Luận văn Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây sưa (Dalbergia tonkinensis prain) in vitro

George et al. 2008). 16 Sự nuôi cấy mô phân sinh ngọn là một phương pháp hiệu quả trong vi nhân giống, sản xuất cây sạch bệnh bảo tồn và lưu trữ nguồn gen. Sự phát sinh cơ quan chịu ảnh hưởng bởi tuổi, trạng thái sinh lý của mô cấy của chính những cơ quan bên dẫn xuất từ mô phân sinh ngọn và sự thay đổi của các điều kiện môi trường, đặc biệt là vai trò của của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. (Bùi Trang Việt 2000). Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân giống chậm nhất, nhưng là cách thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các loài thực vật, đặc biệt là cây gỗ (vì sự sinh phôi thể hệ và tăng sinh chồi/rễ bất định khó thực hiện hơn ở loài cây này). Trước sự phân hóa để tạo tầng phát sinh của chồi được tạo mới, tiền mô phân sinh hay tế bào phân hóa đều phải trải qua sự tái hoạt động. Sự tái hoạt động này có thể được cảm ứng trên cây nguyên bằng sự đàn áp các hiệu ứng cản tương quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn để gỡ ưu thế ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường thích hợp. Sự tái hoạt động gồm hai giai đoạn: khử phân hóa và tái phân hóa (Bùi Trang Việt 2000, Taiz and Zeiger 2005). Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá đã phân hóa, người ta cho rằng có sự hiện diện của các nhóm tế bào đặc biệt, gọi là mô đích. Các tế bào này là nơi nhận các thông tin hóa học, đặc biệt là chất điều hòa tăng trưởng thực vật: nếu auxin có tác dụng tạo rễ đối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ) thì cytokinin có tác dụng tạo chồi đối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh của chồi). Tỉ lệ auxin/cytokinin xác định một chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) (George et al. 2008). 1.3.4. Sự phát sinh và thu nhận phôi thể hệ Sự phát sinh phôi thể hệ là con đường trung tâm của sự vi nhân giống thực vật và có vai trò đặc biệt quan trọng trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái thực vật. Sự thu nhận phôi thể hệ thường bao gồm hai gai đoạn: giai đoạn các tế bào sinh phôi (mô sẹo, dịch treo tế bào), với sự hiện diện của auxin riêng lẻ hay kết hợp với citokinin và giai đoạn tiến hóa phôi thể hệ từ các tế bào sinh phôi, với sự giảm hay loại bỏ auxin (Hình1.5). Dưới các điều kiện xác định, các tế bào mô sẹo hay 17 dịch treo tế bào có thể cho các sơ khởi cơ quan (sinh cơ quan) hay phôi (sinh phôi thể hệ) dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Bùi Trang Việt 2003). Tất cả tế bào sinh dưỡng trong cây chứa toàn bộ thông tin cần thiết để tạo một cây hoàn chỉnh và đầy đủ chức năng (Merkle et al. 1995). Phôi thể hệ là phôi được tạo ra từ tế bào thể hệ (tế bào dinh dưỡng 2n) theo con đường sinh phôi thể hệ, tế bào thể hệ (tế bào dinh dưỡng) đóng vai trò sinh phôi hợp tử, và sự phát triển phôi cũng qua các giai đoạn tương tự như trong sinh phôi hợp tử (Bùi Trang Việt 2000). Sự tạo phôi thể hệ đầu tiên được ghi nhận ở Cà rốt (Reinert 1958, Steward et al. 1958), và đã được chứng minh ở nhiều loài thực vật khác nhau (Brown et al. 1995, Dwartan et al. 1995). Môi trường phổ biến nhất trong sinh phôi thể hệ là môi trường MS (Murashige & Skoog 1962) hay các môi trường cải tiến của MS. Đặc tính căn bản của tế bào sinh phôi rất giống với cá tế bào của mô phân sinh. Tuy nhiên, về mặt phát sinh hình thái có sự khác nhau: tế bào sinh phôi cho ra phôi, còn tế bào mô phân sinh chỉ cho ra mô và cơ quan (George 2008). Phôi thể hệ được cảm ứng từ nhiều vật liệu thực vật khác nhau như: từ phôi hợp tử, cây con từ hạt nảy mầm, đỉnh sinh trưởng chồi và chồi hoa. Quá trình tái sinh xảy ra tuần tự từ sự khởi đầu cấu trúc lưỡng cực của tế bào, sự tạo tiền phôi, sự Hình 1.5. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi thể hệ (Bùi Trang Việt 2000). 18 phát triển và trưởng thành của phôi hợp tử, sự nảy mầm thành cây con và chuyển cây con từ môi trường nuôi cấy in vitro sang môi trường đất (Merkle et al 1995). Bên cạnh auxin, mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy (tương tác giữa các tế bào) có vai trò quan trọng trong sự nuôi cấy tế bào. Thí dụ, ở dịch treo tế bào cà rốt, mật độ đạm cao (100.000 tế bào/ml) cần cho sự thành lập các nhóm tế bào sinh phôi, trong khi mật độ thấp (20.000 tế bào/ml) kích thích sự phát triển phôi. Trong vài trường hợp, các hormone tăng trưởng thực vật và các yếu tố vật lý hóa học khác nhau cũng có vai trò nhất định (Bùi Trang Việt 2000). 1.4. Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật Thuật ngữ “chất điều hòa thực vật” (plant regulator) được dùng để chỉ một cách tổng quát những hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng kích thích hay cản, nói cách khác, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở nồng độ thấp. Chúng không phải là chất dinh dưỡng, tức là không phải là những vật liệu cung cấp năng lượng hay những nguyên tố khoáng cần thiết cho thực vật (Bùi Trang Việt 2000). Định nghĩa hormone thực vật: “hormone thực vật là một chất hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển tới một nơi khác, ở đó, với nồng độ rất thấp chất ấy gây ra một phản ứng sinh lý” (Bùi Trang Việt 2000). Hiện nay, người ta biết được các nhóm chất điều hòa tăng trưởng thực vật có tác động trực tiếp đến sự tăng trưởng của tế bào và được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào gồm: auxin, cytokinin, gibberelline, acid abscissic và ethylen. 1.4.1. Auxin Auxin là yếu tố quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật. Auxin có ảnh hưởng khác nhau trong các giai đoạn khac nhau của quá trình phát sinh phôi cũng như trong sự phát sinh cơ quan. Nồng độ auxin trong tế bào mô được điều khiển bởi tốc độ sinh tổng hợp, trạng thái hoạt động và sự vận chuyển, trong khi khả năng đáp ứng với auxin của tế bào hay mô được xác định bởi hàm lượng và hoạt động của con đường truyền tín hiệu (Hobbie 2007). 19 Auxin được xác định và cô lập đầu tiên vào khoảng những năm 1920 và 1930 dựa trên dựa trên thí nghiệm kéo dài khúc cắt diệp tiêu. Phần lớn auxin hiện diện ở thực vật bậc cao là acid indole-3-acetic (IAA), với hàm lượng khoảng 10-100 mg/g trọng lượng tươi (IAA là auxin nôi sinh đầu tiên được phát hiện ở thực vật). Một số loài thực vật tổng hợp thêm các phân tử auxin khác như 4-chloroindole-3- acetic acid, phenylacetic acid và indole-3-butyric acid (IBA). Ngay sau khi dạng auxin IAA được xác định, các nhà sinh hóa đã tiến hành tổng hợp nhiều hợp chất có hoạt tính auxin. Ba auxin tổng hợp quan trọng nhất là 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1-naphthalene acetic acid (1-NAA) và picloram (Davies 1995, Litwack 2005, Taiz and Zeiger 2005). IAA được tổng hợp ở mô phân sinh, lá non, các trái và hột đang tăng trưởng. Sự sinh tổng hợp IAA tự do ở thực vật bắt đầu từ chorismate hay anthranilate dẫn đến sự tổng hợp indol và amino acid tryptophan. Có hai con đường tổng hợp IAA: con đường phụ thuộc tryptophan hay con đường độc lập tryptophan. Các con đường này xuất hiện ở nơi có sự điều hòa tăng trưởng và sự điều hòa ngược. Hầu hết auxin được thấy ở thực vật (99% trong trường hợp Arabidopsis) có dạng liên kết với các phân tử khác như glucid, amino acid và peptid. Auxin liên kết được xem như một Hình 1.6. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm auxin. 20 nguồn auxin dự trữ chủ yếu. Tuy nhiên, trong một vài trường hợp, chúng có thể là dạng trung gian của quá trình thoái biến. IAA liên kết với amino acid bởi họ enzym GH3. Phản ứng ngược để phóng thích IAA từ IAA-amino acd được xúc tác bởi họ enzym thủy giải IAA-amino acid. IBA cũng là một dạng dự trữ của auxin mặc dù chúng có thể tác dụng trực tiếp. IBA có thể chuyển thành IAA thông qua quá trình oxy hóa peroxisome tại vị trí β (Litwack 2005, Taiz and Zeiger 2005). Auxin dóng vai trò trung tâm trong sự điều hòa hiện tượng ưu thế ngọn, sự hình thành rễ thứ cấp, lão suy của lá, phân hóa mô mạch, hình thành nụ hoa và tăng tưởng trái. Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp. Auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Trong sự tăng trưởng của thân non và diệp tiêu, auxin điều khiển sự kéo dài thân bằng cách gia tăng tính giãn vách tế bào. Auxin có khả năng cảm ứng trực tiếp tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn. Hầu hết các auxin hiện diện trong mô phân sinh ngọn và các sơ khởi lá nhỏ nhất. Theo Scanlon (2003), auxin được tạo ra từ các lá già hơn di chuyển tới mô phân sinh ngọn. Mặt khác, sự di chuyển hữu cực của auxin cần thiết cho quá trình phát triển của các sơ khởi lá (Davies 1995, Scanlon 2003). Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn. Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và cs 1980). Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định (Kuroha et al. 2002). Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) (Bùi Trang Việt 2000). Auxin điều khiển sự tăng trưởng của tế bào thông qua tác động trực tiếp lên vách tế bào. Về mặt lý thuyết, auxin có thể làm gia tăng dòng proton H+ bằng hai cơ chế sau: hoạt hóa bơm ATPase-H+ có sẵn trong màng tế bào và tổng hợp mới 21 ATPase-H+ của màng. Auxin kích thích hoạt động của bơm proton ở màng nguyên sinh chất, làm tăng nồng độ H+ ở khoảng gian bào, khi đó pH giảm. Sự giảm pH của vách làm cho vi nối giữa extensin, hemicellulose, cá hợp chất pectid với celluloz bị phá vỡ; Ca2+ nối liền các chuổi hợp chất pectid bị loại đi; vài enzym thủy giải được hoạt hóa giúp cho sự tổng hợp hoặc phân hủy polysaccharid và protein được thực hiện, giúp duy trì tính lỏng lẻo của vách. Ngoài ra, auxin còn giúp kéo dài tế bào nhờ kiểu điều khiển sự hấp thu các chất hòa tan trong tế bào (Taiz and Zeiger 2005). Ở mức phân tử, auxin kích thích sự tổng hợp các mRNA liên quan trong sự tổng hợp các enzym chuyên biệt, bao gồm bao gồm các enzym tạo tiền chất của celluloz và các hợp chất của vách (Bùi Trang Việt 2000). Vai trò của auxin trong nuôi cấy in vitro Tác động của auxin trong nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài và tùy thuộc vào nồng độ của hiện diện các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác. Thông thường auxin khích thích kéo dài tế bào, cảm ứng tạo mô sẹo khi dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với các chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác, kích thích sự phát sinh rễ và kìm hãm sự kéo dài rễ (Bùi Trang Việt 2000). Các loại auxin khác nhau thường dùng với nồng độ khác nhau như IAA thường sử dụng với nồng độ 1 – 31mg/l, NAA và 2,4-D từ 0,1 – 3mg/l (Rogosic et al. 2006). Để cảm ứng tạo mô sẹo ở những cây lá rộng, 2,4-D thường được sử dụng nồng độ từ 5 – 15µM. Để cảm ứng tạo mô sẹo ở cây hai lá mầm, người ta thường kết hợp auxin với cytokinin trong môi trường nuôi cấy, nhưng ở cây một lá mầm thì sự kết hợp auxin với cytokinin trong môi trường nuôi cấy là không cần thiết. Ở cây một lá mầm thường sử dụng nồng độ auxin cao hơn để tạo mô sẹo, thường từ 5 - 10µM (Machakova et al. 2008). Trong giai đoạn tạo tế bào sinh phôi, sự dùng auxin mạnh là điều cần thiết. Trong giai đoạn tiến hóa phôi, việc giảm hay loại auxin trong môi trường nuôi cấy là nguyên tắc để thu nhận phôi thể hệ. Sự di chuyển hữu cực của auxin từ trên xuống theo một trục thẳng góc với bể mặt môi trường nuôi cấy có liên quan trong 22 sự hình thành mạch, phát sinh cơ quan phôi (Bùi Trang Việt 2004). Auxin cần thiết để tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi ở nhiều loài thực vật. Các nghiên cứu cho thấy đối với nhiều loài thực vật, auxin ngoại sinh được đòi hỏi tuyệt đối để kích thích tạo nên các tế bào có khả năng sinh phôi, các khối hay cụm các tế bào có khả năng sinh phôi và các tiền phôi. Các tế bào có khả năng sinh phôi sẽ phát triển thành phôi thể hệ khi được chuyển sang môi trường không có hoặc có auxin với nồng độ giảm đi. Nhu cầu auxin cho sự cảm ứng các tế bào có khả năng sinh phôi cũng được ghi nhận bởi Halperin và Wetherell (1964) ở cà rốt. Auxin được sử dụng nhiều nhất là 2,4-D (0,5 – 27,6µM), NAA và các auxin khác được dùng ít hơn (Evans et al. 1983). Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D. Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng các chất điều hòa nội sinh trong mô cấy. Ví dụ như ở đậu nành, trụ hạ diệp được nuôi cấy trên môi trường có auxin ngoại sinh như NAA hoặc IBA sẽ hình thành rễ bất định. Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao. Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động enzym IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất định (Lui et al. 1998). 1.4.2. Cytokinin Cytokinin được Skoog và Miller khám phá năm 1950 trên sự phân chia tế bào mô lõi thuốc lá. Ngày nay người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin. Zeatin tự do ở dạng trans trong phần lớn thực vật. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí 6, thí dụ benzilaminopurin (benzil adenin, viết tắt BAP hay BA) là chất được dùng trong nông nghiệp. Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật. Từ rễ, cytokinin di chuyển trong mạch mộc để tới chồi. Tuy nhiên, các chồi (cà chua) và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin(Bùi Trang Việt 2000). Cytokinin tham 23 gia vào nhiều quá trình: tăng rộng tế bào, phân chia và phát sinh hình thái tế bào, sự trưởng thành của chloroplast, cản sự lão hóa (Taiz and Zeiger 2005). Vai trò của cytokinin trong nuôi cấy in vitro Trong nuôi cấy mô người ta thường dùng zeatin và một số hợp chất tổng hợp như kinetin BAP, TDZ. Nước dừa (phần lỏng) được dùng với nồng độ 10 – 20% cũng là một nguồn cung cấp cytokinin (Rogosic et al. 2006). Đối với cảm ứng tạo mô sẹo, cytokinin giúp quá trình tạo sẹo hình thành nhanh hơn. Sử dụng auxin kết hợp với cytokinin giúp tạo chồi.Dùng cytokinin ở nồng độ thấp (0,01mg/l) kết hợp với auxin 1 – 5mg/l có thể kích thích tạo rễ (Rogosic et al. 2006). Hình 1.7. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm cytokinin. 24 Ở nồng độ cytokinin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi. Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin. Tuy nhiên cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi; chồi được tạo ra trở nên nhỏ,không thể kéo dài đến một kích thước nhất định để có thể tách ra được cho hình thành rễ, và tạo ra những lá bất thường. Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách. Nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ (Edwin 1996). Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin. Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi. Những vấn đề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được phát triển tốt nhất (Edwin 1996). Cytokinin riêng lẻ cũng đã được dùng như nhân tố cảm ứng cho sự hình thành phôi ở một số loài thực vật. Ví dụ như TDZ (thidiazuron) là một chất có hoạt tính giống cytokinin, đã được dùng để kích thích tạo phôi thể hệ ở nhiều loài thực vật, đặc biệt ở đậu và nhiều loài 2 lá mầm (Neuman et al. 1993, Saxena et al. 1992). Ở cà phê, sự nuôi cấy lá cần cytokinin (IP, kinetin hoặc BAP) như là chất điều hòa cảm ứng duy nhất, trong khi auxin ở nồng độ thấp 5x10-3µM auxin (2,4-D hoặc NAA) làm giảm sự sinh phôi (Hatanaka et al. 1991). Tương tự, ởAbies spp., cytokinin được dùng như chất điều hòa duy nhất cho sự cảm ứng sinh phôi thể hệ từ phôi hợp tử (Norgaad & Krogstrup 1991, Schuller et al. 1989). 1.4.3. Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong nuôi cấy in vitro Sự kết hợp giữa auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nhất định có vai trò trong sự biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành cơ quan chồi, rễ cho từng loại thực vật nhất định. Auxin có thể ảnh hưởng lên hoạt động của cytokinin trong tế bào bằng cách điều hòa xuôi trong quá trình tổng hợp hoặc phát huy sự thoái hóa cytokinin (Kiss et al. 1992). 25 Skoog và Miller (1965) chứng minh khúc cắt lõi hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tùy theo tỉ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong môi trường nuôi cấy (Bùi Trang Việt 2000): - A/C cao giúp sự tạo rễ (thí dụ 2/0,02); - A/C thấp giúp tạo chồi (thí dụ 2/0,5). (Trong các thí nghiệm này, nồng độ AIA được giữ ở 2mg/l, nhưng nồng độ kinetin thay đổi). Ở cỏ Creeping, sự kết hợp 2,4-D với cytokinin kích thích sự tăng sinh mô sẹo tạo phôi nhiều hơn khi sử dụng 2,4-D riêng lẻ (Zhong et al.1991). Ở tiêu, phôi thể hệ được tạo ra trong môi trường có 2,4-D và TDZ nhưng phôi thể hệ không được tạo ra trên môi trường chỉ có 2.4-D (Binzel et al. 1996). Tương tự, sự tạo phôi thể hệ ở Cayratia japonica được cảm ứng trên môi trường có 2,4-D kết hợp với TDZ hoặc kinetin (Zhou et al. 1994). Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng, nhưng đồng thời cũng có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi); sự cân bằng giữa hai kiểu hormone này là một trong những yếu tố kiểm soát sự phát triển (Bùi Trang Việt 2000). 1.4.4. Gibberelline Kurosawa (1926) chứng minh chất trích từ nấm Gibberella fujikuroi (tức Fusarium heterosporum) cảm ứng tăng trưởng quá mức ở lúa (bệnh lúa điên). Yabuta và Sumili (1938) cô lập từ Gibberella một hỗn hợp mà họ gọi là gibberelline. Gibberelline là một nhóm lớn, trên 80 chất, đó là các gibberelline Ax hay GAx theo thứ tự khám phá. Gibberelline là những terpenoid, được tạo từ 4 đơn vị isopren (C5): CH2=C(CH3)‒CH=CH2. Các đơn vị này ít nhiều bị biến đổi trong phân tử gibberelline. Theo lý thuyết, các gibberelline có 20C, nhưng nhiều chất chỉ còn 19 (do một ‒CH3 bị oxid hóa thành ‒COOH, và nhóm này được khử carboxyl) (Bùi Trang Việt 2000). 26 Gibberelline kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng đặt của các vi sợi. Gibberelline cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân chia tế bào thân. Gibberelline kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì. Gibberelline cũng có tác động kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi (Bùi Trang Việt 2000). Gibberelline làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích. Auxin và gibberelline có vai trò thiết lập tính hữu cực ở mức tế bào đang tăng trưởng do tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào. Tuy nhiên, auxin và gibberelline có hoạt động độc lập, gibberelline không phải là tác nhân làm tăng hoạt động của auxin. GA3 là loại gibberelline được sử dụng nhiều nhất, GA3 kích thích sự tăng trưởng tế bào ở nồng độ thấp. GA3 có hiệu quả trong quá trình nảy mầm của Hình 1.8. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm gibberelline. 27 phôi, có tác dụng kích thích sự kéo dài chồi và nảy mầm của phôi soma. Vai trò của gibberelline trong nuôi cấy in vitro Gibberelline có nhũng ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro ở những loài thực vật khác nhau. Ở Begonia hiemalis 30 – 60µM GA3 làm tăng số lượng và kéo dài chồi nhưng sự hiện diện của nó ở trong chồi khiến chúng khó ra rễ (Simmonds and Werry 1987 trong Edwin 1996). Đối với cây hợp hoan Albizzia julirissin, GA3 làm giảm số chồi hình thành trên khúc cắt trụ hạ diệp được nuôi cấy trên môi trường Gambrg’s B5. Ngược lại, khi thêm chất kháng gibberelline như paclobutrazol vào môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng số chồi được tạo ra. Như vậy gibberelline có ảnh hưởng mạnh đến số lượng chồi hình thành trong nuôi cấy in vitro (Sankhla 1993). Trong quá trình sinh phôi thể hệ, gibberelline thường không có tác dụng đặc biệt. Ở cà rốt, GA3 ngoại sinh không ảnh hưởng đến số lượng phôi tạo thành trong giai đoạn phôi hình cầu nhưng là giảm số phôi giai đoạn phôi hình tim hình cá đuối dẫn đến giảm số lượng phôi thể hệ được tạo thành (Bhojwani & Soh 2001, Davies 1995). 1.4.5. Abscissic acid (ABA) Abscissic acid là một sesquiterpen (3 đơn vị isopren),là một acid yếu, vượt qua màng tế bào dễ dàng khi ở dạng trung tính (gắn proton). Abscissic acid hiện diện ở tỉ lệ 70% trong diệp lạp, 15% trong cytosol, 10% trong không bào và 5% trong apoplast. Dạng liên kết với glucoz chỉ gặp trong không bào. Ở mức biểu bì, abscissic acid được thấy chủ yếu trong tế bào khí khẩu (Bùi Trang Việt 2000). Hình 1.9. Cấu trúc phân tử abscissicacid. 28 Abscissic acid cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngũ của chồi và hột, làm chậm sự kéo dài lóng và điều tiết trạng thái đóng mở của khí khẩu. Acid abscissic cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và của các mô nuôi cấy. Abscissic acid liên quan tới sự sinh phôi và trưởng thành của hột (Bùi Trang Việt 2000). 1.4.6. Etylene Vai trò của etylene trên sự chín của trái được biết từ rất lâu, nhưng phải cho tới những năm 1960, chất này mới được xem là một hormon tăng trưởng thực vật (Bùi Trang Việt 2000). Hầu hết các phần khác nhau của cơ thể thực vật bậc cao có thể sản sinh ra etylene, tuy nhiên tốc độ hình thành phụ thuộc vào kiểu mô, giai đoạn phát triển của cơ thể. Các vùng mô phân sinh, mắt là nơi sản sinh ra nhiều etylene. Etylene được tạo ra trong quá trình chín quả, thời gian rụng lá, khi hoa già, khi mô bị tổn thương và dưới tác động của stress như ngập úng, lạnh, nhiệt độ bất lợi, bệnh, v.v. (Nguyễn Như Khanh 2007). Etylene làm giảm sự phân chia tế bào, gia tăng hàm lượng và tác động của ABA, làm giảm hàm lượng và tác động của gibberelline (Abeles et al. 1992). Chính điều này đã ngăn cản sự tăng trưởng phôi soma. Sự gia tăng tổng hợp etylene trong quá trình sinh phôi soma làm giảm sự tổng hợp các polyamine, một trong những yếu tố thức đẩy sự sinh phôi soma. Ngoài ra, thành phần etylene cao có thể tăng cường hoạt tính của enzym cellulase, pectinase hoặc cả hai, làm phá vỡ các cụm tế bào trước khi phân cực được thiết lập trong các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Chính điều này đã dẫn đến tác động ức chế quá trình phát sinh phôi soma của etylene (Bajaj and Rajam 1996, Sharma and Rajam 1995). Hình 1.10. Cấu trúc phân tử etylenee. 29 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu dùng trong nuôi cấy Hạt cây Sưa mua của công ty TNHH Văn Giang, địa chỉ: xã Tân Châu, huyện Khoái Châu, tỉnh Hưng Yên. 2.1.2. Vật liệu sinh trắc nghiệm + Khúc cắt diệp tiêu Lúa (Oryza sativa L.) 72 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm) được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính auxin và acid abscissic. + Trụ hạ diệp cây Xà lách (Lactuca sativa L.) 18 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm) được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính gibberelline. + Tử diệp cây mầm Dưa leo (Cucumis sativus L.) 24 giờ tuổi (kể từ khi nảy mầm) được dùng trong sinh trắc nghiệm đo hoạt tính cytokinin. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa in vitro Hạt của cây Sưa được rửa bằng cồn 700 trong 2 phút, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, tiếp tục được ngâm trong Javen (Javen thương phẩm pha loãng 20% Hình 2.1. Hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain). 30 v/v) trong 3 phút, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, tiếp tục ngâm trong HgCl2 0,1% trong 3 phút, sau đó tách vỏ lấy phôi (bỏ tử diệp). Phôi Sưa (bỏ tử diệp) được đặt trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) (phụ lục 1). Các mẫu nuôi cấy được đặt trong điều kiện ánh sáng đèn huỳnh quang 2500 ± 500 lux , thời gian chiếu sáng 12 giờ, ở nhiệt độ 24 ± 10C và độ ẩm 68 ± 5%. Theo dõi sự nảy mầm của phôi Sưa (bỏ tử diệp) trong 1 tuần, chọn vật liệu thích hợp cho sự tạo mô sẹo ở các thí nghiệm tiếp sau. 2.2.2. Sự tạo mô sẹo 2.2.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro Cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) thành những khúc cắt 1 – 2mm (Hình 2.2). Đặt các mẫu cấy trên các môi trường MS và bổ sung các chất điều hòa tăng trưởng thực vât 2,4-D (ở các nồng độ 0; 1; 2; 3mg/l) và BA (ở các nồng độ 0; 0,5; 1mg/l ) để tạo sẹo (Bảng 2.1). Các mẫu nuôi cấy được đặt trong tối ở nhiệt độ 240C ± 10C, độ ẩm 68 ± 5%. Theo dõi sự tăng trưởng của mẫu cấy trong 5 tuần qua hình thái bằng mắt thường, chọn môi trường thích hợp cho sự tạo m