Luận văn So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp.để chế biến thức uống chức năng

ủa vi khuẩn BsTC và Bn 2.2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase [18] Nguyên tắc Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học. Dụng cụ và hóa chất - Máy đo quang phổ. - Bể ổn nhiệt. - Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2) + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g Na2HPO4 hòa tan, dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch a). + Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1 g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch b). + Để chỉnh pH = 6,2: 81,5 ml dung dịch a + 18,5 ml dung dịch b. - Dung dịch tinh bột 1%: 1 g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10 – 15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100 ml. - Dung dịch Lugol: 0,5 g Iod + 5 g KI, thêm nước cất cho đủ 200 ml. - Dung dịch HCl 1N: hòa tan 85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít. - Dung dịch NaCl 3%: cân 3 g NaCl hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml. Tiến hành Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất Ống chuẩn Ống thử 1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% Đem ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kìm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗi ống. Cho tiếp một giọt dung dịch Lugol vào mỗi ống. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm. Đơn vị hoạt tính của enzyme amylase được tính theo công thức: UI= mta LCba ** **)(  a: mật độ quang học của ống chuẩn. b: mật độ quang học của ống thử. C: lượng tinh bột ban đẩu tham gia phản ứng (10mg). L: hệ số pha loãng m: trọng lượng (g) hoặc thể tích (ml) mẫu. * Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease [11] Nguyên tắc Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng enzyme. Dụng cụ hóa chất - Ống nghiệm. - HCl 0,1M. - Bể ổn nhiệt. - NaCl 2M. - Máy đo quang phổ. - NaOH 0,1N. - Giấy lọc. - H3PO41/30M. - Dung dịch trichloroacetic 5%. - Na2CO3 0,4M. - Dung dịch đệm phosphat pH = 6,2. - Ca(CH3COOH)2 0,2M. - Tyrosin tinh khiết. - Dung dịch casein 1%. - Thuốc thử Folin. Tiến hành  Dựng đường chuẩn Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g tyrosin /1 ml HCl 0,1M. Thêm 5 ml Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch tyrosin (các nồng độ khác nhau ở trên) và thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều để ổn định dung dịch ở 37±0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả AS10, AS20, AS30, AS40, AS50.) Ống đối chứng: dùng 1ml HCl 0,1M thay cho tyrosin, đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 660 nm (ghi nhận kết quả này AS0). Dựng đường chuẩn theo hàm lượng g tyrosin và độ hấp thụ: 5 5040302010 050040030020010 SSSSSSSSSS AAAAAAAAAAF            Định lượng enzyme trong mẫu Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein vào ống nghiệm, ủ ở nhiệt độ 37±0,50C trong 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1ml dung dịch enzyme vào, lắc đều, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ 37±0,50C trong 60 phút. Sau đó cho vào hỗn hợp này 2 ml dung dịch trichloroacetic (TCA) 5%. Để ổn định nhiệt trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5ml dung dịch Na2CO3vào 1 ml dịch lọc. Cho thêm thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào hỗn hợp, để yên ở 37±0,50C trong 20 phút. Khi xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm. Mẫu đối chứng: lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự ở mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Tính kết quả Một đơn vị hoạt tính enzyme protease chính là lượng enzyme tạo amino acid tương đương 100 µg tyrosin trong 1 ml dịch lọc trong điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease: ĐVHT/g hoặc ml dung dịch enzyme= (A60 – A0)*F*n*1/100 A60: độ hấp thụ của mẫu. A0: độ hấp thụ của mẫu đối chứng. F: hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosin và độ hấp thu ở bước sóng 660nm trên đường chuẩn. n: hệ số pha loãng mẫu. 1/100: hệ số chuyển đổi. 2.2.5.2. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn Có ba yếu tố cần khảo sát: thời gian, nhiệt độ và pH vì đây là một trong những yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính hệ enzyme của vi khuẩn. * Yếu tố thời gian - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ ở nhiệt độ phòng lần lượt theo các mốc thời gian: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 giờ. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc thời gian trên. * Yếu tố nhiệt độ - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở các nhiệt độ: 15, 20, 25, 30, 35, 40, 450C trong 24 giờ, pH cơ chất. - Xác định hoạt tính enzyme ở các mốc nhiệt độ trên. * Yếu tố pH - Cấy 1% (v/w) vi khuẩn BsTC , Bn đã hoạt hóa trong môi trường sữa đậu nành vào cơ chất đậu hũ tại cùng thời điểm. - Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ với pH lần lượt là 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. - Xác định hoạt tính enzyme các mẫu trên. 2.2.5.3. Tối ưu hóa điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC và Bn [1] Chúng tôi bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với ba yếu tố thời gian, nhiệt độ, pH vì đây là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của BsTC , Bn. Yếu tố không đổi trong quá trình khảo sát là cơ chất đậu hũ và tỉ lệ giống cấy 1% (v/w). Số thí nghiệm tối ưu 23 = 8, ngoài ra còn có thêm 3 thí nghiệm ở tâm để kiểm tra ý nghĩa các hệ số của phương trình hồi quy. Ba yếu tố cần khảo sát: - X1 là yếu tố thời gian với các giới hạn được xác định sau khảo sát ở trên. - X2 là yếu tố nhiệt độ với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. - X3 là yếu tố pH với các giới hạn được xác định sau khi khảo sát ở trên. Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme được tính sau đo OD595 (amylase) hoặc OD660 (protease). Bảng 2.1. Bố trí quy hoạch thực nghiệm Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y 1 + + + 2 + + - 3 + - + 4 + - - 5 - + + 6 - + - 7 - - + 8 - - - 9 0 0 0 10 0 0 0 11 0 0 0 Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. 2.2.6. Quy trình công nghệ lên men đậu hũ chế biến thức uống chức năng Hình 2.3. Quy trình công nghệ thủy phân đậu hũ làm thức uống chức năng Giải thích quy trình  Nhân giống Sau khi so sánh hoạt tính enzyme của BsTC và Bn, chọn vi khuẩn có hoạt tính enzyme tối ưu hơn để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. Dùng que cấy lấy vi khuẩn được chọn từ ống giống để cấy vào 10 ml môi trường sữa đậu nành đã thanh trùng, nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng.  Lựa chọn nguyên liệu Chất lượng đậu hũ có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, đặc biệt là giá trị cảm quan của sản phẩm. Yêu cầu của đậu hũ: Nhân giống trong môi trường sữa đậu nành Giống vi khuẩn được chọn Đậu hũ Hấp thanh trùng (1000C, 15 phút) Lên men Xay nhuyễn Cấy giống Cấy Lactobacillus sp. Phụ gia Sản phẩm - Trắng, mềm, mịn. - Mùi thơm. - Vị béo. - Đảm bảo vệ sinh và ổn định chất lượng.  Thanh trùng Hấp thanh trùng ở 1000C trong 15 phút nhằm tiêu diệt và ức chế một phần các vi sinh vật có trong đậu hũ để chuẩn bị cấy giống vào cho quá trình lên men.  Xay nhuyễn Dùng máy xay sinh tố gia đình (đã vô trùng) để xay đậu hũ tơi nhuyễn trong thời gian 3 phút.  Cấy giống Cấy giống phải thực hiện trong tủ cấy đã được vô trùng bằng cách lau cồn, chiếu đèn cực tím. Hút giống đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cho vào đậu hũ đã xay nhuyễn với tỉ lệ đã được khảo sát - Tỉ lệ giống khảo sát: 0.5%, 1%, 2% (v/w).  Lên men Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện đã khảo sát. - Khảo sát thời gian lên men: 15, 18, 21, 24, 27 giờ.  Cấy Lactobacillus sp. Cấy vi khuẩn Lactobacillus sp. đã được tăng sinh từ môi trường sữa đậu nành cùng với lượng đường saccharose đã được khảo sát vào đậu hũ đã được lên men nhằm mục đích bảo quản và tạo vị chua đặc trưng vì theo nguyên tắc Lactobacillus sp. sẽ sử dụng đường saccharose làm nguồn dinh dưỡng và lên men tạo acid lactic. - Khảo sát tỉ lệ giống Lactobacillus bổ sung vào: 0%,1%, 2% (v/w). - Khảo sát lượng đường saccharose bổ sung: 0%, 1%, 2% (v/w) - Khảo sát điều kiện bảo quản: nhiệt độ phòng và tủ lạnh (10-200C). - Theo dõi thời gian bảo quản. Bổ sung phụ gia Nhằm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm ta cần bổ sung một số phụ gia với nồng độ phù hợp sau khi khảo sát. - Về màu sắc, sản phẩm có màu trắng của đậu hũ rất có giá trị cảm quan nên không bổ sung phụ gia tạo màu. - Về mùi, sản phẩm có mùi đậu hũ lên men nên chúng tôi chọn hương phomai có mùi thơm béo như đậu hũ. Khảo sát tỉ lệ hương bổ sung: 10/00, 2 0/00, 3 0/00, 4 0/00(v/w). - Về vị, chúng tôi sử dụng đường aspartam, là loại đường tạo vị ngọt nhưng không chứa calo. Khảo sát tỉ lệ đường aspartam bổ sung: 0,350/00, 0,7 0/00, 1,05 0/00, 1,4 0/00 (v/w) tương đương 1, 2, 3, 4 gói thành phẩm đường aspartam (35 mg/gói). 2.2.7. Phương pháp phân tích 2.2.7.1. Xác định độ ẩm [3] Nguyên tắc Làm bay hơi hết nước trong thực phẩm. Cân trọng lượng thực phẩm trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. Dụng cụ - Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ. - Cân phân tích. - Bình hút ẩm. - Đĩa Petri. Cách tiến hành - Cân đĩa sấy khô. - Cân 10 g mẫu đã chuẩn bị sẵn, nghiền nhỏ cho vào đĩa Petri. - Cho tất cả vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100 – 1050C, sấy khô đến trọng lượng không đổi, thường tối thiểu là 6 giờ. - Sấy xong, đem làm nguội ở bình hút ẩm (25 – 30 phút) và đem cân ở cân phân tích với độ chính xác đến 0.0001 g. - Cho vào lại tủ sấy 100 – 1050C trong 30 phút, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân liên tiếp không được cách nhau quá 0.5 mg cho mỗi gam chất thử. Tính kết quả Độ ẩm theo phần trăm (X) được xác định bằng công thức: X = (G1 – G2) * 100 / (G1 – G) G: trọng lượng đĩa Petri. G1: trọng lượng đĩa Petri và mẫu trước khi sấy. G2: trọng lượng đĩa Petri và mẫu sau sấy tới trọng lượng không đổi. 2.2.7.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [12] Nguyên tắc - Vô cơ hóa đạm bằng H2SO4 đậm đặc thành amon sulphate ((NH4)2SO4)). Muối này đem tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3. H2SO4 đậm đặc Chất đạm (NH4)2SO4 Xúc tác, nhiệt độ (NH4)2SO4 + NaOH  2 NH3 + 2 H2O + Na2SO4 - Sau đó, lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3. Mà ở đó H3BO3 tự phân ly. H3BO3  HBO2 + H2O - Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2  NH 4+ + BO2- + H2O BO2- là một base mạnh, vì vậy dung dịch của bình hứng sẽ chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. BO2- + H+  HBO2 Hóa chất và thiết bị - Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo - Burret 25 ml - Bếp nung - Bình chưng cất - H2SO4 đậm đặc - NaOH 32% - HCl 0,25N - Chất xúc tác: là hỗn hợp của 60 g selenium + 75 g CuSO4+ 865 g K2SO4 - Hỗn hợp chỉ thị màu: + Hòa tan 0,264 g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối. + Hòa tan 1,28 g bromo cresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối. Trộn đều hai dung dịch trên , bổ sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối. - Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80 g acid boric trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút, để nguội bổ sung 25 ml hỗn hợp chỉ thị màu. Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất. Cách tiến hành - Vô cơ hóa mẫu + Nguyên tắc: sự vô cơ hóa chất đạm là sự vô cơ hóa tất cả các chất đạm dù ở bất cứ dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amoniac sulphate (NH4)2SO4) đậm đặc và chất xúc tác. + Thực hành: cân 100 mg mẫu đã nghiền nhỏ, 1 g chất xúc tác cho vào ống phá mẫu + 5 ml H2SO4 đậm đặc, nối bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu. Khi thời gian phá mẫu kết thúc để ống phá mẫu nguội. Bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất. + Chưng cất Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 80 ml NaOH 32%. Khởi động quá trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu. Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện màu phớt đỏ. Tính kết quả Thông qua lượng HCl 0,25N ta biết được lượng acid boric kết hợp với NH3 và do vậy biết được NH3 giải phóng từ mẫu. 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035 g nitơ hữu cơ. % Nitơ tổng số = C VHCl*100*0035.0 VHCl 0.25N : thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ. C (g): trọng lượng mẫu đem xác định. 2.2.7.3. Phương pháp xác định đạm amoniac [12] Nguyên tắc Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm dưới dạng vô cơ (muối amon hay các amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình phân hủy cacboxyl của acid amin) có bản chất là base, vì thế về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể. Nếu có nó ở hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là kém chất lượng. Do loại đạm này có tính kiềm yếu nên dưới tác dụng yếu của MgO thì những loại đạm trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, chúng sẽ bị lôi kéo theo hơi nước đến một bình chứa, có sẵn một lượng thừa acid. Sau đó đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm amoniac này. 2 (NH4) + + Mg(OH)2  2 NH3 + 2 H2O + Mg 2+ 2 NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4. Hóa chất và thiết bị - Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo. - Burret 25 ml. - MgO khan. - Dung dịch H2SO4 0,1N. - Dung dịch NaOH 0,1N. - Phenolphtalein 1%. Cách tiến hành Cân 1 g nguyên liệu hay sản phẩm hòa tan vào 10 ml nước cất cho vào ống phá mẫu. Cho vào 5 g MgO. Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất. Dịch chưng cất đưa vào một bình tam giác chứa 10 ml H2SO4 0,1N + 3 giọt phenolphtalein 1%. Chưng cất tới khi không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Định phân lượng H2SO4 0,1N bằng NaOH 0,1N, ta sẽ biết được lượng acid phản ứng với NH3. Làm một mẫu đối chứng với 10 ml nước cất. Tính kết quả Gọi V0 là thể tích NaOH 0,1N thử không. Vt là thể tích NaOH 0,1N thử thật. V = V0 - Vt là lượng NaOH 0,1N tương đương với lượng NH3 phóng thích đã được hấp thụ trong H2SO4 0,1N.  Số g đạm amoniac trong 100 g mẫu: V . 0,0014 . 100 = V . 0,14 (g/ 100 g) Với 0,0014 là số gam đạm amoniac tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N. 2.2.7.4. Phương pháp xác định đạm formol [12] Nguyên tắc Phương pháp này cho phép xác định đạm có trong acid amin, peptid. Như chúng ta đã biết, phân tử amin hay peptid có một đầu – COOH và đầu kia là – NH2. Formol sẽ tác dụng lên đầu – NH2 để tạo thành hợp chất metylen. Vì thế sản phẩm là hợp chất có chứa nhóm metylen, đầu – COOH có tính acid nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đó gián tiếp cho phép ta xác định được lượng – NH2 (tiêu biểu cho chất đạm trong nguyên liệu). Dụng cụ và thiết bị - Dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm. - Dung dịch formol pha loãng ½ (tỷ lệ 1:1) đã trung hòa bằng NaOH 0,1N: lấy 50ml dung dịch formol pha loãng ½, thêm vào vài giọt phenoltalein 1%, chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dung dịch có màu hồng nhạt. - Dung dịch NaOH 0,1N. - Chất chỉ thị màu phenolphtalein 1% trong cồn. Cách tiến hành - Cân 2 g mẫu tươi, thêm 10 ml nước cất, lọc qua giấy lọc, chỉnh nước đến 20 ml. - Hút 10 ml dịch lọc vào bình tam giác, thêm vào 10 ml dung dịch formol pha loãng ½ đã trung hòa bằng NaOH 0,1N + vài giọt phenoltalein 1%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Sau đó, định phân bằng NaOH đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, lấy màu chuẩn là màu của formol sau khi trung hòa. - Thưc hiện 3 lần thử thật, 3 lần thử không (thay 10 ml dịch lọc bằng 10 ml nước cất) Tính kết quả Gọi: V0 là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử không. Vt là thể tích NaOH 0,1N trung bình của 3 lần thử thật. V = Vt - V0 : lượng NaOH trung hòa nhóm – COOH. Từ đó suy ra số mol NaOH có trong V (ml): )(10** 1000 1.0** 4 molXV XV   Với: X là hệ số chỉnh lý dung dịch NaOH 0,1N. - Số mol NaOH tương ứng với số nhóm – COOH, tương ứng với số nhóm – NH2, tương ứng với số mol – NH2 là: V . X . 10-4 (mol) - Số gam đạm có trong 10 ml dung dịch nguyên liệu pha loãng 10 lần là: 14 . V . X . 10-4 (mol) - Số gam đạm có trong 10 ml dung dịch nguyên liệu chưa pha loãng là: 14 . V . X . 10-4 . 10 = 14 . V . X . 10-3 (gam) - Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu: )/(**141000*10* 10 **14 3 lgXV XV    2.2.7.5. Phương pháp xác định đường tổng [11] Nguyên tắc Sự định phân hàm lượng đường tổng số hòa tan dựa trên phản ứng màu đặc trưng bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4. Sự chuẩn xác của kết quả phụ thuộc : - Độ sạch của dụng cụ.. - Độ tinh khiết của thuốc thử nhất là H2SO4. - Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian phản ứng. Dụng cụ và hóa chất - Bình định mức 500 ml, 100 ml, 50 ml. - Erlen 50 hay 100 ml. - Cối chày sứ. - Phễu lọc. - Ống nghiệm. - Ống hút. - Quang phổ kế. - Cồn 960, cồn 800. - Phenol 5%. - H2SO4 đậm đặc. - Dung dịch đường saccharose 0,1%: 500 mg saccharose sấy khô ở 60oC, hòa tan trong 50 ml nước cất. Cách tiến hành - Cách trích đường: lấy 2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 96o. Đun sôi trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần. Khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Sau đó để nguội, lọc qua giấy lọc không tro. - Sau đó, cho 10 ml cồn 80o vào cốc đựng bã, khuấy đều đun sôi 2 lần trên bếp cách thủy. Để nguội lọc tiếp tục, chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong để bã lên lọc và rửa 2 – 3 lần bằng cồn 80o (rửa từng ít một). - Cồn qua lọc được cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc trên lò cách thủy đun nhẹ. Sau khi cồn bay hơi hết, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm. - Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất (bình định mức). Nếu có cặn thì để lắng xuống. Khi đem làm hiện màu, dung dịch này có thể pha loãng thành 5 – 10 lần tùy nồng độ nhiều hay ít. - Thực hiện phản ứng màu: hút 1 ml đường cho vào ống nghiệm rồi thêm vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào ống nghiệm. Để 10 phút rồi lắc đều, giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở 490 nm. Xây dựng đường chuẩn Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch đường saccharose mẫu 0,1% cho nước cất tới vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1ml cho vào ống rồi nhuộm màu bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc như ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose. So màu ở bước sóng 490 nm, sau đó vẽ đồ thị mẫu. Làm thêm một ống thử với 1 ml nước cất. Tính kết quả Trị số mật độ quang (OD) của những ống đối chứng sau khi trừ đi trị số của ống thử sẽ xác định được một đường cong mẫu.Với dung dịch cần xác định nồng độ, ta cũng trừ đi ống thử rồi chiếu lên đường cong mẫu để suy ra nồng độ x trong ống, từ đó tính % lượng đường trong mẫu. 2.2.7.6. Phương pháp xác định đường khử [2] Nguyên tắc Trong môi trường kiềm, đường khử kali ferixianua thành kali peroxia. Với sự có mặt của gelatin, kali ferixianua kết hợp với sắt sulphate tạo thành một chất có màu xanh bền. Cường độ màu được xác định trên máy so màu. Phương pháp này cho phép xác định lượng đường rất thấp trong dung dịch (0,01 – 0,1 mg/ml). Dụng cụ và hóa chất - Dung dịch kali ferixianua (K3Fe(CN)6): hòa tan 1,65 K3Fe(CN)6và 10 g NaNO3 trong 1 lít nước cất. Bảo quản dung dịch trong lọ thủy tinh màu nâu. - Dung dịch sắt sulphate (Fe2(SO4)3): hòa tan 1 g Fe2(SO4)3 trong 10 ml H2SO4 đậm đặc. Đổ từ từ dung dịch vào nước cất có sẵn trong bình định mức, pha loãng thành 1000 ml. - Gelatin 10%. - Trộn lẫn dung dịch Fe2(SO4)3 và Gelatin 10% theo tỉ lệ 20 : 1. Hỗn hợp dung dịch chỉ sử dụng trong ngày. Cách tiến hành Lấy 1 g nguyên liệu hòa tan trong 20 ml nước cất, lọc lấy dịch lọc (dịch đường), rửa bã lọc sau đó hiệu chỉnh đến mức 50 ml. Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết đường và 2 ml dung dịch kali ferixianua, khuấy đều, đun trên nồi cách thủy sôi 15 phút. Sau đó để nguội, thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch Fe2(SO4)3 khuấy đều và dẫn đến mức 20 ml. Đo cường độ màu ở bước sóng 710 nm. Tính kết quả Dựa vào mật độ quang (OD) đối chiếu với độ thị chuẩn, tính lượng đường. 2.2.7.7. Phương pháp xác định hàm lượng lipid thô [3] Nguyên tắc Nguyên liệu được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất béo. Dụng cụ và hóa chất - Máy Soxhlet. - Giấy lọc. - Ether dầu hỏa ether ethylic. Cách tiến hành - Giấy lọc được sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Nguyên liệu và sản phẩm được nghiền nhỏ, sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Cân chính xác 2- 5 g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc và gói lại cho kín không để mẫu rơi ra ngoài. Để giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết của máy Soxhlet. Chiết bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic. Sau khi chiết hết lipid (khoảng 8 giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi. Tính kết quả Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức X= c ba 100*)(  X : hàm lượng lipid %. a : trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g). b : trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g). c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid. 2.2.7.8. Phương pháp xác định peroxide [3] Nguyên lý Chỉ số peroxid là số g iot giải phóng ra bởi peroxid có trong 100 g mẫu. R1 - CH - CH - R2 + 2 KI + 2 CH3COOH O O R1 - CH2 – CH - R2 + 2 CH3COOK + H2O + I2 O I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6. Nguyên liệu và hóa chất - Acid acetic. - Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc kỹ đậy nút cẩn thận. - Dung dịch Na2S2O3 0,01N. - Dung dịch hòa tinh bột 1%. - Cloroform. Cách tiến hành Lấy 1 g mẫu khô tuyệt đối, ống đối chứng 1 ml nước cất. Mỗi bình cho 10 ml dung dịch hỗn hợp acid acetic : Cloroform (2:1), 1 ml dung dịch KI bão hòa (mới pha), cho erlen vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm vào erlen 0,5 ml chỉ thị hồ tinh bột 1% chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 (đến khi mất màu nâu). Tính kết quả Chỉ số peroxide P= C fba 100*01269.0**)(  a : số ml dung dịch Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thật. b : số ml dung dịch Na2S2O3dùng chuẩn mẫu thử không . c : trọng lượng mẫu.. f : hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N. 0,01269: số gam iod tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N. 100: hệ số quy chuẩn 100 g chất béo. 2.2.7.9. Định lượng bào tử Bacillus subtilis sp. trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [17] Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật cấy lên môi trường thạch có thành phần cơ chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định lượng phát triển. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo sát ban đầu. Cách tiến hành - Xác định bào tử có trong sản phẩm Nhuộm bào tử: bào tử của Bacillus subtilis sp. có màu hồng, thường nằm giữa tế bào có màu xanh. - Khử trùng mẫu theo kiểu Pasteur là biện pháp hấp nóng nguyên liệu một lần ở nhiệt độ thấp hơn 100oC. Nhiệt độ và thời gian khử trùng theo kiểu Pasteur tùy thuộc vào sức đề kháng của vật liệu đối với nhiệt độ. Đun nóng dịch tế bào thu được từ các thí nghiệm trên ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút. - Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… Tiến hành cấy 0,1 ml dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa