Quá trình chiết rút được thực hiện theo quy trình đã mô tả trong chương 2, dịch chiết này được gọi là dịch chiết polyphenol tổng số. Từ các dịch chiết polyphenol tổng số, flavonoid toàn phần được tách ra theo sơ đồ hình 2.1, các dịch chiết sau đó được định lượng polyphenol và xác định PIA. Bảng 3.4. Hàm lượng polyphenol tổng số và flavonoid toàn phần STT Mẫu Hàm lượng (mg/g bột khô) Hàm lượng (mg/g tươi) Polyphenol Flavonoid Polyphenol Flavonoid 1 Sắn thuyền 46,13 6,52 15,91 2,25 2 Đơn tướng quân 62,41 16,11 21,51 5,55 3 Đại hoàng 53,57 20,21 5,58 5,58 4 Đậu cọc rào 13,43 1,78 3,71 0,49 5 Cây Xoài 14,35 5,18 4,98 1,8 6 Gỗ Tô mộc 59,00 44,49 33,75 25,45 7 Vỏ thân Tô mộc 96,84 25,27 46,25 12,07 8 Vỏ hạt Tô mộc chín 51,93 1,55 41,08 1,23 9 Vỏ hạt Tô mộc xanh 21,39 1,99 7,19 0,67 Bảng 3.4 cho thấy khi chiết bằng ethanol 96%, lượng polyphenol tổng số thu được cao hơn khi chiết bằng nước, mẫu vỏ thân Tô mộc có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất (96,84 mg/g bột khô). Flavonoid Polyphenol tổng số mg/g bột khô Hình 3.2. Hàm lượng polyphenol của dịch chiết nước và dịch chiết EtOH của các mẫu Từ hình 3.2 có thể thấy khả năng chiết rút của ethanol tốt hơn nước nhiều lần, đặc biệt là các mẫu tô mộc, khả năng chiết rút tăng lên từ 5 đến 20 lần. Hàm lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu chiếm tỉ lệ tương đối thấp từ khoảng