Luận văn Sản xuất và bảo quản rượu vang nếp than quy mô xưởng thực nghiệm sử dụng Enzyme và nấm men thuần chủng

oài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường, CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt ñộ 25 – 300C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng ñạt ñược trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, ñến lúc nào ñó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi ñến bề mặt, do có sự thay ñổi ñột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men ñủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái ñộng, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường ñiều này làm cho quá trình trao ñổi chất diễn ra nhanh hơn, khi ñó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang ñiện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men ñiều ảnh hưởng ñến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng ñến quá trình lên men. 2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men: Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng ñến quá trình lên men rượu như sau: + Nồng ñộ ñường Nấm men chỉ có khả năng lên men ñường thành rượu trong khoảng nồng ñộ thích hợp từ 10 – 22%, nồng ñộ ñường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng ñộ ñường 30 – 35%, nồng ñộ ñường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. + Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ðể thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt ñộng sống của nấm men, cụ thể nấm men Saccharomyces cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 30 – 330C nhiệt ñộ tối ña là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men ñược nuôi cấy ở nhiệt ñộ thấp hơn nhiệt ñộ tối ưu ở 17–220C có năng lực lên men rất lớn. ðối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu ñược giới hạn nhiệt ñộ khá rộng từ 1-450C. Nếu nhịêt ñộ quá 500C nấm men sẽ chết. + Ảnh hưởng của acid (pH) Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH 2-8 nhưng thích hợp nhất là 4- 4,5. Vi khuẩn bắt ñầu phát triển ở pH 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu ñể ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH 3,8-4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần ( Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 16 thuần hoá) với ñộ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng ñiều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. ðể tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh ñến trung tâm hoạt ñộng của nấm men. + Ảnh hưởng của nồng ñộ rượu Nồng ñộ rượu sinh ra có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng ñộ rượu ảnh hưởng ñến tốc ñộ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, ñiều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng ñộ rượu ban ñầu 1% chưa có ảnh hưởng ñến tốc ñộ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4– 6% ñã có ảnh hưởng xấu. + Ảnh hưởng của oxy Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong ñiều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men ñường tạo thành rượu và CO2, còn trong ñiều kiện ñầy ñủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa ñường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2. Oxy là thành phần không thể thiếu ñược ở giai ñoạn phát triển sinh khối. Tuy nhiên, nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai ñoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai ñoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển. 2.3.3.4 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men + Sự tạo thành acid Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic. Acid acetic có thể ñược tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic trong ñó 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic ñược tạo bởi pyrovat dehydronase theo phản ứng: CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 17 Acid citric theo Laphon ñược tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng ñược biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic ñược tạo thành có thể theo hai con ñường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO = COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc ñược tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic ñược biểu diễn như sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2. Glycerin và aldehyde ñều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong ñiều kiện lên men nhằm mục ñích chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với ñiều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn ñường 2 – 3% so với lượng ñưa vào. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng ñường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và ñường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu ñạt 11,9%. Lên men ñường xảy ra theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH + Sự tạo thành rượu bậc cao Một trong những sản phẩm phụ quan trọng ñược tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào rượu etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu ñến chất lượng sản phẩm. ðó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic… Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin. Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao ñược ñơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2)-COOH + H2O = RCH2OH + NH3 + CO2. Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến ñổi của acid amin xảy ra trong ñiều kiện yếm khí chỉ có thể ñồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau ñó mất CO2 và cuối cùng aldehyde bị khử ñể tạo ra alcol. Bằng con ñường tương tự, nhiều acid amin cũng ñược tạo thành như valin và isoleucin…chúng là tiền ñề ñể tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xãy ra rất phức tạp, qua nhiều giai ñoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác ñộng cho các quá trình khác tiếp theo. + Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác Sự tạo thành ester Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 18 Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau ñể tạo ra những ester tương ứng. Phương trình tổng quát: R1CH2OH + R2COOH = R2COO-CH2R1 + H2O Este etylic có thể ñược tạo thành do alcol etylic kết hợp với acid acetic hoặc là do sự tham gia phản ứng của các aldehyde. Sự tạo thành metanol Trong quá trình nấu nguyên liệu, các chất pectin este của acid polygalacturonic bị thủy phân tạo thành acid pectic và alcol metylic. Sự tạo thành fufurol ðường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccarose, glucose, fructose và một ít maltose ñược tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt ñộ cao các ñường sẽ bị phân hủy và mất nước ñể tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin. ðường pentose bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol. Sự tạo thành aldehyde Là sản phẩm của quá trình trao ñổi chất ở nấm men và cũng có thể ñược tạo thành qua con ñường oxy hóa các loại rượu chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde. Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay ñổi theo nhiệt ñộ, pH, mức ñộ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. 2.4 SẮC TỐ ANTHOCYANIN TRONG RƯỢU VANG NẾP THAN 2.4.1 Cấu tạo của anthocyanin Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu ñỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa ñỏ và xanh (thành màu tím), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật. ðây là chất màu có rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới. Anthocyanin là glycosid của các anthocyanidin với monosaccharide, di và trisaccharide. Anthocyanidin ít tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên. Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium. Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau do ñộ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 19 Hình 8 Công thức cấu tạo của anthocyanidin 2.4.2 Tính chất của anthocyannin Màu của anthocyanin ñược xác ñịnh bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài. Có thể hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lại cho màu khác nhau. Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử sẽ làm cho nó chuyển từ màu ñỏ sang màu xanh (blue). Khi thay nhóm hydroxyl bằng nhóm methoxyl sẽ làm ngược lại khuynh hướng ñổi màu. pH thấp anthocyanin thường có màu ñỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa. Sự biến ñổi dạng anthocyanin theo pH: 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến anthocyanin + Nhiệt ñộ: khi tăng nhiệt ñộ sẽ dẫn ñến sự thay ñổi ñộ hấp thu cực ñại, màu của anthocyanin cũng giảm khi gia tăng nhiệt ñộ + pH: pH quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn ñến sự thoái hóa màu anthocyanin, hiệu quả của chất màu này ñạt cực ñại ở pH 3,5 + Thời gian bảo quản và ánh sáng: tăng thời gian bảo quản thì chất màu anthocyanin giảm và khi bảo quản ở các ñiều kiện môi trường khác nhau cũng ảnh hưởng ñến sắc tố anthocyanin. Thời gian bảo quản và chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên sự ổn ñịnh của anthocyanin. Các nhà nghiên cứu ñã cho rằng giữ mẫu ngoài ánh sáng thì nồng ñộ của chất màu giảm mạnh hơn trong tối. + Các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng ñến màu anthocyanin như nồng ñộ của các chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương ñối trong hỗn hợp các anthocyanin, ảnh hưởng của các sắc tố khác như carotenoid, chlorophyll. 2.5 VI SINH VẬT TRONG RƯỢU Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại này ñòi hỏi cần phải có oxy. Vi khuẩn acetic cần có oxi ñể phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong ñiều kiện hàm lượng oxy thấp. Trong nước quả, ngoài nấm men còn có nhiều loại vi khuẩn, vi khuẩn khó nghiên cứu hơn men vì kích thước nhỏ hơn men nhiều. Chỉ gần ñây nhờ có kính hiển vi ñiện tử mới biết rõ thêm về cấu trúc của chúng. Nấm men chuyển ñường thành rượu, gây một sự thay ñổi có ích, còn vi Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 20 khuẩn thì tác ñộng ñến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại như vi khuẩn xêrin làm cho rượu có vị chua, vị ñắng, có mùi hôi … 2.5.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic Rượu vang ñể tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ ñó là màng giấm. Khuẩn giấm biến cồn êtylic thành acid acetic, do ñó rượu vang có mùi giấm. Một phần nhỏ acid acetic lại hợp với cồn êtylic thành một este, ethyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm. Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi etyl acetate ñể ñánh giá rượu co bị chua giấm hay không. Phản ứng tạo thành giấm C2H5OH + O2 = CH3COOH + H2O Tuy nhiên, Peynaud cho rằng mùi chua giấm là do ethyl acetate, một este ñược hình thành bởi vi khuẩn acetic C2H5OH + CH3COOH = CH3COOC2H5 + H2O Một số vi khuẩn lên men giấm sản xuất ra nhiều etyl acetate hơn những sản phẩm khác, etyl acetate có thể bị mất do sự bay hơi trước khi lên men và hòa vào trong rượu. Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau ñây: - Số lượng khuẩn ban ñầu, do ñó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh ñể giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn - Nhiệt ñộ ảnh hưởng lớn, thí dụ lượng acid acetic hình thành ở 280C cao gấp ñôi ở 230C. - ðộ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua khuẩn giấm càng khó sinh sản, thí dụ dưới pH 3,2 rất ít khi thấy xuất hiện khuẩn giấm. - Polyphenol - tanin có tác dụng kìm hãm (nhẹ). - Các vitamin ảnh hưởng cũng như ñối với khuẩn lactic, cần thiết nhất là acid pantothenic, nicotinamic, acid - amino benzoic ñôi khi thiamin (B1). - Khuẩn giấm cần rất nhiều oxy. Thí dụ muốn tăng acid bay hơi 0,8 g trong một lít rượu vang, khuẩn phải có tối thiểu 2 lít không khi. Vậy giữ rượu vang trong chai, lọ nút kín, không cho tiếp xúc với không khi là cách tốt nhất ñể chống bệnh chua giấm. Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt ñộng của men giấm nên mặc dù có khuẩn nhưng không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm 2.5.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic 2.5.2.1 Sinh thái khuẩn lactic Loại vi khuẩn này có thể hiện diện ở bất cứ nơi ñâu như trên nguyên liệu, trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có. Không phải tất cả các vi khuẩn này ñều có thể tồn tại: một số không thể sinh sản ñược vì pH quá thấp, có ñộ cồn tăng lên dần thì vi khuẩn bị ức chế. Cuối cùng chỉ có một tỉ lệ rất thấp các vi khuẩn có mặt ở quả lúc ñầu sống sót và Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 21 sau này gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng ñược dần dần với ñiều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh. Cần chú ý là trong quá trình lên men, ñiều kiện không thuận cho vi khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các nấm men với số lượng lớn. Tế bào nấm men ñông hơn, thích hợp với cồn, với pH thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của vi khuẩn, và khi cho thêm SO2 vào lại thuận cho nấm men hơn là cho vi khuẩn vì nấm men chịu ñựng giỏi hơn. Như vậy, lên men malôlactic bắt ñầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kìm hãm dần lại và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết quả của sự thích nghi dần của một số tế bào vi khuẩn giỏi chịu ñựng. 2.5.2.2 Hoạt ñộng của vi khuẩn lactic Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên: ngay những giờ ñầu sự lên men lactic bắt ñầu nhưng sau ñó ngừng lại vì vi khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế. Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ít vi khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10000 vi khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy ñáng kể. Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày ñến vài tuần lễ, số lượng vi khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malôlactic mới bắt ñầu. Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng vi khuẩn lactic lại giảm. Các yếu tố ảnh hưởng ñến vi khuẩn lactic - ðộ pH có ảnh hưởng lớn, pH thích hợp cho vi khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ở ñộ pH này, vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy không phải acid malic mà là ñường, acid tatric... làm hỏng rượu. Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì vi khuẩn hoạt ñộng rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số khuẩn cầu (Leuconostoc). - Nhiệt ñộ tác ñộng ñến vi khuẩn cũng giống như ñối với nấm men, thích hợp nhất là vào khoảng 25-300C. Tuy nhiên, nhiệt lên tới 300C khi lượng cồn etylic ñã cao thì vi khuẩn lactic có thể bị diệt. Vì vậy, khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250C thích hợp. - Yêu cầu ñối với oxy: người ta thường cho vi khuẩn lactic yếm khí, trái với vi khuẩn giấm háo khí. Thực ra vi khuẩn lactic có thể chịu ñược yếm khí nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt ñộng có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khí. - Yêu cầu ñối với acid amin: mỗi loài vi khuẩn có những yêu cầu nhất ñịnh ñối với từng loại acid amin; yêu cầu của vi khuẩn cầu cao hơn vi khuẩn que về mặt này. - Yêu cầu ñối với cac vitamin: cũng như nấm men, vi khuẩn cần có những vitamin nhất ñịnh ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của vi khuẩn que lại cao hơn vi khuẩn cầu. Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho ña số vi khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và ñôi khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tinh chất kích thích tùy theo loại vi khuẩn. 2.5.2.3 Kết quả hoạt ñộng của khuẩn lactic lên men malolactic và các bệnh rượu - Lên men malolactic: vi khuẩn lactic gây nên những sự thay ñổi trong rượu ña số là có hại, chỉ có một sự thay ñổi có ích (biến acid malic thành acid lactic). Acid malic trong công Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 22 thức có 2 nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có một nhóm COOH, một chức acid; nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm ñộ chua ñược một nửa, rượu dịu ñi, ngoài ra acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn. Lên men malolactic không cung cấp năng lượng cho vi khuẩn lactic cho nên vi khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu ñể lấy năng lượng. Vì vậy, không có vi khuẩn lactic nào hoàn toàn có ích cả. Thực ra người ta phân biệt hai nhóm vi khuẩn lactic: một nhóm bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành phần khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, một nhóm thứ hai thường chỉ quen phân hủy acid malic và là khuẩn có ích và chỉ có hại trong những ñiều kiện ñặc biệt. Trong quá trình chế biến rượu, khi theo dõi lên men rượu, ñồng thời cũng phải theo dõi lên men malolactic. Phải phân tích ñịnh kỳ ñều ñặn ñộ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic. Khi nào hết acid malic thì gạn cặn, lọc ñể loại bớt vi khuẩn -nếu cần tiệt trùng. - Bệnh rượu vang: Chỉ có lên men malolactic là tăng chất lượng của vang, những biến ñổi khác do vi khuẩn lactic gây ra ñều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh. Bệnh vang dính (vins filants): khi rót rượu ra cốc vang không chảy ñều, lỏng như nước mà dính như có hồ nếp. ðó là do vi khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những ñiều kiện nhất ñịnh, tiết ra quanh mình một loại ñường riêng gọi là dextran. Bệnh nay thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang ñắng.. Bệnh chua lactic (piqure lactique): xảy ra khi trong rượu vang còn lại ñường khử, chưa chuyển hết thành rượu. ðường khử bị vi khuẩn lactic phá hủy chuyển thành ñường manic và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu. Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều ñường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho men ngừng hoạt ñộng nửa chừng hoặc do cấy men chưa ñủ, lượng nhiệt quá cao. Bệnh chua tatric (tourne): xảy ra khi vi khuẩn lactic phá hủy acid tatric làm cho rượu ñục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt...Chỉ khi pH cao hơn 3,5-3,6 mới có bệnh này vì vậy rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh. Bệnh ñắng: Xảy ra khi men lactic phá hủy glycerin. Rượu trở thành chua, có vị ñắng do các chất acrolêin hình thành. Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 23 CHƯƠNG III – PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 PHƯƠNG TIỆN Thí nghiệm ñược tiến hành tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường ðại học Cần Thơ. 3.1.1 Nguyên liệu Gạo nếp than (Mua tại cửa hàng gạo số 2, chợ Xuân Khánh, Cần Thơ) Nấm men thuần chủng: Saccharomyces cerevisiae (nấm men Pháp) Enzyme α-amylase (Termamyl 120L) Enzyme glucoamylase (AMG 300L) ðường saccharose (Sử dụng ñường Biên Hòa mua tại Metro). 3.1.2 Hóa chất sử dụng Acid citric Acid sorbic Muối Ca2+ Các hóa chất sử dụng ñể chuẩn ñộ acid, aldehyde, ester, methanol. 3.1.3 Trang thiết bị Thiết bị ñường hóa và dịch hóa nếp than Máy nghiền búa Cồn kế Máy ño màu quang phổ Nhiệt kế, máy ño pH Một số kiệu lớn làm dụng cụ chứa trong quá trình bảo quản. Cân ñiện tử và một số dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm. 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme glucoamylase (AMG 300L) ñến hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của dịch ñường trong quá trình ñường hóa Mục ñích: Tìm ra nồng ñộ enzyme tối ưu cho quá trình ñường hóa. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố là nồng ñộ enzyme glucoamylase và số lần lặp lại thí nghiệm là 2 lần. Nhân tố A: Nồng ñộ enzyme AMG 300L (%) A1=0,2; A2=0,3; A3=0,4; A4=0,5; A5=0,6 Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 24 Tổng số ñơn vị thí nghiệm: 5x2=10 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm như sau Cách tiến hành Nếp than ñược nghiềm mịn sau ñó cho nước vào với tỉ lệ 1 nếp và 4 nước. Sử dụng enzyme α-amylase (Termamyl 120L) ñể dịch hóa nếp than với nồng ñộ 0,05 % bổ sung 70 ppm Ca2+, thời gian 30 phút, ở nhiệt ñộ 860C và pH 6,6. Sử dụng enzyme glucoamylase với các nồng ñộ 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 và 0,6% ta tiến hành ñường hóa dịch nếp trong thời gian 30 phút ở nhiệt ñộ 690C và pH 4,0. Ghi nhận kết quả hàm lượng ñường khử và ñộ Brix của sản phẩm sau quá trình ñường hóa. 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men ñến thời gian lên men chính và chất lượng rượu sau quá trình lên men Mục ñích: Nhằm tìm ra tỉ lệ nấm men tối ưu cho quá trình lên men. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm ñược bố trí ngẫu nhiên với một nhân tố là tỉ lệ nấm men và 2 lần lặp lại. Nhân tố B: Tỉ lệ nấm men sử dụng (%) B1=0,06%; B2=0,08%; B3=0,10%; B4=0,12% Tổng số ñơn vị thí nghiệm: 4x2=8 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm Pha nước (tỉ lệ nếp 1: nước 4) Dịch hóa (0,05% Termamyl 120L, 70ppm Ca2+, thời gian 30 phút, nhiệt ñộ 860C, pH 6,6) ðường hóa (thời gian 30 phút, nhiệt ñộ 690C, pH 4,0) Gạo nếp than nghiền mịn A1=0,2(%) A2=0,3(%) A3=0,4(%) A4=0,5(%) A5=0,6(%) (Nồng ñộ enzyme AMG 300L) Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 25 Cách tiến hành Sau khi tìm ra ñược mẫu enzyme tối ưu cho quá trình ñường hóa ta lấy mẫu sau ñường hóa lọc bỏ bã nếp, thu dịch trong. ðiều chỉnh dịch ñường lên 220Bx và chỉnh pH ñạt 4,5-5,0. Thanh trùng dịch ñường ở 80-850C trong vòng 30 phút, sau ñó làm nguội xuống 30-330C, cho nấm men Saccharomyces cerevisiae thuần chủng vào ở những tỉ lệ khảo sát và tiến hành lên men ở ñiều kiện lên men yếm khí. Kiểm tra ñộ rượu, ñộ trong, lượng tạp chất của từng sản phẩm và thời gian kết thúc quá trình lên men chính từ ñó tìm ra ñược nồng ñộ enzyme tối ưu. Pha nước (tỉ lệ nếp 1: nước 4) Dịch hóa (0,05% Termamyl 120L, 70ppm Ca2+, thời gian 30 phút, nhiệt ñộ 860C, pH 6,6) ðường hóa (Nồng ñộ enzyme AMG 300L tối ưu, thời gian 30 phút, nhiệt ñộ 690C, pH 4,0) Gạo nếp than nghiền mịn B1=0,2(%) B2=0,3(%) B3=0,4(%) B4=0,5(%) Lọc bỏ bã nếp ðiều chỉnh pH (4,5-5,0) và ñộ Brix =22o Thanh trùng Làm nguội (30-330C) Bổ sung nấm men (theo các tỉ lệ như sau) Lên men chính Luận văn tốt nghiệp ðại học khóa 31 Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm 26 3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát một số thay ñổi trong quá trình sản xuất và bảo quản sản phẩm theo thời gian ở quy mô xưởng thực nghiệm Mục ñích thí nghiệm: Rượu sẽ ñược bảo quản trong kiệu sành lớn và ở nhiệt ñộ phòng thí nghiệm cùng với việc sử dụng chất bảo quản là acid sorbic. Mục ñích của thí nghiệm này là ta sẽ khảo sát một số thay ñổi xảy ra trong thời gian bảo quản sản phẩm. Những thay ñổi chủ yếu ñược khảo sát trong thí nghiệm là: thay ñổi ñộ rượu, ñộ trong, lượng tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản rượu như lượng acid, ester, aldehyde, methanol, fufurol. Các bước tiến hành thí nghiệm Sản phẩm rượu sau khi ñược chế biến ra tiến hành ñe