Luận văn So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà ri, gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên

O3 2% trong NaOH, dung dịch B CuSO4 0,5% trong natricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2. Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1); Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl (0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide. Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma. Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g; Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g. Dẫn nước đến 100ml. Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8); EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%. Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH; EDTA (0,5mM, pH8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…). Bộ hóa chất CloneJET TM PCR Cloning của hãng Fermentas Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC. - Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II (Sol II); Dung dịch III (Sol III). 2.1.2. Thiết bị Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học. Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Hãng sản xuất Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC Sanyo, Nhật Bản Máy li tâm Sorvall Máy đo pH Mettler, Anh Lò vi sóng Samsung, Hàn Quốc Cân phân tích Metter Toledo, Thụy Sỹ Pipetman các loại Gilson, Pháp Máy điện di PowerPac 300, Mỹ Máy PCR - PTC100 MJ Research, Mỹ Máy làm khô chân không Speed Vac Sc 110A-Savan, Mỹ Máy chụp ảnh Bio-Rad, Mỹ Máy khuấy trộn OSI, Rotolab Máy xác định trình tự tự động ABI PRISM TM 3100 Genetic Analyser Applied Biosystems, Mỹ Máy Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems, Mỹ Bể ổn nhiệt Tempette Junior Tech Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh 2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số liệu trên máy vi tính. 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng nước Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử rồi cho vào tủ sấy ở 60oC trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới khi khối lượng không đổi. Hàm lượng nước được tính theo công thức: N = 100t k t P P P % Trong đó: N: Hàm lượng nước (%) Pt: Khối lượng mẫu tươi (g) Pk: Khối lượng mẫu khô (g) 2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số Định lượng lipid tổng số theo phương pháp chiết bằng petroleum ether và cân trọng lượng đầu và cuối [13]. Nguyên tắc: Dựa vào tính hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ (ete, benzen, chloroform...) để chiết rút lipid ra khỏi nguyên liệu. Tiến hành: Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối nghiền nhỏ cho vào tube, cho 1,5 ml petroleum ether vào ống đã chứa mẫu, lắc đều trên máy Vortex 15 phút. Tiến hành chiết 3 lần. Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch. Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết, soi lên kính. Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết. Sấy khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi. Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức: L = 100 A B A % Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%) A: Khối lượng mẫu ban đầu (g) B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g) 2.3.1.4. Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry) Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và protein (phản ứng Biure). Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein. Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu. Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol, pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các axit tự do Tyr, Trp. Hoặc cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn 1%, axit Cl3COOH, hay HClO4. Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch. Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung dịch chứa mẫu vài chục g protein. Vì vậy phương pháp này được áp dụng khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hoặc giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 cường độ của phức chất với thuốc thử folin. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm. Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30' đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm. Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml. Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml). Từ đó tính hàm lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức: % protein = %100 g Pa Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ P: hệ số pha loãng (200) g: số mg mẫu cần phân tích 2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được theo phương pháp thông kê sinh học trên máy vi tính bằng chương trình Excel [6] với các thông số: Giá trị trung bình X n X X n 1i i Độ lệch chuẩn X S )30( 1 )30( 1 2 1 2 n n XX S n n XX S n i i X n i i X Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Sai số trung bình X m )30( 1 )30( n n S m n n S m X X X X 2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật Nguyên tắc chung Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm. Quy trình kỹ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau: Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn. Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K. Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 l dịch. Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Hút pha trên vào ống mới. Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC. Thu pha trên. Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn. Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ. 2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc chung Điện di là kỹ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb). Quy trình kỹ thuật Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agarose vào 100ml dung dich đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50 - 60ºC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược. Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE. Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp (3 l) với đệm tra mẫu (2,5 l), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80mA trong khoảng 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 l/ ml. Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch. Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-Rad. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 2.3.2. 3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998. Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21]. Nguyên tắc chung Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài. PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. - Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi. - Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn, nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra. Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên liệu - DNA khuôn (Template). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 - Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt. Ở đây, H (Heavy) và L (Light) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15]. - Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4 + , dNTPs 10mM, MgCl2 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas. - Nước khử ion vô trùng. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 l như trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen Nước 10,85 l Buffer 2,5 l MgCl2 4 l dNTPs 2,5 l Mồi H1255-F 0,5 l Mồi L16725-R 0,5 l Taq DNA polymerase 0,15 l DNA temp 4 l Tổng thể tích 25 l Chu trình nhiệt 94ºC - 4 phút (94ºC - 1 phút; 50ºC- 1 phút; 72ºC- 1 phút 20 giây) x 30 chu kỳ; 72ºC -10 phút; giữ ở 4ºC. Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau: Phản ứng ghép nối đoạn AND vào vector đầu bằng pJET1/Blunt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Phản ứng nối ghép được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của bộ hóa chất Gene JETTM PCR Cloning Kit. Vector tách dòng trong bộ Kit này là pJET1/Blunt chỉ ghép nối được với những đoạn DNA có đầu bằng hoặc đã dược làm bằng hóa. Ngoài ra hãng sản xuất đã cung cấp kèm theo enzyme AND blunting có tác dụng làm bằng hóa đầu của đoạn DNA cần ghép nối. Vì vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm PCR). Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp phản ứng gồm có 5µl 2X Reaction Buffer; 3µl sản phẩm PCR; 0,5µl H2O; 0,5µl enzyme làm bằng hóa DNA. Sau thời gian phản ứng, DNA blunting được biến tính ở nhiệt độ 70oC trong 5‟. Phản ứng ghép nối gen được tiến hành bằng cách bổ sung vào 0,5µl vector pJET1/Blunt Cloning vector (50ng/µl) và 0,5µl enzyme nối T4 ligase (5u/µl). Hỗn hợp này được để ở nhiệt độ phòng từ 5-30‟ sau đó dùng để biến nạp vào tế bào E. Coli. Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 30 phút. Sốc nhiệt ở 42ºC trong 90 giây sau đó chuyển ngay vào đá và giữ trong 5 phút. Bổ sung 300 l SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37ºC trong 1 giờ. Cấy trải các tế bào này trên môi trường LB đặc có bổ sung thêm các thành phần như sau: Amp (50 l/ml) và nuôi ở 37ºC qua đêm. *Thành phần các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: - LB lỏng (môi trường Luria- Bertani): Bacto-Trypton 10g/l; cao nấm men 5g/l; NaCl 10g/l; NaOH 2mM. - LB đặc: gồm môi trường LB lỏng có bổ sung Agar - Agar 15g/l. - Môi trường SOC: Trypton 5 %; cao nấm men 0,5 %; NaCl 10mM; KCl 2,5mM; MgCl2 10mM; MgSO4 10mM; Glucose 20mM. Tách DNA plasmid Các khuẩn lạc trắng sau khi biến nạp được cấy chuyển, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p trong 2ml môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 37ºC, 15 giờ. Sau đó, lắc đều hỗn hợp nuôi cấy và đổ dịch vào trong ống eppendoft loại 1,5 ml rồi tiến hành thu plasmid theo quy trình kỹ thuật sau: Ly tâm ở 6000 v/p, 6 phút, 4ºC. Bỏ dịch, thấm khô. Bổ sung 150 l sol I, vortex cho tan tủa. Thêm 150 l sol II, đảo nhẹ, và giữ trong đá. Thêm 150 l sol III, đảo nhẹ, giữ trong đá hoặc để trong tủ lạnh 0ºC trong 5'. Ly tâm 12000 vòng, 15 phút, 4ºC. Hút dịch sang ống eppendoft mới. Thêm 1 ml cồn 100%, đảo nhẹ và để lạnh ở -20ºC trong ít nhất là 3 giờ. Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC. Thu cặn, rửa tủa bằng EtOH 70%, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút, 4ºC. Làm khô mẫu trong máy hút chân không. Cho 30 l RNAse 10 g/ ml, búng đều và ủ mẫu ở bể ổn nhiệt ở 37ºC trong 1 giờ. Điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. *Thành phần của các dung dịch tách chiết plasmid: - Dung dịch I (Sol I): Glucose, Tris- HCl (1M, pH8), EDTA (0,5M, pH 8). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Dung dịch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M. Pha mới trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Dung dịch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (giữ ở tủ 4ºC). Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn Mục đích của bước này là kiểm tra xem đoạn DNA đích có được chèn vào vector hay không. Thành phần của phản ứng cắt bao gồm: Buffer Tango 1 l; enzyme XbaI 0,2 l (10u/ l); DNA plasmid 3 l; H2O 5,6 l (tổng thể tích 10 l). Hỗn hợp này sau đó đem ủ ở 37ºC trong ít nhất 3 giờ. Sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose 0,8%. 2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l. Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 như sau: 94ºC- 1 phút; (96ºC-10 giây; 50ºC- 5 giây; 60ºC- 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩm được giữ ở 4ºC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SO SÁNH THÀNH PHẦN HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 3.1.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tƣơi Đây là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng trứng, trứng nhiều lòng đỏ được nhiều người ưa thích bởi lòng đỏ là nơi tập trung nhiều chất dinh dưỡng, nhiều loại protein, lipit, các vitamin, axit béo no và không no bổ dưỡng, dễ tiêu... Vì vậy, chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến chỉ tiêu này, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. và hình 3.1. Bảng 3.1. Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi (n=30) Trứng gà Tỷ lệ lòng đỏ (%) X X m Tỷ lệ lòng trắng (%) X X m Tỷ lệ lòng đỏ/ lòng trắng Vỏ( %) X X m Ri (Rhy) 32.7 ± 0,66 57.9± 0,81 0.56 9.4± 0,22 Mông (Mna) 34.82 ± 0,53 54.05± 0,77 0.65 11.13± 0,13 Sao (Sdt) 29.67± 0,84 54.5± 0,58 0.55 15.9± 0,26 0 10 20 30 40 50 60 Tỷ lệ lòng đỏ (%) Tỷ lệ lòng trắng (%) Vỏ (%) chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy ) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.1. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà thí nghiệm Theo kết quả bảng 3.1 và hình 3.1 tỷ lệ lòng đỏ ở gà Mông cao nhất, thấp nhất ở gà Ri, tỷ lệ lòng trắng gà Ri cao nhất, tỷ lệ vỏ cao nhất ở gà Sao. Tỷ lệ này khá đồng đều ở các nhóm trứng nghiên cứu, đây đều là những giống gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 có chất lượng trứng cao được ưa chuộng trên thị trường. 3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô Tỉ lệ giữa hàm lượng nước và vật chất khô trong trứng gà là một chỉ tiêu quan trọng, rất có ý nghĩa trong việc đánh giá chất lượng của trứng gà. Sau khi tiến hành cân, sấy mẫu trứng gà ở 600C trong 3 ngày cho đến khi khối lượng không thay đổi, kết quả được trình bày trong bảng 3.2. và hình 3.2. Bảng 3.2. Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà (n = 30) Trứng gà Lòng đỏ X X m Lòng trắng X X m Vỏ X X m Cả quả X X m Ri (Rhy) 47,28± 0,96 13,52± 0,41 9,022± 0,09 50,34± 1,1 Mông (Mna) 50,76± 1,03 14,64± 0,39 9,105± 0,11 52,15± 1,4 Sao (Sdt) 54,09± 1,17 15,98± 0,53 9,519± 0,25 55,09± 1,3 0 1 2 30 40 50 60 lòng đỏ Lòng trắng Vỏ Cả quả Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông ( Mna) Sao (Sdt) Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô trứng gà thí nghiệm Hàm lượng nước lòng đỏ, lòng trắng, vỏ và cả quả đều cao nhất ở trứng gà Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 và thấp nhất ở gà Sao (Sdt): 45,91%; 84,02%; 4,81%; 44,91%. Tỷ lệ vật chất khô ở trứng gà Sao là cao nhất và ở trứng gà Ri là thấp nhất. Tỷ lệ nước lòng đỏ và lòng trắng theo nghiên cứu của Lê Viết Ly (2001) [5] ở gà Ri là 47,32%; ± 1,137; 87,925 ± 0,109 và vật chất khô lòng đỏ là 52,616 ± 1,137 và lòng trắng là 12,075 ± 0,109. Còn gà Mông Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 ở Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41. Ở trứng gà Ác hàm lượng nước lòng đỏ là 49,3% ± 1,9; hàm lượng nước lòng trắng là 88,8% ± 0,4 [9]; Hàm lượng nước ở lòng đỏ trứng nói chung khoảng 49% , hàm lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản. Như vậy kết quả nghiên cứu phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, hàm lượng nước và vật chất khô là tính trạng số lượng, nó phụ thuộc vào giống, nguồn thức ăn và đặc biệt còn phụ thuộc vào điều kiện bảo quản trứng như phần tổng quan đã đề cập. 3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số Hàm lượng lipid tổng số cũng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng trứng. Lipid là một trong những chất dự trữ đem lại giá trị năng lượng cao rất cần thiết cho cơ thể sinh vật nói chung và gà nói riêng. Hàm lượng lipit tập trung chủ yếu ở lòng đỏ, lòng trắng hàm lượng lipit không đáng kể. Do đó hàm lượng lipit liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ lòng đỏ/lòng trắng. Kết quả đo chỉ tiêu hàm lượng lipid tổng số chiết bằng petroleum ether được trình bày ở bảng 3.3. và hình 3.3. Bảng 3.3. Hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà L.L đỏ (%) X X m L.Ltrắng (%) X X m L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) X X m Ri (Rhy) 64± 0,9 11.33± 0,3 5.65 37.67± 0,58 Mông (Mna) 63.33± 0,3 5.33± 0,8 11.88 34.33± 0,3 Sao (Sdt) 64.67± 0,8 6.67± 1.19 9.70 35.67± 0,65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 0 10 20 30 40 50 60 70 L.Lòng đỏ (%) L.Lòng trắng (%) L. Lđỏ/ L. Ltrắng L tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.3. và hình 3.3. ta thấy hàm lượng lipid lòng đỏ cao nhất ở gà Sao (Sdt) và thấp nhất ở gà Mông (Mna). Theo tác giả Rôse [27] thì hai phần ba lipit trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron. Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho.Vì vậy lòng đỏ trứng được nhiều người ưa chuộng, hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn. Lipit lòng trắng cao nhất ở gà Ri và thấp nhất ở gà Mông. Như vậy, ta thấy rằng hàm lượng lipid tổng số cao nhất ở trứng gà Ri (37.76%) thấp nhất ở trứng gà Mông Nghệ An (34.33%). Nếu so sánh với kết quả nghiên cứu trên trứng gà công nghiệp của Rôse [27] thì hàm lượng lipit của các giống gà trên cao hơn hẳn. Tỷ lệ lipit lòng đỏ/lòng trắng cao nhất ở gà Mông, thấp nhất ở gà Ri. 3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số Hàm lượng protein là một chỉ tiêu rất quan trọng trong việc đánh giá giá trị dinh dưỡng của trứng gà. Bằng phương pháp Lowry với máy đo quang phổ, chúng tôi đã thu được kết quả hàm lượng protein thô ở trứng gà của các giống nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4. và hình 3.4. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.4. Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm (n = 10) Trứng gà Pr-Lđỏ (%) X X m Pr-Ltrắng(%) X X m Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số %) X X m Ri (Rhy) 18.32± 0,64 12.86± 0,24 1.42 15.59± 0,42 Mông (Mna) 16.31± 0,51 12.94± 0,33 1.26 14.63± 0,39 Sao (Sdt) 20.27± 0,82 14.2± 0,49 1.43 17.24± 0,51 0 5 10 15 20 25 Pr-Lđỏ Pr-Ltrắng (%) Pr-Lđỏ/ Pr- Ltrắng Pr tổng số (%) Chỉ tiêu so sánh % Ri (Rhy) Mông (Mna) Sao (Sdt) Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm Qua bảng 3.4. và hình 3.4. ta thấy hàm lượng protein tổng số cao nhất ở trứng gà Sao (17,24%) và thấp nhất ở trứng gà Mông (14,63%). Đặc biệt hàm lượng protein lòng đỏ rất cao 20,27%. Gà sao là giống gà đẻ trứng tập trung 6 tháng liền từ tháng 3 đến tháng 9 (âm) sau đó người ta thu hoạch thịt gà trưởng thành và nuôi lứa khác nên điều này rất có ý nghĩa kinh tế. Kết quả nghiên cứu trên có thể đưa ra một định hướng về chăn nuôi gà Sao, một giống gà rất có giá trị kinh tế, dễ nuôi. Theo kết quả nghiên cứu trên lòng đỏ của trứng gà Ác [9] có hàm lượng protein là 17,6% ± 0,5 thì hàm lượng protein lòng đỏ của trứng gà ri cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [33]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu trên gà Mông nuôi tại Trạm Tấu Yên Bái tỷ lệ protein lòng đỏ là 16.66%, lòng trắng 11,01%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 3.2. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Sao chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty t