Luận văn Sử dụng amin bậc 4 (quaternary ammonium) để xác định hàm lượng fucoidan trong polysaccharide tách chiết từ rong nâu

Đây là sơ đồ phương pháp chiết tinh fucoidan dựa trên các bài viết về tách chiết và xác định cấu trúc fucoidan như bản quyền [42], [17], [43], [44] , trong đó có tác giả đun trực tiếp rong với CaCl2[15], cũng có tác giả kết tủa thẳng dịch lọc I bằng ethanol, lấy sản phẩm thô fucoidan [45]. Tổng hợp các phương pháp chiết đó ta có phương pháp tổng quát tách riêng từng chất từ dung dịch đủ các thành phần polysacarit của rong nâu như sơ đồ trên. 36 Áp dụng theo sơ đồ này trong phòng thí nghiệm hoặc trong sản xuất ta sẽ thu được ba sản phẩm polysacarit chính của rong nâu: Alginat, laminaran và fucoidan dạng sạch. 1.6. MỘT VÀI PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FUCOIDAN 1.6.1. Xác định hàm lượng fucoidan trong rong nâu bằng phương pháp phân tích khối lượng Hàm lượng fucoidan được xác định dựa vào công thức sau: (khối lượng fucoidan chiết được) %fucoidantrong rong = (khối lượng rong đem chiết) Một số công trình sử dụng phương pháp này đã được công bố bao gồm: * Nguyễn Duy Nhứt, Tạp chí Hóa học, 2007[46]. * Bùi Minh Lý, “ Nghiên cứu fucoidan và công nghệ sản xuất chúng từ rong nâu Việt Nam”, 2010[47]. * Phạm Đức Thịnh, Luận án tiến sĩ 2015 [48]. * Bùi Văn Nguyên, Luận án tiến sĩ 2018[49]. Diễn giải qui trình: Fucoidan thô có thể còn lẫn alginate, vì vậy cần tách bỏ alginate bằng cách kết tủa với Ca2+, theo phản ứng: Hình 1.13. Phản ứng alginate kết tủa với Ca 2+ Ca 2+ HH ONa O O OOH OH NaOOC O OOH OH O HH ONa O O OOH OH O OOH OH NaOOC O H H HH O O O OOH OH O OOH OH NaOOC O O O O OOH OH NaOOC O OOH OH O Ca 37 Sau khi loại bỏ alginate, fucoidan phản ứng với cetavlon tạo thành kết tủa (trong đó nhóm sulfat có thể ở vị trí khác): Hình 1.14. Fucoidan phản ứng với cetavlon Các polysaccharide trung tính như laminaran sẽ nằm lại trong dung dịch và tách bỏ theo pha nước. Kết tủa fucoidan-cetavlon được khuấy trong dung dịch NaI/ethanol, cetavlon bị NaI đẩy ra khỏi kết tủa tan vào ethanol, đồng thời fucoidan được giải hấp khỏi cetavlon tiếp tục bị kết tủa trong môi trường ethanol. Hình 1.15. Phản ứng fucoidan được giải hấp khỏi cetavlon Khuấy kết tủa nhiều lần trong NaI/ethanol và tách bỏ ethanol để rửa sạch cetavlon, sau nhiều lần rửa, fucoidan tinh sạch được tách ra, sấy khô đem cân để tính hàm lượng fucoidan trong rong. Phương pháp này phụ thuộc vào hiệu suất của các phương pháp chiết. ONaO O CH3 OH OOH O O CH3 OH O O O S ONaO O S ONaO O CH3 OH O O O CH3 OH OH OH O S ON(CH3)3C16H33O O CH3 OH OOH O O CH3 OH O O O S ON(CH3)3C16H33O O S ON(CH3)3C16H33O O CH3 OH O O O CH3 OH OH OH O S C16H33(CH3)3NBr ONaO O CH3 OH OOH O O CH3 OH O O O S ONaO O S ONaO O CH3 OH O O O CH3 OH OH OH O S ON(CH3)3C16H33O O CH3 OH OOH O O CH3 OH O O O S ON(CH3)3C16H33O O S ON(CH3)3C16H33O O CH3 OH O O O CH3 OH OH OH O S NaI/Ethanol 38 1.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng fucoidan thông qua hàm lượng fucose 1.6.2.1. Phương pháp của Usov và cộng sự [50] Thủy phân 20– 30 mg rong trong 2 M TFA có chứa nội chuẩn là myo- inositol 0.9 mg/ml, 1 ml 8 giờ ở 1000C, sau đó đồng bay hơi TFA với ethanol. Xác định hàm lượng fucose có trong dịch chiết, hàm lượng fucoidan trong rong được tính bằng 2 lần hàm lượng fucose trong rong. 1.6.2.2. Phương pháp của Bùi Minh Lý và cộng sự [51] Xác định hàm lượng fucose trong fucoidan đã tinh chế từ dịch chiết và fucose trong dịch chiết, hàm lượng fucoidan được tính bằng công thức: (% fucosse trong dịch chiết) Fucoidan% = (%fucose trong fucoidan tinh chế). Trong đó phương pháp tinh chế fucoidan: Cân lấy 5g mẫu fucoidan thô, hòa tan trong 400ml nước ấm, đưa vào đó 8g CaCl2, khuấy, để qua đêm và lọc loại bỏ tủa alginate-Ca. Đưa vào dung dịch sau lọc 100ml dung dịch cetavlon (hexadecyltrimethylammonium bromide) nồng độ 10% trong nước. Tủa tạo thành được ly tâm, tách khỏi dung dịch rửa với nước, khuấy với 100ml dung dịch NaI nồng độ 20% trong cồn 5 lần (5x100ml) trong vòng 2 đến 3 ngày ở nhiệt độ phòng, rửa tủa với cồn rối đem hòa tan lại trong nước. Dung dịch được thẩm tách và đông khô để thu được fucoidan sạch dưới dạng muối với Na+. Phương pháp định lượng này vẫn thông qua bước tinh chế fucoidan, nhưng không đem cân định lượng fucose trong mẫu tinh chế, sau đó so sánh với fucose trong rong để xác định fucoidan có trong rong. Phương pháp này được đưa ra nhằm khắc phục sai số do hiệu suất tách chiết fucoidan từ rong nâu, đồng thời chỉ cần có mẫu fucoidan tinh sạch mà không cần phải cố giữ đừng mất mẫu việc tinh chế sẽ dễ dàng hơn và dễ làm sạch hơn. 39 * Cơ sở xây dựng phương pháp: Trong mẫu fucoidan, sulfat, galactose, glucose, mannose, xylose, fucose đều chiếm hàm lượng xác định riêng, về mặt lý thuyết, dựa vào yếu tố nào để định lượng fucoidan cũng được. Tuy nhiên, ngoại trừ việc một số yếu tố như nếu định lượng fucoidan ví dụ như dựa vào glucose có thể sẽ bị ảnh hưởng bởi cellulose, laminaran.., đồng thời chỉ có methylpentose có đặc tính hấp thu mạnh ánh sáng bước sóng 396, đồng thời các đường khác có giá trị hấp thụ ánh sáng bước sóng 396 và 427 gần như bằng nhau, vì vậy có thể loại trừ ảnh hưởng của các đường khác bằng cách sử dụng hiệu OD tại 396- 427, độ chênh lệch này đặc trưng cho methylpentose. Trong fucoidan ngoại trừ fucose còn có rhamnose cũng là methylpentose, nhưng như đã nêu trên, rhamnose cũng là một yếu tố có thể dựa vào đó để định lượng fucoidan nên dù là sử dụng tổng fucose + rhamnose thì đây cũng là một đại lượng đặc trưng cho một fucoidan đã tinh sạch. * Tính toán của phương pháp: Trong fucoidan tinh sạch, sau khi thủy phân, xác định được fucose chiếm Cfs%, trong rong sau khi thủy phân xác định được fucose chiếm Cfr%, do hàm lượng fucose tỉ lệ thuận với hàm lượng fucoidan, một phép tính kinh điển: - Cfs% thì hàm lượng là 100/100 vậy Cfr% thì chiếm bao nhiêu phần trăm. Gọi số phần trăm đó là x ta có: (nồng độ fucose trong rong) X = [Cfr% x 100/100]/Cfs%= (nồng độ fucose trong fucoidan tinh sạch) * Với phương pháp này, fucose có thể xác định bằng phương pháp so màu, cũng có thể bằng phương pháp HPLC hoặc GC. Xác đinh hàm lượng fucose bằng phương pháp so màu Dische và Shettles với sự hiện diện của các loại đường khác nhau được phát triển bởi Zacharias Dische và Landrum B. Shettles vào năm 1948. Phương pháp này, còn được gọi là phương pháp Dische, là phương pháp đầu tiên được phát triển để phát hiện methylpentoses trong sự hiện diện của các loại đường khác [52]. 40 Phương pháp này bao gồm xử lí đường bằng acid sulphuric đậm đặc (85%) và đun nóng hỗn hợp dung dịch thu được ở 100 ° C trong 10 phút ,sau đó làm mát và thêm axit cysteine hydrochloric .Trong điều kiện axit khắc nghiệt, fucose sẽ chuyển thành 5-methylfurfural và sau khi làm mát, nó phản ứng với cysteine để tạo thành một phức hợp fucose-cystein cho màu vàng xanh . Fucose so với các loại đường khác cho độ hấp thụ cao hơn ở 396nm và độ hấp thụ thấp ở bước sóng 427. Ta có sơ đồ phản ứng tạo màu của L-fucose và L-cystein. Hình 1.16.Sơ đồ phản ứng tạo màu của L-fucose và L-cystein Quá trình định lượng fucose được tiến hành như sau: Cho 1 cc. của dung dịch chứa từ 50 γ trở lên của methyl-pentose trong ống nghiệm 16 × 150 mm.Cho vào ống nghiệm 4,5cc hỗn hợp gồm 1 thể tích H20 và 6 thể tích H2 SO4 đậm đặc. Làm lạnh ống nghiệm ở 3-5°C .Hỗn hợp này sau đó được làm ấm đến 20 - 22 °C trong vài phút, giữ ông nghiệm trong 3 hoặc 10 phút trong một bể nước sôi, và cuối cùng được làm mát trong nước máy. Để dung dịch lạnh, sau đó thêm 0,1 cc dung dịch cysteine hydrochloride 3 % (w/v) khi lắc hỗn hợp lên. Và gữ hỗn hợp ở 4 °C trong 1 giờ để hình 41 thành phức chất màu xanh. Độ hấp thụ quang của phức chất màu xanh được đo trên máy quang phổ so màu. Độ hấp thụ của phức chất được qui đổi thành độ hấp phụ fucose theo công thức: OD fucose = [OD3960 mẫu - OD3960 mẫu trắng]- [OD4300 mẫu - OD4300 mẫu trắng] Xác định hàm lượng fucose bằng phương pháp GC. Các gốc đường của polysacarit được xác định bằng GC, TLC, HPLC, tuy nhiên, sắc ký khí (GC) là phương pháp phổ biến hơn hết và đã được AOAC chọn làm tiêu chuẩn trong việc xác định thành phần đường đơn. Với một gốc đường, nếu không khử mở vòng chuyển sang dạng alditol thì ứng với một gốc đường đó ta sẽ có 4 pic trên sắc ký đồ, thể hiện 4 đồng phân: 2 đồng phân ,  của vòng 6 và 2 đồng phân ,  của vòng 5. Hình 1.17: Sơ đồ phản ứng xác định thành phần các gốc đường của fucoidan Do đó trước khi acetat hoá gốc đường phải khử mở vòng đường trước bằng NaBH4 (hình 1.17).Alditol acetat được xác định bằng GC hoặc HPLC. 1.6.2.3. Phương pháp định lượng fucoidan bằng phương pháp huỳnh quang của U. Warttinger [53] Phương pháp này U. Warttinger và cộng sự đã sử dụng chất hình quang Heparin Red tác dụng trực tiếp với một số fucoidan để dập tắt huỳnh quang theo cơ chế sau: H+ NaBH4 Ac2O/Pyr OH O OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OAc OAc OAc OAc OAc OAc H OH O OH OH OH O 42 Phương pháp này sử dụng chung cho polyanionic polysaccharide , cần thiết phải tách tinh fucoidan để phân tích. Đồng thời phải sử dụng test kid nên chưa tường minh các cơ chế được. Phương pháp này đưa ra để định lượng một vài fucoidan trong huyết tương người và sử dụng test kit. Phương pháp này do đó bị giới hạn trong việc sử dụng. 1.6.2.4. Phương pháp sử dụng điện cực màng polyion độ nhạy cao của Ji Min Kim và cộng sự [54] Mô tả định lượng cho dung dịch chỉ có fucoidan Phương pháp sử dụng điện cực màng và huỳnh quang bị hạn chế do mẫu chọn lọc, phương pháp xác định hàm lượng fucoidan bằng 2 lần hàm lượng fucose mang tính chất gần đúng, phương pháp xác định tỉ lệ fucose trong fucoidan tinh khiết và trong mẫu chính xác hơn, tuy nhiên fucoidan sau khi tinh chế và fucoidan có mặt trong dịch chiết thành phần fucose có khả năng khác nhau vì một lượng fucoidan có hàm lượng sulfate thấp sẽ không kết tủa được trong ethanol và một số fucoidan có hàm lượng sulfate lớn sẽ không bị giải hấp khỏi cetavlon. Phương pháp luận văn đề nghị Phương pháp này được phát triển từ phương pháp đã được nghiên cứu trước, đó là phương pháp định lượng sulfat của sulfat polysaccharide của tác giả Scott, công bố trên “Methods in Plant Biochemistry, Volume 2: Carbohydrates, by P.M. Dey and J.H. Harborne, Academic Press.” Trong đó tác giả sử dụng cetylpyridinium chloride (cũng là một quaternary ammonium như cetavlon) để chuẩn độ fucoidan đến khi không còn tạo thêm kết tủa nữa (kết tủa tách rời hẳn và dung dịch đột ngột chuyển từ vẩn đục sang trong suốt), nhóm carboxylate bị ngăn không cho tác dụng với cetylpyridinium chloride bằng H2SO4 0,025M. 43 Để kết tủa fucoidan, có thể sử dụng cetavlon hoặc cetylpyridinium chloride, đây là 2 quaternary ammonium có khối lượng phân tử xác định (một số khác do mạch alkyl không xác định ví dụ bezalkonium chloride, nhóm alkyl có thể là hỗn hợp C5, C6.., không dùng để định lượng được), tuy nhiên các công bố tinh chế fucoidan đều sử dụng cetavlon vì vậy chúng tôi dùng cetavlon để chuẩn độ, nhằm mục đích lặp lại hoàn toàn tương tự công đoạn kết tủa fucoidan khi tinh chế, dẫn đến việc định lượng sẽ chính xác hơn. Trong phương pháp của Scott, tác giả xác sử dụng amin bậc 4 (quaternary ammonium) để tính ra số mol sulfat đã phản ứng. Trong luận văn, lượng cetvlon được xác định để trừ đi trong khối lượng kết tủa, xác định khối lượng còn lại chính là khối lượng của fucoidan đã tham gia phản ứng. Trên cơ sở các công đoạn của các phương pháp nêu trên, chúng tôi chọn lọc và đề xuất một phương pháp vẫn bao gồm các phương pháp kiểm đã được công bố, nhưng giảm đi các giai đoạn trung gian ít gây sai số hơn. 44 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Rong nâu Rong nâu được thu thập tại các vùng biển ở Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam. Thời gian thu mẫu rong nâu vào tháng 5 năm 2019. Rong nâu: mẫu rong nâu nghiên cứu gồm 6 loài do phòng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên biển – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang thu mẫu và phân loại: Sargassum oligocystum, Sargassum duplicatum, Sargassum wartzii, Sargassum mcclurei, Tubinaria ornata và Hormophysa articulata. Rong nâu được thu hoạch, rửa sạch bằng nước máy nhiều lần để loại bỏ cát, đất, các chất bẩn khác, phơi khô tự nhiên, xay thành bột và sấy khô đến khối lượng không đổi ở 600C. Ký hiệu các mẫu rong: Sargassum oligocystum (Ký hiệu là M1) Sargassum swatzii (Ký hiệu là M2) Sargassum mcclurei (Ký hiệu là M3) Sargassum duplicatum (Ký hiệu là M4) Turbinaria ornata (Ký hiệu là M5) Hormophys articulata(Ký hiệu là M6) Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum oligocystum và Sargassum swatzii 45 Hình 2.2 Mẫu rong Sargassum mcclurei và Sargassum duplicatum Hình 2.3. Mẫu rong Turbinaria ornate và Hormophys articulata 46 2.1.2. Hexadecyltrimethylammonium bromide Product Number : H5882-100G Description : HEXADECYLTRIMETHYLAMMONIUM BROMIDE Foreign Trade Commodity Code: 29239000 CAS Number: 57-09-0 Là nhựa trao đổi ion âm dạng lỏng khi hòa tan trong nước. Hấp thụ các chất mang điện tích âm và giải phóng chúng khi sử dụng chất rửa giải chứa ion âm. Các hóa chất cơ bản khác sử dụng hàng P.A. của Trung Quốc. TFA 302031 min. 99%, sigma. 2.1.3.Các hóa chất sử dụng - Ethanol tuyệt đối. - Natri iodua (NaI) . - L-cysteine hydrochloride. - Trifluoroacetic (TFA). - Acid sunfuric (H2SO4). - Hexadecyltrimethylammonium bromide. - Natri tetrahiđroborat (NaBH4). - Ammonium hydroxid e (NH4OH). - acid axetic. - Acetic anhydrit (Ac2O). - Pyridin - Toluen - Etyl axetat 47 2.1.4. Máy móc thiết bị - Máy khuấy cơ học - Máy li tâm - Tủ sấy - Màng lọc rây phân tử ( MWCO : molecular weight membrane cut off) - Máy quang phổ UV khả kiến 722- Jinghua. - SHIMAZDU GC-17A GAS CHROMATOGRAPH. 2.1.5. Phần mềm xử lý dữ liệu - Đối với phổ hấp thu phân tửdùng phần mềm UV1601PC: Đây là phần mềm kèm theo máy quang phổ UV1601, tuy nhiên có thể cài đặt chạy riêng trên PC để vẽ đường chuẩn và tính toán các nồng độ dựa trên phương pháp xử lý số liệu của phần mềm này. - Excel, GrapthPad. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dịch chiết polysaccharide rong nâu Nhiều phương pháp chiết polysaccharide từ rong nâu đã đươc nghiên cứu và công bố, tuy nhiên theo đối tượng nghiên cứu của luận văn cần dung dịch chứa đủ các thành phần polysaccharide trong rong nâu là laminaran, alginate và fucoidan, nên chúng tôi chọn phương pháp chiết của Soyoung Jang và cộng sự công bố trên Food Sci. Technol. Res., 17 (6), 487 – 492, 2011[40]: Mỗi loài rong chúng tôi tiến hành chiết một mẫu với tỉ lệ bột rong và nước là 1(w):5(v), nhiệt độ chiết là 850C, thời gian chiết là 2 giờ. khối lượng rong đem chiết là 100g trong 500ml nước. Mỗi mẫu chiết 5 lần, gộp dịch chiết 5 lần lại với nhau, lọc thô, bỏ cặn, chạy qua màng lọc rây phân tử (MWCO: molecular weight membrane cut off) 5Ka đến khi còn 1/10 thể tích ban đầu, thu hết dịch còn lại định mức bằng nước đến 5 lần khối lượng rong ban đầu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 48 Sơ đồ qui trình chiết được sử dụng trong luận văn như sau: Hình 2.4.Sơ đồ qui trình chiết tối ưu theo Soyoung Jang và cộng sự (2011). 2.2.2. Phương pháp phân tích khối lượng Tinh chế fucoidan từ dịch chiết: Sau khi thu được các dd Mi. Lấy khoảng 100ml dd Mi, thêm H2SO4 tùy theo thể tích ddMi để đạt nồng độ 0,025M (134µl H2SO4 đậm đặc /100ml), cho từ từ dung dịch hexadecyltrimethylammonium bromide 10% cho đến khi không còn tạo kết tủa nữa, để qua đêm. Hỗn hợp được ly tâm loại bỏ phần dịch nổi phía trên. Kết tủa thu được đem lắc rửa với nước cất và ly tâm bỏ dịch, tiến hành 3 lần, sau đó kết tủa được khuấy cơ học với 200ml dung dịch NaI nồng độ 20% trong cồn 5 lần (5x200ml) trong vòng 2 đến 3 ngày ở nhiệt độ phòng, kết tủa fucoidan-CETAB được giải hấp, CETAB tan vào ethanol, fucoidan chuyển thành dạng kết tủa mới trong ethanol. Ly tâm tách lấy phần tủa, sau đó lọc thu kết tủa trên 2 tờ giấy lọc, rửa bằng aceton, sấy khô ở 600C, khối lượng fucoidan thu được bằng khối lượng tờ giấy lọc có chứa fucoidan trừ cho tờ giấy không có fucoidan.Mỗi loài rong tiến hành tinh chế fucoidan 3 lần từ cùng một dịch chiết rong. 100g rong +500ml nước Dung dịch chiết thô 500ml dịch chiết rong nâu (dd Mi) nhiệt độ chiết là 850C, thời gian chiết là 2 giờ (chiết 5 lần gộp dịch chiết) Lọc thô , lọc MWCO 5ka, đến khi còn 1/10 thể tích ban đầu , định mức dung dịch thu được bằng nước đến 500ml 49 (khối lượng fucoidan chiết được) %fucoidan trong rong = (khối lượng rong đem chiết) Tinh chế Fucoidan trong dịch chiết rong theo sơ đồ sau: Hình 2.5. Sơ đồ tinh chế fucoian từ dịch chiết rong (dd Mi) 2.2.3. Ký hiệu mẫu và các sản phẩm trung gian trong phương pháp kiểm Ký hiệu các mẫu rong theo thứ tự liệt kê tại 2.1.1 là M1, M2, M3, M4, M5, M6. Dịch chiết thu từ các mẫu rong là ddM1, ddM2, ddM3, ddM4, ddM5 và ddM6. 100ml ddMi + 134µl H2SO4 đậm đặc. +dung dịch cetavlon 10% đến khi không còn tạo kết tủa nữa. Để qua đêm, ly tâm loại bỏ phần dịch nổi phía trên, thu kết tủa, rửa kết tủa vơi nước cất. Kết tủa Fucoidan- CETAB -200ml dung dịch NaI nồng độ 20% trong cồn 5 lần (5x200ml). -Ly tâm , tách kết tủa, lọc, rửa bằng aceton, sấy khô ở 600C. Kết tủa Fucoidan 50 Fucoidan qua quá trình tinh chế theo mục 1.4.3.4.2 được ký hiệu là FM1, FM2, FM3, FM4, FM5 và FM6. Hàm lượng fucose trong rong đem thủy phân theo mục 1.4.3.4.2 ký hiệu là FucM1, FucM2, FucM3, FucM4, FucM5 và FucM6. Hàm lượng fucose trong fucoidan tinh chế từ các loài rong ký hiệu là FucFM1, FucFM2, FucFM3, FucFM4, FucFM5 và FucFM6. Hàm lượng fucose trong dịch chiết từ các loài rong ký hiệu là FucddFM1, FucddFM2, FucddFM3, FucddFM4, FucddFM5 và FucddFM6. Hàm lượng fucoidan trong dịch chiết xác định bằng Hexadecyltrimethylammonium bromide ký hiệu là CTABFM1, CTABFM2, CTABFM3, CTABFM4, CTABFM5 và CTABFM6. 2.2.4. Xác định hàm lượng fucoidan dựa vào xác định hàm lượng fucose Hàm lượng fucoidan có trong rong tính theo hàm lượng fucose được xác định bằng công thức: Fucoidan%= *100% Hàm lượng fucose được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau ứng dụng cho định lượng đường đơn ví dụ như HPLC, GC, TLC, so màu.... Tuy nhiên, để thuận lợi trong việc kiểm tra nhanh và không mất nhiều thời gian chuẩn bị mẫu chúng tôi chọn phương pháp so màu và sắc kí khí (GC) để xác định hàm lượng fucose. 2.2.4.1. Xây dựng đường chuẩn methylpentose Xác định hàm lượng fucoidan thông qua xác định fucose: phương pháp so màu Dische xác định methylpentose [52]. Methylpentose được sử dụng trong luận văn là rhamnose thông dụng hơn fucose, được sử dụng nhiều trong sản phẩm dược, đồng thời với tất cả các mẫu sử dụng chuẩn là rhamnose thì các tỉ lệ sẽ được thực hiện tương tự như fucose. Xây dựng đường chuẩn methylpentose: 51 Methylpentose: L-Rhamnose monohydrate CAS： 6155-35-7 (10030-85-0) Molecular formula C6H12O5 • H2O Molecular weight: 182,17 Specification：≥98% Nhà sản xuất : HG Hegeng Chuẩn bị 4 dung dịch chuẩn L-Rhamnose như sau: Cân chính xác khoảng 50mg L-Rhamnose vào bình định mức 50ml, hòa tan và định mức bằng nước. Ta thu được dung dịch chuẩn gốc. Dung dịch chuẩn 1: Hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 200ml, định mức bằng nước. (nồng độ 25µg/ml) Dung dịch chuẩn 2: Hút chính xác 2ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100ml, định mức bằng nước. (nồng độ 20µg/ml) Dung dịch chuẩn 3: Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn 2 vào bình định mức 20 ml, định mức bằng nước. (nồng độ 10 µg/ml) Dung dịch chuẩn 4: Hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn 1 vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước. (nồng độ 5 µg/ml) Lọc và tiến hành xác định hàm lượng Rhamnose trong 4 chuẩn trên bằng phương pháp so màu dựa trên phản ứng tạo màu của fucose với L- cysteine hydrochloride và H2SO4 đậm đặc. Giá trị OD396 – OD427 được nhập vào để làm thông số trên trục tung và nồng độ dung dịch làm thông số trên trục hoành [ 52]. Các số liệu đo trên máy quang phổ so màu 722- Jinghua, sau đó nhập số liệu vào phần mềm UV1601PC để xây dựng đường chuẩn và tính các giá trị nồng độ dựa vào giá trị mật độ quang. 52 2.2.4.2. Xác định hàm lượng fucose trong một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp so màu. *Thí nghiệm 1 Tiến hành thủy phân 100 mg rong trong 5 ml dung dịch TFA 2M, trong 8 giờ ở nhiệt độ 1000C, sau đó đồng bay hơi TFA với ethanol. Hòa tan hỗn hợp thu được vào bình định mức 50ml, dung môi là nước. Lọc và tiến hành xác định hàm lượng fucose trong rong bằng phương pháp so màu dựa trên phản ứng tạo màu của fucose với L-cysteine hydrochloride và H2SO4 đậm đặc . Kí hiệu (FucM(i)). [ 52] . *Thí nghiệm 2 Tiến hành chiết các mẫu rong như đã trình bày ở mục 2.2.1, cân chính xác 5,701 g TFA, hòa tan và định mức bằng dung dịch Mi vào bình mức 25ml, lắc đều .Tiến hành thủy phân trong 8 giờ ở nhiệt độ 1000C, cho bay hơi TFA còn dư , tiếp tục thêm vào ống nghiệm 0,5ml ethanol, cho bay hơi đến khi không còn TFA(lặp lại hai lần). Hòa tan và định mức hỗn hợp thu được vào bình định mức 25ml, dung môi là nước. Hút chính xác 5ml dung dịch thu được vào bình định mức 250ml, định mức bằng dung môi là nước. Xác định fucose trong dịch chiết bằng phương pháp so màu Dische và cộng sự [52] .Kí hiệu (FucFM(i)). *Thí nghiệm 3 Cân khoảng 100mg fucoidan đã tinh chế ở mục 2.2.1 vào ống nghiệm có nắp, thêm vào 5 ml dung dịch TFA 2M .Tiến hành thủy phân hỗn hợp thu được trong 8 giờ ở nhiệt độ 1000C, cho bay hơi TFA còn dư , tiếp tục thêm vào ống nghiệm 0,5ml ethanol, cho bay hơi đến khi không còn TFA(lặp lại hai lần). Hòa tan hỗn hợp thu được vào bình 100ml, hòa tan và định mức bằng dung môi là nước. Lọc và tiếp tục hút chính xác 5ml dung dịch thu được vào bình 50ml, pha loãng và định mức bằng nước. Hàm lượng fucose trong fucoidan tinh chế được xác định bằng phương pháp so màu Dische và cộng sự [52].Kí hiệu (FucFM(i)). 53 Mỗi loài rong sẽ thực hiện mỗi thí nghiệm ba lần từ cùng một dịch chiết rong . Độ hấp thụ của phức chất được qui đổi thành độ hấp thụ fucose trong mẫu theo công thức: OD fucose = [OD396mẫu - OD396 mẫu trắng]- [OD427mẫu - OD427mẫu trắng] Hàm lượng fucose được tính theo công thức: HL(%)= *100% Hàm lượng fucoidan được tính bằng công thức: Fucoidan%= *100% Tất cả các phân tích được thực hiện trong ba lần (n = 3) và dữ liệu thu thập được thể hiện dưới dạng trung bình và sai lệch 0,05%. Hình 2.6.Sơ đồ xác định hàm lượng fucoidan dựa vào hàm lượng fucose bằng phương pháp so màu Dische Z và cộng sự [52] Việc xác định hàm lượng fucose bằng phương pháp so màu Dische và cộng sự đươc sử dụng nhiều vì rẻ và qui trình tiến hành khá đơn giản. Tuy nhiên, theo tác giả Talha Bin Saleem Ahmad, 2015 [57] đã tiến hành các khảo sát về sự ảnh hưởng glucose đến tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện fucose theo Dische. Kết quả cho thấy rằng phương pháp này sẽ hoạt động có hiệu quả nếu mức độ tạp chất (tức là glucose) gấp đôi mức fucose và nếu mức TN1-Thủy phân 100mg bột rong TN2-Thủy phân 5ml ddMi TN3-Thủy phân 100mg fucoidan tinh chế Xác đinh hàm lượng Fucose trong rong tính từ rong(FucMi) Xác đinh hàm lượng Fucose trong dịch chiết rong (FucddFMi) Xác đinh hàm lượng Fucose trong fucoidan tinh chế (FucFMi) Xác định hàm lượng fucoidan 54 độ tạp chất (tức là glucose) gấp 10 lần so với Fucose tinh khiết thì phương pháp Dische sẽ không hoạt động chính xác nữa . Và đối với kết quả xác định hàm lượng fucose trong luận văn cũng không loại trừ khả năng trong dịch chiết polysaccharide rong có lẫn một lượng glucose hay một loại đường khác . Điều này ảnh hưởng đến tính chính xác của phép đo và những đánh giá sau này. Vì thế chúng tôi tiến hành thêm một phương pháp xác định fucose nữa đó là phương pháp sắc kí khí GC. 2.2.4.3. Xác định hàm lượng fucose trong một số loài rong nâu phổ biến ở khánh hòa bằng phương pháp sắc kí khí (GC).  Chuẩn bị mẫu chuẩn: a. Mẫu fucose chuẩn (khoảng 2 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm vào khoảng 2 mg inositol và 3 ml NaBH4 0,25M vừa pha xong trong NH4OH 1M , lắc đều rồi để yên 30 phút ở 20oC. Hút chính xác 0,3 ml hỗn hợp thu được vào một ống nghiệm mới. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 0,5ml axít axetic 10% trong ethanol, cho bay hơi đến khô, lặp lại lần nữa. Cho vào ống nghiệm 0,5ml ethanol, bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. b. Axetyl hoá các gốc đường bằng 0,2ml dung dịch Ac2O:pyridin = 1:1(v/v) ở 100oC trong 20 phút. Cho bay hơi hỗn hợp phản ứng, thêm vào 0,5ml toluen, cho bay hơi đến khô, lặp lại hai lần. Chiết sản phẩm đã axet