Luận văn Tăng biểu hiện gene ALKB1, ALKB2 mã hóa Enzyme N-ALKANE Monooxygenase ở Rhodococcus opacus B4

thiết để giảm ch i phí và năng lƣơṇg cho toàn bô ̣quá trình sản xuất. Sản xuất bằng xúc tác sinh hoc̣ đơn giản , ít tốn hóa chất và năng lƣợng hơn sử dụng xúc tác hóa học . Bên caṇh đó còn có thể taọ các sản phẩm đăc̣ hiêụ về cấu trúc không gian (stereo-), điều khiển đƣơc̣ nơi phản ƣ́ng xảy ra trên cơ chất (regio-) và tránh đƣợc sản phẩm phụ không mong muốn . Cả tế bào vi sinh vật là xúc tác sinh học lý tƣởng vì có khả năng tái tạo các co factor (nhƣ NAD(P)H ...), rất cần thiết cho phản ứng sinh tổng hợp . Cho đến nay , xúc tác sinh học đƣợc ứng dụng trong ngàn h công nghiêp̣ hóa chất để sản xuất các hóa chất đăc̣ biêṭ , polymer và môṭ số các hóa chất quan troṇg khác. Xƣ̉ lý hóa hoc̣ Xƣ̉ lý sinh hoc̣ Xƣ̉ lý hóa hoc̣ Hình 2.1: Công nghiệp sản xuất hóa chất 3 So sánh sản xuất phenol tƣ̀ benzel bằng con đƣờng sinh hoc̣ và hóa hoc̣ Sơ đồ 2.1: Quy trình sản xuất phenol từ benzene Tính khả thi về măṭ kinh tế của việc sử dụng xúc tác sinh học phụ thuôc̣ nhiều yếu tố nhƣ loại xúc tác sinh học , loại bể phản ƣ́ng , cấu hình máy móc ... Phần lớn các phản ứng chuyển hóa đang đƣợc quan tâm là phản ứng chuyển hóa các chất không phân cƣc̣. Các hợp chất phân cực không tan trong nƣớc và rất độc đ ối với các tế bào . Măṭ khác, enzyme ổn điṇh hơn trong dun g môi hƣ̃u cơ (11). Vì vậy, bể phản ƣ́ng hai pha lỏng gồm có pha nƣớc và pha dung môi hƣ̃u cơ thƣờng đƣơc̣ sƣ̉ duṇg. 2.2. Giới thiệu chung Loài vi khuẩn Rhodococcus. spp đƣơc̣ Zopf đề cập lần đầu tiên vào năm 1891, là loài vi khuẩn mang sắc tố đỏ, quan troṇg về măṭ thú y, bêṇh lý, công nghiêp̣. Hầu hết họ rhodococci (ngoại trƣ̀ R. equi là nguồn gây bệnh trên thú và ngƣời) có tiềm năng thƣơng maị cao do có khả năng tạo nhiều chất hoạt tính bề mặt – acid mycolic – và có hệ thống enzyme có tác dụng chuyển hóa và phân hủy sinh học . Rhodococcus opacus B4, đƣợc phân lập từ vùng đất nhiễm dầu, là đối tƣợng lý tƣởng dùng trong phân hủy sinh hoc̣ các loaị hydrocarbon vì nó có thể phân hủy nhiều loại hợp chất hữu cơ phổ biến trong môi trƣờng, bề mặt vi khuẩn có tính kỵ nƣớc và hấp thụ nguồn hydrocarbon bằng cách tạo các chất hoạt hóa bề mặt nên chịu đƣợc nhiều loại dung môi hữu cơ khác nhau. Hiêṇ nay, viêc̣ sƣ̉ duṇg hê ̣thống oxy hóa alkane của vi khuẩn làm xúc tác sinh học trong sản xuất hóa chất và dƣơc̣ phẩm rất đƣơc̣ quan tâm . Các phản ứng sinh học 4 này thu hút nhiều sự quan tâm vì việc đƣa nguyên tử [O] vào các hóa chất bất h oạt nhƣ alkane bằng con đƣờng hóa hoc̣ cổ điển có nhiều khó khăn . Môṭ phần vì các chất oxy hóa mạnh cần để kích h oạt nguyên tƣ̉ C thƣờng không tƣơng thích với cơ chất . Phần khác vì thƣờng taọ ra các sả n phẩm oxy hóa phu ̣khác thông qua các phản ƣ́ng phụ. Tính kỵ nƣớc của vi khuẩn giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi độc tính của các hợp chất tan trong nƣớc . Chỉ có Rhodococcus có thể chịu đƣợc nồng đô ̣cao chất hƣ̃u cơ tan . Hơn nƣ̃a, lipid hoaṭ hóa bề măṭ rhodococci góp phần tạo khả năng trao đổi alkane . Sƣ ̣trao đổi alkane đƣơc̣ ma ̃hóa chủ yếu bởi gene alkane hydroxylase (alk) đƣợc bảo tồn trong nhiều l oài vi khuẩn . AlkB có tính bảo tồn cao và có nhiều ph iên bản nên biểu hiện của mỗi loại alkB đƣợc điều khiển bởi mỗi loại nhân tố phiên mã khác nhau. Cho đến nay, ngƣời ta đa ̃biết đến 60 dạng alkB có trình tƣ ̣rất đa daṇg. Alkane chiếm tƣ̀ 20 – 50% trong thành phần dầu thô , phụ thuộc vào nguồn dầu . Tuy nhiên, nhiều loại sinh vâṭ nhƣ vi khu ẩn, cây cối và môṭ số l oài đôṇg vâṭ cũng sản sinh ra alkane. Alkane trơ về măṭ hóa học và phải đƣợc hoạt hóa trƣớc khi chuyển hóa . Khi có măṭ oxygen , phản ứng oxy hóa thƣ ờng bắt đầu từ oxy hóa nhóm methyl cuối cùng tạo n- alcohol và sau đó quá trình oxy hóa tiếp tuc̣ bởi enzyme dehydrogenase để tạo acid béo tƣơng ứng. Môṭ vài l oài vi khuẩn chỉ có môṭ loaị alkane hydroxylase, trong khi môṭ số loài khác có nhiều daṇg alkane hydroxylase hơn. Các l oại alkane hydroxylase này thƣờng có dạng cơ chất tƣơng tự nhau , chỉ khác nhau là chúng đƣợc tạ o ra ở phase ổn điṇh ban đầu hay phase tăng trƣởng trong giai đoạn sinh trƣởng của vi khuẩn (17). Hầu hết các l oài vi khuẩn có khả năng chuyển hóa chuỗi alkane dài hơn 10 nguyên tƣ̉ C (C12 tới C20 hay thâṃ chí C 30). Trong khi rất nhiều loài vi sinh vâ ̣t có khả năng sƣ̉ duṇg alkane có chuỗi C dài , dạng thể lỏng thì môṭ số l oài vi khuẩn Gram (+) nhƣ Corynebacterium – Nocardia – Mycobacterium – Rhodococcus chỉ có thể chuyển hóa các alkane chuỗi ngắn, dạng thể khí. AlkB1, alkB2 là các gene có sẵn trong genome của R. opacus B4, mã hóa cho enzyme n- alkane monooxygenases (2 enzyme liên kết với màng tế bào), có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa nhóm methyl cuối cùng trong mạch carbon của n- alkane để tạo alcohol, aldehyde và acid béo (các hợp chất hữu cơ quan trọng trong ngành công 5 nghiệp hóa chất). Alcohol, aldehyde và acid béo là các loại hóa chất rất quan trọng trong các quá trình sản xuất và trong đời sống hằng ngày. Nhƣng để sản xuất các chất này bằng con đƣờng hóa học phải cần qui trình sản xuất ở nhiệt độ và áp suất cao. Nhân tố chính và qu an troṇg nhất để có thể giảm chi phí của t oàn bô ̣qui trình sản xuất là chi phí xúc tác sinh học , quyết điṇh bởi giá cả của môi trƣờng và nguồn C dùng cho tế bào , hoạt tính và tính ổn định của xúc tác sinh học trong đi ều kiện sản xuất. Nếu hoạt tính xúc tác sinh học gấp đ ôi và ổn điṇh se ̃giảm t oàn bô ̣chi phí của quá trình đến 5,7 USD/kg (đối với fed – batch) và 5,9 USD/kg (đối với qui trình sản xuất liên tục). Vì vậy việc tăng hoạt tính của enzyme đóng vai trò rất quan trọng . 2.3. Giới thiệu về Rhodococcus opacus B4 Tƣ̀ trƣớc đến nay , họ rhodococci rất ít đƣơc̣ quan tâm vì nhiều lý do . Môṭ trong nhƣ̃ng lý do đó là ho ̣vi khuẩn này sinh trƣởng châṃ , khó phân lập và thiế u dấu hiêụ để nhận biết có phải là nguồn gây bệnh hay không . Gần đây, họ vi khuẩn này đang là đối tƣơṇg nghiên cƣ́u trên nhiều quốc gia . Môṭ trong nhƣ̃ng nghiên cứu là ứng dụng chúng vào biến đổi hóa học và sinh tổng hợp các hơp̣ chất hữu cơ. R. opacus chiếm phần lớn trong quần thể vi sinh vâṭ sống trong đất . R. opacus có thể sống ở 33oC, nhƣng không thể sống ở 42oC, có thể sống ở nhiệt độ thấp (4 – 10oC) và trong kh oảng pH rôṇg (5 – 9). Rhodococcus opacus có nhiễm sắc thể dạng thẳng và các plasmid dạng thẳng , có kích thƣớc rất lớn , có thể sử dụng nhiều loại chất hƣ̃u cơ làm nguồn hydrocarbon nhƣ benzene , toluene, napthalene, n- alkane... Khi có măṭ n- alkane , rhodococci tạo ra 1 loại saccharide ngoại bào gọi là EPS (extra cellular polysaccharides ), phát triển cấu trúc màng nội bào , cũng nhƣ tăng cƣờng phát triển vách tế bào (Ivshina và ctv, 1982; Glazacheva và ctv, 1990). Khi tăng trƣởng trên n- alkane lỏng, rhodococci có khả năng tổng hơp̣ các chất h oạt tính bề mặt giúp giảm đô ̣căng bề măṭ của nƣớc , tạo thể sữa và có nhiều ƣu điểm trong việc tổng hơp̣ các chất tẩy rƣ̉a. Các chất hoạt tính bề mặt từ rhodococci ít độc hại hơn 100 lần so với các chất tẩy rƣ̉a tổng hơp̣ khác . Rhodococci rất đƣơc̣ quan tâm về măṭ sinh thái và cả về măṭ công nghiêp̣ vì chúng có khả năng tổng hợp cá c acid ngoaị bào , bao gồm các acid amine thiết yếu khi phát triển trên n- alkane. 6 Hình 2.2: Vi khuẩn Rhodococcus opacus B4 Bảng 2.1: Đặc tính sinh lý sinh hóa của Rhodococcus Nguồn tạ o acid : Nhạ y cảm với : Glucose - Penicillin G - Mannitol O Polymicine B - Inositol O O/129 - Sorbitol O Nalidixic acid - Rhamnose - Tobramicine - Sucrose - Chloramphenicol + Melibiose - Thủy phân : Amigdalin - Aesculin - Arabinose - Gelatin - Glycerol O Agar - Maltose - Starch - Galactose - Tween 40 + Mannose - Tween 80 + Starch - Fructose O 7 Phả n ứng Gram + Thử nghiệm sinh hóa Tạ o bào tử - Urease + Khoả ng pH tăng trưởng 5 -> 9 Lysine decarboxylase - Nồng độ NaCl tăng trưởng (%) Ornithine decarboxylase - tố i thiể u 0 β-galactosidase + tố i đa 9 Arginine dihydrolase - Nguồn carbon sử dụng Tryptophane deaminase - Glucose - Tạ o Indole - Arabinose - Voges-Proskauer + Mannose - Khử Nitrate thành Nitrogen - Mannitol + Hình thành H2S - N-acetyl-glucosamine + Alkaline phosphatase + Maltose - Esterase + Gluconate + Esterase lipase + Caprate - Lipase + Adipate + Leucine arylamidase + Malate + Valine arylamidase + Citrate - Acid phosphatase + Phenyl-acetate + α-glucosidase + Acetic acid - β-glucosidase + Citric acid nd Tăng trưởng trên nhiề u môi trường rắ n + D-Alanine - TSA + L-Alanine - TSA + 3%NaCl + L-Alaninamide - NA + L-Serine - NA + 3%NaCl + L-Leucine nd TSB + 8 (O: oxy hóa, nd: chƣa xác điṇh) 2.4. N- alkane monooxygenase (hydroxylase) Tên chính thƣ́c của loại enzyme này l à n- alkane monoxygenase, ngoài ra còn có nhiều tên gọi khác nhƣ alkane 1- hydroxylase, fatty acid - hydroxylase, lauric acid - hydroxylase, - hydroxylase. Hình 2.3: Mô hiǹh AlkB – alkane hydroxylase (17) Enzyme alkB đƣơc̣ giả thiết là có 6 trục xoắn, đƣơc̣ sắp xếp theo hình luc̣ giác , tạo ra môṭ túi dài ky ̣ nƣớc cho alkane mac̣h thẳng có thể che n vào . Các phân tử histidine có tính bảo tồn cao gắn với nhân Fe. Tính chất: không bền, trọng lƣợng phân tử lớn, tƣơng đối không tan, khó tinh chế, là protein liên kết màng có mang 2 nguyên tử Fe nhƣng không mang nhân heme (chỉ có 1 lƣơṇg nhỏ heme và flavin). 9 Sơ đồ 2.2: Con đƣờng chuyển hóa của n-octane  Cơ chế hoạt đôṇg: 1 – Octanol n – Octane Pseudomonas oleovorans Alkane 1 - monooxygenase Alcohol dehydrogenase 1 – Octanal Alkyl hydroperoxide reductase Octane hydroperoxide Salmonella choleraesuis Octanoate Octanoyl – CoA Acyl – CoA synthetase Aldehyde dehydrogenase Intermediary metabolism (KEGG) 10 AlkB chuyển 1 nguyên tƣ̉ oxygen tƣ̀ phân tƣ̉ O 2 đến nhóm methyl cu ối cùng của phân tử alkane để tạo alcohol , còn electron từ rubredoxin khử nguyên tử O còn lại thành H2O. 11 Sơ đồ 2.3: Cơ chế oxy hóa nhóm methyl cuối của n- alkane(18) Rubredoxin là 1 loại protein có khối lƣơṇg phân tƣ̉ thấp , có chứa nhân Fe , có vai trò quan troṇg trong viêc̣ vâṇ chuyển điêṇ tƣ̉ trong tế bào . 12 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2006 đến tháng 6/2006. Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh hóa của khoa CNSH, trƣờng Đại học Osaka, Japan. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Chủng vi khuẩn và phƣơng pháp nuôi cấy Rhodococcus opacus B4 (đƣơc̣ cung cấp bởi đaị hoc̣ Hiroshima ), đƣơc̣ nuôi cấy trên môi trƣờng TSB, cùng với nguồn C , lắc đều ở 30oC. E. coli JM109 (Takara, Japan), nuôi cấy trên môi trƣờng LB có ampicillin (5 mg/ml) khi cần thiết. Chọn lọc bằng kháng sinh và khả năng phân giải X – gal. 3.2.2. Plasmid pRO : vector plasmid Plasmid pRO có mang gene ma ̃hóa RepA , RepB nên có thể nhân bản trong E. coli JM109 và Rhodococcus opacus B4. Promoter tac là promoter maṇh , tăng khả năng biểu hiêṇ của gene. T – B1/B2: (~ 4,2 kb) 3 kb + 1,2 kb 3.2.3. PCR primers B1_F : 13 ROalkB1EcoF (Tm o C = 62,9; ABS = 0,251; TE= 457,4 l; 355,7 g; 45,7 nmol) GAG GTT GAA TTC GTG ACG ACG TCG G B1_R : ROalkB1BamR (Tm o C = 66,1; ABS = 0,245; TE = 468,3 l; 359,1 g; 46,8 nmol) GGT AGG GGA TCC TCA CCG AAC TCC G B2_F : ROalkB2EcoF (Tm o C = 61,2; ABS = 0,293; TE = 503,1 l; 391,4 g; 50,3 nmol) TGA GGA GAA TTC GTG ACG ACG AAC G B2_R : ROalkB2BamR (Tm o C = 61,2; ABS = 0,323; TE = 643,9 l; 488,9 g; 64,4 nmol) GAT AAC GGA TCC TTA CTT CGC TCC G 3.2.4. Môi trƣờng  LB, TSB (20 g/l)  SOB - Bacto Trypton (Difco) 20 g/l - Yeast extract (Difco) 5 g/l - NaCl 0,5 g/l - 1M KCl 2,5 ml/l  SOC - SOB 5 ml - 2M MgCl2 25 l - 1M MgSO4 100 l - 1M glucose 100 l  TB buffer - PIPES 1.5 g ( thƣờng ở dạng rắn và không tan ở pH thấp, nên phải đƣa pH lên 6.7 bằng cách thêm KOH để làm tan). 14 - CaCl2.2H2O 1.1 g - KCl 9.3 g - MnCl2.4H2O 5.45 g  thêm miliQ cho đủ 500 ml  lọc  trƣ̃ ở 4oC.  HS buffer - pH 7.0 - Sucrose 8.63% - HEPES 0.17% Trƣ̃ ở 4oC  Thành phần hỗn hợp PCR khuẩn lạc Phân phối 20 l dic̣h PCR / 1 mâũ Thành phần có trong 50 l dic̣h PCR : MgCl2 4 l (4 o C) Mg free buffer 5 l (4 o C) 2mM dNTPs 5 l (-4 o C) Primer F 2 l Primer R 2 l Taq polymerase 0.2 l (on ice) Thêm nƣớc khử ion vào cho đủ 50 l 15 3.3. Chiến lƣợc thí nghiệm tổng quát Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm tổng quát ligation pRO – B1/B2 Chuyển nạp bằng dòng điện vào R. opacus B4 đánh giá năng suất enzyme chuyển nạp bằng phƣơng pháp shock nhiệt vào E. coli JM109 PstI BamHI PstI blunting blunting EcoRI EcoRI 16 3.4. Phƣơng pháp 3.4.1. Kỹ thuật 3.4.1.1. PCR PCR là phƣơng pháp để khuếch đaị 1 đoạn gene. Tƣ̀ đó, ta có thể ƣ́ng duṇg để thu 1 đoạn gene mong muốn hay kiểm tra xem vi khuẩn có mang đ oạn gene đó hay không. Môṭ chu kỳ PCR có 3 bƣớc cơ bản : biến tính, bắt mồi, kéo dài.  Bƣớc biến tính mở đầu : viêc̣ biến tính hoàn toàn DNA khi bắt đầu phản ứng PCR rất quan troṇg . Biến tính không hoàn toàn DNA se ̃dâñ đến viêc̣ không sƣ̉ duṇg hiêụ quả khuôn DNA , dâñ đến lƣơṇg sản phẩm PCR giảm . Thƣờng đƣợc thực hiện ở 94 o C.  Biến tính : Chỉ cần khoảng 30 giây đến 2 phút ở 94 – 95 o C , vì sản phẩm PCR tổng hơp̣ tƣ̀ chu kỳ đầu ngắn hơn hẳn so với khuôn DNA ban đầu .  Bắt mồi: thƣờng thấp hơn 5oC so với nhiêṭ đô ̣tan của phƣ́c hợp DNA khuôn và mồi (Tm = 4(G + C) + 2(A + T)).  Kéo dài: thƣờng thƣc̣ hiêṇ ở 70 – 75oC, nhiêṭ đô ̣thích hơp̣ nhất để DNA taq polymerase tổng hơp̣ DNA .  Bƣớc kết thúc : sau chu kỳ tổng hơp̣ cuối cùng , ủ ở 72oC tƣ̀ 5 – 15oC. Bƣớc này có chƣ́c năng hoàn tất sản phẩm PCR mới tổng hơp̣ . Và cũng trong bƣớc này , Taq DNA Polymerase thêm a. nucleotides vào đầu 3' của sản phẩm PCR (dùng để ligate với pGEM – Teasy).  Chu kỳ nhiêṭ đô ̣cho n- alkane monooxygenase AlkB1: 94 o C (5 phút)  94oC (1 phút)  56oC (1 phút)  72oC (1 phút)  72oC (10 phút): 30 chu kỳ. AlkB2: 94 o C (5 phút)  94oC (1 phút)  52oC (1 phút)  72oC (1 phút)  72oC (10 phút): 30 chu kỳ. 3.4.1.2. Thiết kế mồi: (Innis and Gelfand, 1991)  Nguyên tắc: Chiều dài mồi từ 17 – 28 base Thành phần mồi nên từ 50 – 60% GC Mồi nên kết thúc bằng G hay C hay GC hay CG để ngăn hiện tƣợng “breathing” ở đầu 3‟ và tăng hiêụ suất khi bắt mồi 17 Nhiêṭ đô ̣tan tƣ̀ 55 – 80oC Nên tránh chuỗi tƣ̀ 3 G hay 3 C trở lên vì dê ̃gây bắt căp̣ nhầm với trình tƣ ̣giàu GC bởi tính ổn điṇh của quá trình bắt mồi Tránh trình tự tạo dimer hay cấu trúc kẹp tóc 3.4.1.3. Sắc ký khí Sắc ký khí là phƣơng pháp phân tích môṭ hỗn hơp̣ khí . Pha chuyển đô ̣ng là khí trơ hay môṭ chất bay hơi và pha ổn điṇh là môṭ chất lỏng hay môṭ chất rắn . Cấu trúc của máy sắc ký khí gồm 5 phần:  Pha chuyển đôṇg: có chức năng mang mẫu đi qua pha ổn định trong cột phân tách. Để thƣc̣ hiêṇ chƣ́c năng này, ngƣời ta thƣờng sƣ̉ duṇg các khí trơ nhƣ nitrogen , helium, argon, ... Pha chuyển đôṇg đi qua côṭ nhanh hơn mâũ phân tích .  Cổng lấy mâũ : là nơi tiêm mẫu khí phân tích . Cổng lấy mâũ phải có vách ngăn bằng cao su để ngăn rò rỉ khí và để tiêm mâũ vào . Phần này của máy có nhiêṭ đô ̣ cao hơn nhiêṭ đô ̣sôi của các hơp̣ chất khí trong mâũ khí phân tích .  Côṭ phân tách: đƣơc̣ đăṭ trong lò ổn nhiêṭ. Côṭ chƣ́a pha ổn điṇh. Pha ổn điṇh ở đây có thể là chất rắn hay là chất lỏng không bay hơi nhƣ hydrocarbon phủ trên nền rắn. Dạng thứ hai này đƣợc dùng để phân tách các chất khí có khối lƣợng phân tử t hấp. Có 2 loại côṭ : Côṭ nén : gồm có lõi thủy t inh hay lõi sắt không rỉ, đƣơc̣ nhồi pha cố điṇh. Chiều dài và đƣờng kính c ột ảnh hƣởng thời gian lƣu . Thông thƣờng, chiều dài của cột từ 0,9 m đến 1,8 m, đƣờng kính trong tƣ̀ 2 – 4 mm. Côṭ mao dâñ : là một ống mao dẫn mỏng l àm từ thạch anh nóng chảy , có pha ổn điṇh phủ trên bề măṭ phía trong ống . Đƣờng kính cột thƣờng là 0,25 mm và 0,32 mm. Loại ống phổ biến nhất có chiều dài 30 m.  Detector: Các thành phần của hỗn hợp mẫu đi qua cột với vận tốc khác nhau và đƣợc phát hiện bởi detector khi chúng ra khỏi côṭ . Có nhiều l oại detector, thông dụng nhất là flame ionization detector (FID) gồm ngoṇ lƣ̉a màu đỏ tạo bởi khí H 2, không khí và môṭ điã thu . Sau khi mâũ khí qua c ột sắc ký , nó đi qua ngọn lửa và giải phóng các ion . Các ion này phát ra lƣợng tín hiệu điện bằng với lƣợng hợp chất có trong mâũ. Tính dẫn điện của khí tƣơng ứng với nồng độ các h ạt mang điện tích trong khí . 18 Quá trình ion hóa ngắn hay dài là tùy thuôc̣ bản chất của hơp̣ chất (cấu trúc phân tƣ̉) và nhiệt độ ngọn lửa (phụ thuộc tỉ lệ H2 / không khí / khí mang). FID có thể phát hiêṇ cho tới 5 – 10% thành phần có trong 1 l mâũ vâṇ tốc k hí lƣu thông thƣờng. Ở nồng độ cao hơn, ngọn lửa bị quá tải, kết quả se ̃không chính xác.  Tổng hơp̣: là chƣơng trình máy tính , xƣ̉ lý dƣ̃ liêụ sau mỗ i phép đo đac̣ , có chƣ́c năng: Phân biêṭ các peak và đƣờng bi ̣ nhiêũ Xác định điểm đầu và điểm cuối của các peak Đo diêṇ tích các peak Đo thời gian lƣu các peak Điều chỉnh laị đô ̣lêc̣h đƣờng nền Điều chỉnh laị để đƣơc̣ các peak đối xƣ́ng Thiết bi ̣ sắc ký khí đƣơc̣ dùng ở đây có pha chuyển đôṇg là khí N2, côṭ mao dâñ (0,25 mm x 30 m), FID.  GC (Shimadzu GC-14B) Mâũ 1 C6 (999 l hexane + 1 l hexanol) 2 C61 (Alk B1) 3 C62 (Alk B2) 4 C6 control (wild type) 5 C7 6 C71 7 C72 8 C7 control 9 C8 10 C81 11 C82 12 C8 control Khí mang: N2 Thể tích mẫu: 1 l 19 Nhiêṭ đô ̣lò: 80oC/ 7 phút, sau đó tăng nhiêṭ đô ̣lên đến 250oC với vâṇ tốc gia nhiêṭ: 5oC/ phút Nhiêṭ đô ̣ở cổng lấy mâũ: 210oC Nhiêṭ đô ̣côṭ: 90 oC Nhiệt độ phát hiện: 250 oC 3.4.2. Phƣơng pháp 3.4.2.1. Phân lập Rhodococcus opacus B4 (5) Mẫu đất đƣợc lấy từ các nhà máy hóa chất và ở ven đƣờng ở Hiroshima, Japan. Ủ 5 g đất với 1 ống nghiệm nhỏ chứa benzene trong 1 bình 50 ml có nắp đậy trong vòng 1 tuần ở 28oC. Sau đó, hòa tan 1 g đất đó với 4 ml nƣớc vô trùng và để yên trong 30 phút. Cho 1 ml dịch đất này vào 9 ml môi trƣờng MSB, thêm 0,5 ml benzene trong 1 bình có nắp đậy có 1 ống nghiệm nhỏ chứa 0,5 ml benzene. Ủ, lắc (120 rpm) bình này trong 5 ngày ở 28oC. Tiếp đó, 1 ml dịch cấy này đƣợc ủ tiếp với 9 ml môi trƣờng MSB mới trong 2 ngày. Cứ pha loãng nhƣ vậy rồi cấy trên môi trƣờng thạch MSB rồi ủ trong tủ làm khô với 1 cốc becher chứa benzene lỏng. Đem các khuẩn lạc thu đƣợc cấy trở lại vào môi trƣờng lỏng để khẳng định khả năng chuyển hóa benzene. Giữ chủng vi khuẩn thu đƣợc trên dĩa thạch TSB. Chủng B4 đƣợc quan tâm nhiều vì có tốc độ sinh trƣởng nhanh nhất so với các chủng R. opacus khác. 3.4.2.2. Phƣơng pháp khuếch đại đoạn gene bằng PCR Khuếch đaị đ oạn DNA mang cuṃ gene ma ̃hóa cho n- alkane monooxygenase alkB1, alkB2 tƣ̀ DNA nhiêm̃ sắc thể của l oài R. opacus B4 bằng PCR với căp̣ primer đăc̣ hiêụ lần lƣơṭ mang site cắt EcoRI và BamHI . Sau đó các đoạn khuếch đaị với kích thƣớc khoảng 1,2 kb sẽ đƣơc̣ loc̣ tƣ̀ gel sau khi điêṇ di và ligate vào pGEM – Teasy để tăng hiêụ suất khi xƣ̉ lý với enzyme giới haṇ (EcoRI và BamHI). 3.4.2.3. Phƣơng pháp tách plasmid từ vi khuẩn (theo protocol của Miniprep) Nuôi cấy vi khuẩn trong 3 ml môi trƣờng LB , cùng với 3 l kháng sinh thí ch hơp̣ (Ampicillin hay Chloramphenicol) qua đêm. Ly tâm dic̣h nuôi cấy vi khuẩn 8000 rpm/1 phút/ 4oC. Hòa tan hoàn toàn tủa tế bào trong 250 l cell resuspension solution. Thêm vào 250 l cell lysis solution, đảo 4 lần để trôṇ đều , thêm vào 10 l alkaline protease solution, đảo 4 lần để trôṇ đều , ủ ở 20 nhiêṭ đô ̣phòng trong 5 phút. Thêm vào 350 l dung dịch trung hòa (Neutralization solution), đảo 4 lần để trôṇ đều. Ly tâm với tốc đô ̣cƣc̣ đaị trong 10 phút. Chuyển dic̣h t rong vào column , đăṭ trong collection tube, ly tâm trong 1 phút. Bỏ dịch thu đƣợc . Thêm vào 750 l dung dịch rửa cột (đa ̃hòa EtOH nhƣ hƣớng dâñ ). Ly tâm với tốc đô ̣cƣc̣ đaị trong 1phút. Lăp̣ laị bƣớc rƣ̉a plasmid với 250 l dung dịch rửa cột. Ly tâm với tốc đô ̣cƣc̣ đaị trong 2 phút. Chuyển column vào eppendor f 1,5 ml. Thêm vào column 100 l Nuclease free water, ly tâm trong 1 phút. 3.4.2.4. Ligation vào T- vector DNA 1 l T – easy vector 0,5 l T4 DNA ligase 1 l 2X ligation buffer 2,5 l  ủ ở 16oC từ 30 phút cho đến khi bắt đầu bƣớc chuyển nạp. 3.4.2.5. Kỹ thuật blunt-end DNA 8 l Buffer 1 l 9 l  ủ 70oC trong 5 phút  thêm vào 1 l T4 DNA polymerase  ủ ở 37oC trong 5 phút.  thêm nƣớc khƣ̉ ion vào cho đủ 400 l 40 l sodium acetate Phenol chloroform tủa ethanol 3.4.2.6. Chuyển nạp bằng phƣơng pháp shock nhiệt Chuẩn bi ̣ E. coli JM109 (competent cell) Cấy chủng JM109 trong môi trƣờng LB (1 đĩa và 1 ống nghiệm), ủ qua đêm ở 37 o C. Lấy 50 l dịch nuôi cấy đó chuyển vào môi trƣờng SOC lỏng. Ủ khoảng 2 – 3 giờ ở 37oC cho đến khi đạt độ OD ở bƣớc sóng 660 nm khoảng 0,4 – 0,6. Giữ dịch nuôi cấy trên đá lạnh khoảng 10 phút. Ly tâm với vận tốc 3000 vòng ở 4oC trong 15 phút, sau đó hòa tủa tế bào thu đƣợc trong 3,4 ml TB buffer. Để trên đá lạnh 10 phút rồi đem ly tâm với vận tốc 3000 vòng ở 4 oC trong 10 phút. Hòa tủa tế bào thu đƣợc 21 với 800 l TB buffer và 7% (tƣơng đƣơng khoảng 56 l) dung dịch DMSO. Để trên đá lạnh 10 phút, phân phối 200 l hay 400 l vào mỗi eppendorf. Đem trữ lạnh ở -80 o C cho đến khi dùng. Ligation and chuyển nạp bằng phƣơng pháp shock nhiêṭ 4 l insert DNA 1 l vector DNA ủ ở 16oC trong 1giờ 5 l 2X ligation mixture Competent cell JM 109 để tan tƣ̀ tƣ̀ trên đá trong 10 phút. Thêm vào plasmid , hòa đều , để trên đá trong 30 phút, ủ ở 42oC trong vòng 30 giây. Để trên đá trong 2 phút. Sau đó thêm môi trƣờng LB vào sao cho tổng thể tích là 1 ml. Đem ủ ở 37 o C trong 30 phút. Ly tâm 5000 rpm /4oC/1 phút, bỏ đi 900 l dic̣h nổi . Nuôi cấy 100 l dịch tế bào còn lại trên môi trƣờng LB thạch với 20 l Chloramphenicol. Ủ qua đêm ở 37 o C. Chuyển các khuẩn lac̣ thu đƣơc̣ qua diã thac̣h LB mới có chƣ́a Chloramphenicol, ủ qua đêm rồi đem PCR từng khuẩn lạc đó để xác định khuẩn lạc nào có pRO – B1/B2. 3.4.2.7. Điêṇ chuyển (Electroporation) Nuôi cấy chủng B4 trong ống môi trƣờng TSB trong 24 giờ. Lấy 1 ml dic̣h nuôi cấy này cho vào bình tam giác thể tích 100 ml có chƣ́a 9 ml TSB (0.5% (w/v) glycine). Lắc, ủ ở 28oC trong 24 giờ. Ly tâm với vận tốc 8000 g trong 5 phút ở 4oC và rƣ̉a tủa tế bào 2 lần bằng buffer HS đa ̃để laṇh . Hòa tủa tế bào trong 1ml HS buffer (1/10 V). Lấy 400 l dic̣h này trộn với 1 l DNA (để nồng đô ̣cuối cùng khoảng 0,1 – 1 g/ml). Ủ ở 40oC trong 10 phút, chuyển tất cả vào 2 mm gap cuvette , đem áp duṇg dòng điêṇ với điều kiêṇ 6,5 kV/cm, 725 Ω, 50 F. Ngay sau đó chuyển vào 4 ml môi trƣờng TSB trong ống nghiêṃ, đem ủ ở 28OC trong 24 giờ. Sau đó đem nuôi cấy trên môi trƣờng thac̣h TSB cùng với 20 l Chloramphenicol. 3.4.2.8. Xác điṇh hoạt tính enzyme Nuôi cấy tƣ̀ng l oại vi khuẩn riêng biêṭ (R. opacus B4 bình thƣờng, R. opacus B4 đã chuyển nạp AlkB1, R.opacus đã chuyển nạp AlkB2) trong môi trƣờng TSB lỏng 22 qua đêm. Lấy 100 l vi khuẩn, ủ chung với 900 l tƣ̀ng loại n- alkane (1- hexane, 1- heptane, 1- octane) riêng biêṭ . Sau 48 giờ, trải ra dĩa TSB có Chloramphenicol , ủ qua đêm ở 28oC, sau đó đếm số khuẩn lac̣ và so sánh. 23 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả Thu vector plasmid pRO tƣ̀ Ecoli JM109, thu insert plasmid T-AlkB1/ AlkB2 tƣ̀ Ecoli JM109. Cắt pRO bằng enzyme cắt PstI. Cắt T-AlkB1/B2 bằng enzyme cắt BamHI. Hình 4.1: Kết quả điện di sau khi xử lý enzyme cắt PstI đối với pRO, BamHI đối với T-AlkB1/AlkB2 Lane 1: thang chuẩn 1kb Ở kết quả điện di Hình 4.1, sau khi cắt plasmid chƣ́a g ene ma ̃hóa cho alkB 1 bằng BamHI, thu đƣơc̣ 2 mảnh DNA riêng biệt . Điều này có th ể là do tạp nhiễm một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 3 kb. Sau xử lý blunt-end các đọan DNA trên, cắt chúng bằng enzyme giới