MỤC LỤC
TÓM TẮT.i
MỤC LỤC .ii
DANH SÁCH HÌNH .iii
DANH SÁCH BẢNG .iii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU. 1
1.1 Đặt vấn đề . 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu . 1
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU. 2
2.1 Giới thiệu vềbưởi . 2
2.1.1 Nguồn gốc . 2
2.1.2 Thành phần. 2
2.1.3 Dược tính của bưởi . 3
2.1.4 Enzyme pectinmethylesterase . 4
2.2 Khảnăng ức chếhoạt động của enzyme pectinmetylesterase . 6
2.3 Giới thiệu enzyme bromelain. 7
2.3.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu . 7
2.3.2 Enzyme bromelain . 8
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM.16
3.1 Phương tiện nghiên cứu .16
3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu .16
3.1.2 Nguyên liệu .16
3.1.3 Hóa chất thí nghiệm .16
3.1.4 Thiết bịvà dụng cụthí nghiệm .16
3.2 Phương pháp nghiên cứu .17
3.2.1 Nội dung nghiên cứu.17
3.2.2 Phương pháp chuẩn bịmẫu.17
3.2.3 Bốtrí thí nghiệm . 17
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢTHẢO LUẬN.21
4.1. Ảnh hưởng nhiệt độvà pH đến khảnăng ức chếhoạt động pectinmetylesterase (PME)
của enzyme bromelain khóm .21
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độenzyme bromelain và thời gian thủy phân đến khả
năng ức chếhoạt động của enzyme pectinmetylesterase (PME) .22
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀNGHỊ .25
5.1 Kết luận .25
5.2 Đềnghị .25
TÀI LIỆU THAM KHẢO .26
PHỤLỤC.iv
40 trang |
Chia sẻ: maiphuongdc | Lượt xem: 3788 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Sử dụng enzyme bromelain - Khóm để ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase trong nước ép trái bưởi, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
hình thành và do đó nước ép
sẽ không được hoàn nguyên trở lại. Những vấn đề này làm giảm chất lượng sản phẩm
một cách nghiêm trọng. Các chất tạo hương của nước ép trái cây họ citrus cực kỳ mẫn
cảm với nhiệt.
Các phương pháp sản xuất trái cây đông lạnh được thực hiện. Polyphenol có thể ức
chế được hoạt động của PE nhưng lại gây ảnh hưởng đến vấn đề cảm quan (vị và tính
đồng nhất của sản phẩm. PE đồng thời là một chất ức chế sản phẩm cuối, nhưng nếu
thêm pectic acid vào lại làm cho nước ép bị phân lớp.
Việc thêm các exo-enzyme : PG (polygalactorunase) làm phân hủy pectin có mức
ester hóa thấp hình thành trước khi đông tụ với Ca2+ xảy ra, hay PL ( pectin liase) phân
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 6
hủy pectin trong nước ép trái cây đến sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn, là các
hợp chất không mẫn cảm với Ca2+, dù là đề ester hóa nhưng thực chất cũng đã thực
hiện chức năng ức chế hoạt động của enzyme PE.
Vấn đề đặt ra là nước ép được cho bay hơi nhiều lần nhằm tối ưu hóa quá trình xử lý
nhiệt và khôi phục hương vị cho sản phẩm, kết hợp với điều kiện bảo quản đông lạnh
và vận chuyển nhanh nước ép cô đặc giúp tránh được phần lớn PE bị bất hoạt do tác
động của nhiệt độ.Tuy nhiên, đối với các nước đang phát triển, vân đang tồn tại vấn đề
này trong công nghiệp sản xuất nước ép trái cây họ citrus có hoạt lực PE cao (3).
2.2 Khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase
Để ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase bằng các phương pháp nói trên
là điều khó thực hiện với điều kiện ở nước ta. PME có bản chất là một protein nên nó
dễ bị biến tính bởi nhiệt độ cao và cũng bị enzyme protease cắt đứt liên kết peptide.
Việc sử dụng nhiệt độ cao để ức chế hoạt động của enzyme này thường được áp dụng
ở các nước đang phát triển. Còn việc sử dụng enzyme protease được xem như là một
phát hiện mới dựa trên việc protease sẽ cắt đứt mạch pepetide của PME, cũng đồng
nghĩa với việc sẽ ức chế được hoạt động của enzyme PME
Sử dụng enzyme protease
Sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp khác:
Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật
Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa.
Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu
trong phân tử protein. Cơ chế thủy phân như sau:
Endopeptidase
HO H HO H
NH2-CH-CO-NHCH….NHCHCO-NHCHCO-NHCHCO-NHCHCOOH
R1 R2 R3 R4 R5 R6
Aminopeptidase HO H Carboxy peptidase
Exopeptidase
(3)
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 7
Thường protease trong cơ thể tồn tại dạng không hoạt động (zymogen) và có thể
chuyển thành dạng hoạt động do chính enzyme protease tương ứng tác động bằng sự
cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó.Khi đó sẽ làm thay đổi
cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho các hoạt động khác, enzyme chuyển sang trạng
thái họat động.
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein mà
người ta chia protease ra làm 2 nhóm:
Endopeptidase phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành các
polypeptide mạch ngắn, peptone…
Exopeptidase (polypeptidase) phân cắt liên kết peptide ở 2 đầu mạch
Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease mà người ta chia
nhóm:
Protease acid: hoạt động ở pH acid
Protease kiềm: hoạt động ở vùng pH kiềm
Protease trung tính hoạt động ở vùng pH trung tính.
Có nhiều loại enzyme protease có thể ức chế hoạt động của PE. Nhưng do đặc thù của
sản phẩm nước bưởi là pH thấp, không chịu được nhiệt độ cao, cũng như vấn đề về
nguồn ezyme và các vấn đề về kinh tế, kỹ thuật khác nên nghiên cứu này quyết định sử
dụng enzyme bromelain để tiến hành thí nghiệm.
2.3 Giới thiệu enzyme bromelain
2.3.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu
Khóm là một loại nông sản vô cùng quan trọng, chỉ đứng thứ hai - sau chuối và đóng
góp hơn 20% tổng sản lượng trái cây ở các nước nhiệt đới. Các nhà khoa học cho rằng
nguồn gốc ban đầu của khóm là ở lưu vực sông Amazon với Brazil và Paraguay là hai
nước thuần hoá được giống khóm đầu tiên.
Khóm được sản xuất một cách rộng rãi trên toàn thế giới vào những năm 1500 khi nó
bắt đầu du nhập sang châu Âu và các nước nhiệt đới. Ban đầu, khóm được người dân
vùng Caribbe gọi là Anana có nghĩa là “trái cây ngon tuyệt” (“excellent fruit”). Tên
gọi “khóm” (“pineapple”) bắt nguồn từ châu Âu vì người ta nghĩ rằng nó giống như
trái thông (“pinecone”) với phần thịt giống như một quả táo (apple).
Ngày nay, Thái Lan, Philippine, Brazil và Trung Quốc là những nước sản xuất khóm
hàng đầu trên toàn thế giới. Bên cạnh đó, các nước khác như Ấn Độ, Nigieria, Kenya,
Indonesia, Mexico và Costa Rica cũng đóng góp trên 50% tổng sản lượng khóm trên
toàn thế giới (10).
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 8
Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước hiện khoảng 40.000 ha
với sản lượng khoảng 500.000 tấn trong đó 90% là phía Nam. Các tỉnh trồng dứa
nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau, Cần Thơ, Long An… miền
Bắc có Thanh Hóa, Ninh Bình, Tuyên Giang, Phú Thọ….miền Trung có Nghệ An,
Quảng Nam, Bình Định,… Năng suất quả bình quân một năm ở các tỉnh phía Bắc
khoảng 10 tấn, phía Nam 15 tấn/ha.
Trong năm cây dứa ra hoa nhiều vụ. Ở miền Bắc vụ chính ra hoa tháng 2-3, thu
hoạch tháng 6-7, vụ trái ra hoa tháng 6-8, thu hoạch tháng 10-12. Ở miền Nam, dứa có
thể ra hoa quanh năm, song thường tập trung vào tháng 4-5 và tháng 9-10. Từ khi ra
hoa đến thu hoạch trung bình khoảng 4-5 tháng (10).
Quả dứa được coi là một trong những cây ăn quả nhiệt đới hàng đầu, loại quả “vua”,
rất được ưa chuộng ở các nước phương Tây. Quả dứa có mùi thơm mạnh, chứa nhiều
đường, lượng calo khá cao, giàu chất khoáng, nhất là Kali, có đủ các loại vitamin cần
thiết như A, B1, B2, PP, C đặc biệt trong cây và quả dứa có chất Bromelin là một loại
men thủy phân protein (giống như chất Papain ở đủ đủ), có thể chữa được các bệnh rối
loạn tiêu hóa, ức chế phù nề và tụ huyết, làm vết thương mau thành sẹo. Trong công
nghiệp, chất Bromelin dùng làm mềm thịt để chế biến thực phẩm, nước chấm (10).
2.3.2 Enzyme bromelain
Bromelain là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả
năng phân giải protein được thu nhận từ học Bromeliaceae, đặc biệt là cây dứa (thân
và trái).
Bromelain được trích ly từ khóm lần đầu tiên vào năm 1891 và được giới thiệu như
một sản phẩm thương mại vào năm 1957. Hoạt tính của bromelain được phát hiện ở
trong thân và quả cây khóm, nhưng trong thân khóm chứa nhiều bromelain hơn quả
khóm
Bromelain là một loại enzyme thuộc nhóm protease, nó dễ dàng thủy phân hầu hết các
loại protin như casein, gelatin, đậu nành, cá…để tạo thành các peptide, poly peptide và
các acid amin. Bromelain không giống như các các loại enzyme khác, nó hoạt động rất
rộng cả trong môi trường acid lẫn kiềm. Bromelain vẫn có hoạt tính cả trong môi
trường cơ thể sinh vật (2).
Bromelain chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và
hoạt động tốt ở pH từ 6-8. Enzyme bromelain có trọng lượng phân tử khoảng 33000
Da ( 3)
Trong công nghiệp, phần thân nguyên liệu được dùng làm nguyên liệu chính để sản
xuất enzyme bromelain thương mại, vì đây là nguồn nguyên liệu dồi dào đặc biệt là
sau mùa thu hoạch trái.
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 9
Enzyme bromelain quả (EC 3.4.22.33)
Tên gọi khác: bromelain quả, juice bromelain, bromelase, bromelain quả FA2.
Hoạt tính: là một endopeptidase, xúc tác phản ứng thủy phân tại vị trí bất kỳ trên mạch
polypeptide.
Cơ chất: thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng hợp tương tự như broimelain thân. Nhưng
bromelain quả hoạt động thủy phân tốt trên cơ chất tổng hợp Bz-Phe-Val-Arg-
NHMec, không phản ứng với cơ chất Z-Arg-Arg-NHMec như bromelain thân (11).
Mã số enzyme
Bromelain thân: E.C.3.4.22.32 (12).
Tên gọi khác: bromelin, bromeline, bromelain
Tên khoa học và y học: sulfuhydryl proteolytic enzyme, cytein protase
Tên thương mại: Bromanase (Kramer – Novis), bromelain 2400 Maximum Strength
(Vitalize Corp).
Bromelain là một thuật ngữ dùng chung để chỉ các enzyme được tìm thấy trong dịch
chiết từ cây dứa, chủ yếu là các protease cysteine.
i. Cấu tạo hóa học
Bromelain ở thân và quả dứa có thành phần acid amine thay đổi khác nhau. Bromelain
thân có khoảng 321-144 acid amin, còn bromelain quả có khoảng 283-161 acid amin.
Bromelain thân là một sợi polypeptide có amino acid ở đầu amin là valine và ở đầu
carbonyl là glycine. Bromelain quả có amino acid ở đầu amin là alnine.
Enzyme bromelain là một protease-thiol. Trong trung tâm hoạt động của bromelain có
cysteine. Đây là một amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh là – SH
(sulfuhydryl). Phân tử có dạng hình cầu do cách sắp xếp phức tạp và trong mỗi phân tử
có tất cả 5 cầu nối disulfite.
Khi phân tích cấu trúc bậc một của bromelain, Murachi và Busan nhận thấy cách sắp
xếp amino trong phân tử bromelain như sau:
Ser-Val-Lys-Asn=Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-AlaCys-Tryp
(3)
ii. Hoạt tính của bromelain
Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amylase và esterase. Bromelain xúc tác
phản ứng thủy phân trên nhiều cơ chất và có thể thủy phân cơ chất tự nhiên lẫn tổng
hợp.
-Gly-Cys-Lys-
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 10
Giống như papain, bromelain đóng vai trò là một endopeptidase, có khả năng tham gia
xúc tác, đẩy mạnh phản ứng thủy phân protein thành các oligopeptide và các amino
acid.
Hoạt tính của bromelain có thể được xác định theo các đơn vị: đơn vị Rorer, đơn vị
BTU, (đơn vị bromelain tyrosine), đơn vị CDU (đơn vị thủy phân casein), đơn vị GDU
(đơn vị thủy phân gelatin), đơn vị MCU (đơn vị đông tụ sữa)…
Thông thường người ta đánh giá hoạt tính của enzyme bromelain dựa trên đơn vị
MCUs hoặc GMU. 1 GMU tương đương với 1,5 MCU (8).
iii. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain
Giống như các cấu trúc sinh học khác, hoạt tính enzyme của bromelain cũng bị ảnh
hưởng bởi các yếu tố khác:
Nhân tố môi trường: nhiệt độ, pH, ion kim loại…;
Nhân tố bên trong: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, một số nhóm chức của enzyme
và độ tinh khiết của enzyme…;
Các yếu tố pH, nhiệt độ cho hoạt động xúc tác của enzyme bromelain còn phụ thuộc
lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như cơ chất, bản thân enzyme, thời gian
phản ứng, sự có mặt của các chất hoạt hóa…
Bromelain là một enzyme có nguồn gốc từ thực vật vì thế tính chất của enzyme này sẽ
gắn liền với một số tính chất của loại thực vật chứa chúng. Trong số các tác nhân ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme thì tác nhân vật lý được quan tâm nhiều nhất bởi các
ứng dụng của nó trong thực tiễn sản xuất, đặc biệt sự ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH
môi trường xử lý enzyme hay trong quá trình chế biến loại thực vật chứa chúng.
Ảnh hưởng bởi nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến nhiều mức độ khác nhau lên hoạt tính của enzyme.
Enzyme có bản chất là protein nên nó không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, đa số các
enzyme bị mất hoạt tính trên 700C (3).
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là thời
gian phản ứng, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những tác động làm ảnh
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 11
hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của
enzyme…
Các nghiên cứu cho thấy:
Bromelain hoạt động ở nhiệt độ từ 40-600C ( tối thích 50-600C) và bị ức chế ở nhệt độ
trên 65oC (17).
Bromelain tinh khiết rất nhạy cảm với nhiệt độ
Ở 50C, pH 4-10, bromelain giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24 giờ
Ở 550C, pH 6,1 bromelain bị bất hoạt 50% hoạt tính trong vòng 29 phút.
Quá trình đông khô, enzyme bromelain bị mất 27% hoạt tính (3).
Theo cuộc nghiên cứu của Bollag và Edelstein vào năm 1991 thì Bromelain có thể
hoạt động ở nhiệt độ từ 45-700C.
Hình 2: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của bromelain
(1)
Ảnh hưởng của nhân tố pH
pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, pH tối thích của
bromelain không ổn định mà còn tùy thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất
và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự hiện
diện của chất hoạt hóa.
Khoảng pH mà bromelain có hoạt tính lớn nhất từ 4-8. Tuy nhiên, pH từ 4.5-5.5 thì
khả năng thủy phân của bromelain là mạnh nhất (17).
H
o
ạt
tín
h
củ
a
en
zy
m
e
(U
/m
l)
Nhiệt độ (0C)
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 12
Theo cuộc nghiên cứu của Bollag và Edelstein vào năm 1991 thì Bromelain có thể
hoạt động ở pH từ 4-9.
Hình 3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của Bromelain
( 1)
Nồng độ enzyme
Khi cơ chất đầy đủ thì vận tốc của phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ enzyme.
[ ]EkV ×=
Trong đó:
v: vận tốc của phản ứng
k: hằng số vận tốc
[ ]E : nồng độ enzyme
Nồng độ của enzyme càng lớn bao nhiêu thì lượng cơ chất càng bị biến đổi bấy nhiêu,
nhưng nếu nồng độ enzyme quá lớn thì vận tốc phản ứng sẽ chậm lại.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Năm 1993 Mischealis và Menten đã giải thích tính chất động học của enzyme và lập
phương trình biểu diễn liên quan giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất.
Enzyme đã tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme
-
cơ chất (E). Trường hợp
đơn giản nhất phản ứng chỉ có một cơ chất (S) thì enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển
hóa cơ chất thành một sản phẩm (P) phản ứng xảy ra như sau:
H
o
ạt
tín
h
củ
a
en
zy
m
e
(U
/m
l)
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 13
E: enzyme
S: cơ chất
P: sản phẩm
K1: hằng số tốc độ phản ứng tạo ES
K2: hằng số tốc độ phân ly ES và cơ chất ban đầu
K3: hằng số tốc độ phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P
[ ]
[ ]SK
SV
v
m +
×
=
max
Trong đó:
V: vận tốc phản ứng
Km: hằng số Michaelis-Menten
Vmax: vận tốc phản ứng cực đại
[ ]S : nồng độ cơ chất
V là hàm số của [ ]S , đồ thị có dạng nhánh hyperbol vuông góc:
Hình 4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng
Km: là hằng số Mischealis-M.Menten đặc trưng cho mỗi enzyme, –Km đặc trưng cho
ái lực của enzyme và cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ
chất càng lớn, nghĩa là vận tốc phản ứng càng lớn. Qua đồ thị chung của đường biểu
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 14
diễn cho thấy khi tăng nồng nộ cơ chất đến một giá trị nào đó, vận tốc phản ứng đạt
một giá trị cực đại Vmax, sau đó vận tốc sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng độ
cơ chất.
Ảnh hưởng bởi chất ức chế:
Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng thường gắn vào các
trung tâm hoạt động của enzyme. Muối và thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến
hoạt tính của bromelain và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối.
Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelain do chúng kết hợp với nhóm
SH của trung tâm phản ứng của enzyme.
Trong đó:
E: enzyme
I:chất kìm hãm
K1, K2: hệ số vận tốc của phản ứng thuận nghịch
Ảnh hưởng bởi chất hoạt hóa:
Chất hoạt hóa làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme, chất hoạt hóa có bản chất giống
nhau có thể là:
Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro
Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là
bỏ một vài đoạn peptide, phá vỡ thế bị bao vây của một số nhóm hoạt động trong trung
tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động.
Các chất có tác dụng phục hồi nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của
enzyme. Trung tâm hoạt động của bromelain có chứa nhóm –SH sẽ chuyển thành –S-S
làm enzyme mất khả năg hoạt động. Nếu thêm vào môi trường chất hoạt hóa có tính
khử như cystein, glutation, nhóm –SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở
lại.
Các ion kim loại, hoặc các kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt
động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất .
Tuy nhiên, khi sử dụng hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau
vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này
chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme.
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 15
iv. Sơ lược các nghiên cứu về enzyme bromelain
Shoshi et al. (1975) đã nghiên cứu về sự biến đổi thành phần hóa học của enzyme
bromelain thân I-1 và bromelain quả A dưới sự tác động của 2- hydroxy-5-5-
nitrobenzyl Bromide, tetra nitromethane và H2O2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dưới
tác động của các hợp chất trên, enzyme bromelin bị biến đổi mạnh về mặt cấu trúc,
thành phần các acid amin trong phân tử, trong khoảng pH và nhiệt độ nhất định (13).
Yamada, Takahashi và Murachi (1976), đã tinh chế và định tính được một loại
protease từ quả dứa, tên là bromelain quả FA2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sự biến
đổi của enzyme này sẽ sinh ra chuổi acid amin cuối cùng là
Ala-Val-Pra-Gln-Ser-Ile-Asp=Trp-Arg-Asp-Tyr-Gly-Ala
Thành phần amino acid của FA2 không khác biệt gì so với bromelain thân, tuy nhiên
về cấu tạo FA2 có ít hơn tổng lượng lysine và alanine so với glycine như với
bromelain thân nên có thể kết luận FA2 không phải là một glucoprotein (14).
Waliszewski và Coro (2004) cũng đã nghiên cứu về ái lực xúc tác của enzyme
bromelain quả dạng thô trên cơ chất protein khác nhau. Nghiên cứu đã thực hiện ở
dịch quả dứa ở 4 mức độ chín khác nhau trên 5 loại cơ chất gồm azocasein,
azoalbumine, hemoglobin, natricasenate và casein. Sản phẩm tạo thành được xác định
bằng phương pháp quang phổ. Nghiên cứu đưa ra kết luận về khoảng pH và nhiệt độ
tối thích đối với hoạt tính xúc tác của enzyme bromelain quả trên từng loại cơ chất
(15).
Bên cạnh, Andrew et al. (1990) cũng đã tiến hành nghiên cứu về nhóm các enzyme
cysteine proteinase của cây dứa và các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ
lên hoạt tính xúc tác của bromelain quả, comosain và pinguinain trên các loại cơ chất
tổng hợp, sử dụng phương pháp quang phổ để xác định sản phẩm tạo thành. Một phần
kết quả cho thấy trong thân dứa có tối thiểu 4 loại cysteine proteinase này là thể hiện
mạnh nhất.
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 16
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Công nghệ sau thu hoạch, Bộ môn Công nghệ
Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Nguyên liệu
Bưởi da xanh mua ở huyện Châu Thành, Tiền Giang
Nước
3.1.3 Hóa chất thí nghiệm
NaOH 0.01N
Pectin táo (poly-D-galacturonic acid methylester)
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Máy xay nguyên liệu
Máy đo pH
Đồng hồ thời gian
Bếp điện
Nhiệt kế
Dụng cụ gọt vỏ
Micropipet
Ống nghiệm
Ống đong
Máy chuẩn độ acid bazơ 785 DMP Titrio Metrohm, Thụy Sỉ
Cốc thủy tinh
Vải lọc
Bình định mức
Một số dụng cụ khác.
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 17
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nội dung nghiên cứu
Sử dụng enzyme bromelain thô được trích ly bởi Viện Công nghệ sinh học Trường
Đại Học Cần Thơ nghiên cứu khả năng ức chế lên hoạt động của enzyme
pectinmetylesterase.
3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu
Hình 5: Sơ đồ chuẩn bị mẫu nước bưởi
3.2.3 Bố trí thí nghiệm
i. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến khả năng ức chế hoạt động
pectinmetylesterase của enzyme bromelain khóm
Mục đích
Xác định pH, nhiệt độ tối ưu để ức chế hoạt động PME của enzyme bromelain
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố
Nhân tố A: Nhiệt độ môi trường
A1: 35oC
A2: 40oC
A3: 45oC
A4: 50oC
Dịch quả
Lọc
Tách bao, hạt
Ép
Vỏ, cùi
Phân loại
Bóc vỏ, tách múi
Nguyên liệu
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 18
A5: 55oC
A6: 60oC
Nhân tố B: pH môi trường
B1: pH 4,6
B2: pH 5,2
B3: pH 5,8
B4: pH 6,4
Ứng với mỗi nghiệm thức, thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Tổng số mẫu thí nghiệm: 6x 4x 3 (lần lặp lại) = 72 mẫu
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
Mô tả tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị enzyme: enzyme bromelain được pha thành dung dịch ở nồng độ 0,004g/ml
trong nước cất
Chuẩn bị mẫu: 15 ml nước bưởi được cho vào trong ống nghiệm. Sau đó, ống nghiệm
được cho vào trong waterbath đến khi nào nhiệt độ nước bưởi đạt nhiệt độ yêu cầu thì
cho enzyme bromelain khóm với tỷ lệ 0,004g enzyme bromelain/100ml nước bưởi Sau
khoảng thời gian 10 phút, mẫu được đo 1 lần để xác định hoạt tính của enzyme
pectinmetylesterase
A1 A2 A3 A4 A5 A6
B1 A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 A5B1
B2 A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2 A6B2
B3 A1B3 A2B3 A3B3 A4B3 A5B3 A6B3
B4 A1B4 A2B4 A3B4 A4B4 A5B4 A6B4
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 19
Kết quả thí nghiệm
Hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase còn lại trong nước bưởi ở các điều kiện pH
và nhiệt độ khác nhau. Kết quả được phân tích thống kê theo phần mềm
STATGRAPHICS 4.0
ii Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme bromelain và thời gian thủy
phân đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme pectinmetylesterase
Mục đích
Xác định tỷ lệ enzyme bromelain và thời gian thủy phân thích hợp để ức chế hoạt động
của pectinmetylesterase
Bố trí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 nhân tố
Nhân tố C: nồng độ enzyme bromelain khóm
C1: 0 %
C2: 0,002 %
C3: 0,004 %
C3: 0,006 %
C4: 0,008 %
Nhân tố D: Thời gian thủy phân
D1: 0 phút
D2: 5 phút
D3: 10 phút
D4: 15 phút
D5: 20 phút
Ứng với mỗi nghiệm thức ta lặp lại 3 lần
Tổng số mẫu thí nghiệm: 5 x 5 x 3 = 75 mẫu
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 20
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ sau:
D1 D2 D3 D4 D5
C1 C1D1 C1D2 C1D3 C2D4 C1D5
C2 C2D1 C2D2 C2D3 C2D4 C2D5
C3 C3D1 C3D2 C3D3 C3D4 C3D5
C4 C4D1 C4D2 C4D3 C4D4 C4D5
C5 C5D1 C5D2 C5D3 C4D4 C5D5
Mô tả tiến hành thí nghiệm
Chuẩn bị enzyme: enzyme bromelain được pha thành dung dịch ở các nồng độ
0,002g/ml; 0,004g/ml; 0,006g/ml; 0,008g/ml trong nước cất
Chuẩn bị mẫu: 15 ml nước bưởi trong điều kiện pH được xác định thí nghiệm 1 được
cho vào trong ống nghiệm. Sau đó, ống nghiệm được cho vào trong waterbath đến khi
nào nhiệt độ nước bưởi đạt nhiệt độ yêu cầu (kết quả từ thí nghiệm 1) thì cho enzyme
bromelain khóm với các tỷ lệ 0; 0,002; 0,004; 0,006; 0,008g enzyme bromelain/100ml
nước bưởi. Sau các khoảng thời gian 0, 5, 10, 15, 20 phút, mẫu được đo 1 lần để xác
định hoạt tính còn lại của enzyme pectinmetylesterase.
Kết quả thí nghiệm
Hoạt tính của enzyme pectinmetylesterase còn lại trong nước bưởi ở các tỷ lệ enzyme
bromelain khác nhau, trong các khoảng thời gian khác nhau. Kết quả được phân tích
thống kê theo phần mềm STATGRAPHICS 4.0
Luận văn tốt nghiệp khóa 29-2008 Trường Đại Học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng 21
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng nhiệt độ và pH đến khả năng ức chế hoạt động
pectinmetylesterase (PME) của enzyme bromelain khóm
Hình 6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng ức chế hoạt động pectinmetylesterase
(PME) của enzyme bromelain khóm
Nhiệt độ là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelain và
pectinmetylesterase. Từ đồ thị hình 6 nhận thấy rằng, ở nhiệt độ từ 35-450C, hoạt tính
còn lại của enzyme pectinmetylesterase rất nhiều, đặc biệt ở nhiệt độ 450C là 0,066
đơn vị/ml.Tuy nhiên, từ nhiệt độ 45-550C thì hoạt tính của PME bắt đầu giảm dần, ở
550C hoạt tính còn lại của PME là 0,0332 đơn vị/ml. Nhưng khi nhiệt độ môi trường
tăng lên là 600C thì hoạt tính còn lại của PME lại bắt đầu tăng lên. Theo nghiên cứu
của Bollag DM và Edels
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- S7917 d7909ng enzyme bromelain khm.pdf