Luận văn Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1. Máu và hệ thống nhóm máu ở người 3

1.2. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu 7

1.3. Kháng thể đơn dòng 10

1.3.1. Khái niệm 10

1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng 11

1.3.3. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 14

1.3.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam 17

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1. Vật liệu 19

2.1.1. Mẫu nghiên cứu 19

2.1.2. Sinh phẩm 19

2.1.3. Máy móc và thiết bị 20

2.2. Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1. Gây miễn dịch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 20

2.2.1.2. Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 23

2.2.2. Chuẩn bị tế bào nền 23

2.2.3. Nuôi cấy tế bào myeloma 24

2.2.4. Dung hợp và tạo dòng tế bào lai 24

2.2.5. Sàng lọc tế bào lai 26

2.2.6. Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên

B 27

2.2.7. Đánh giá tốc độ sinh trưởng và sản xuất kháng thể của tế bào lai 28

2.2.8. Phương pháp đếm tế bào lai (xác định số lượng tế bào sống) 29

2.2.9. Xác định loại globulin miễn dịch và kiểm tra tính đơn dòng của tế bào lai 29

pdf30 trang | Chia sẻ: anan10 | Lượt xem: 610 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
g đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ Rh. Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene. Phương pháp lai tế bào đã được ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có bản chất là kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad). Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy việc sử dụng huyết thanh mẫu càng gia tăng. Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu 2 mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại. Việc sử dụng hồng cầu mẫu làm thuốc thử xác định nhóm máu tốn ít chi phí nhưng lại mất rất nhiều máu thu được từ người tình nguyện. Còn sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại có giá thành cao làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu B ở người. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Máu và hệ thống nhóm máu ở người 1.1.1. Khái niệm máu và các thành phần của máu Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ thành phần là các tế bào (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu) và huyết tương (chứa protein, muối khoáng, nước) với vai trò cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo các tổ chức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể như khí CO2 và acid lactic. Đồng thời máu cũng là phương tiện vận chuyển của các tế bào (cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác nhau (các amino acid, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể. Các rối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bình thường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau [3, 4]. Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60 - 70 ml/kg); thể tích máu ở nam khoảng 5 - 6 lít, nữ 4,5 – 5 lít; tỷ trọng 1,055 – 1,063, pH 7,33 – 7,43.  Hồng cầu Hồng cầu trưởng thành là bào quan hình đĩa lõm, không chứa nhân và các bào quan (ty lạp thể, polyribosom) do vậy không có khả năng tổng hợp protein, hồng cầu chứa chủ yếu huyết sắc tố làm nhiệm vụ gắn O2 ở phổi vận chuyển tới các tổ chức sau đó vận chuyển CO2 đào thải qua phổi. Hồng cầu trưởng thành sống 120 ngày, được phân giải chủ yếu ở lách và tổ chức liên võng khác. Sự cân bằng giữa môi trường và hồng cầu được duy trì bởi hoạt động của bơm natri nằm trên màng hồng cầu. 1.1.2. Vai trò của máu trong y học Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng (protein, gluco, lipit, muối khoáng, các nội tiết tố ...) đến các tế bào, đồng thời cũng mang đi các sản phẩm dư thừa của các tế bào này. Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu. Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua 4 hệ thống tuần hoàn. Khi cơ thể bị viêm nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn dịch đến vị trí lây nhiễm để ngăn chặn các tác nhân có hại [15]. Với những chức năng như trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ thể, thiếu máu hoặc máu không thực hiện được chức năng sẽ gây ra nhiều rối loạn cho toàn bộ cơ thể. Mất máu do phẫu thuật, bị thương hoặc bị ốm. Cơ thể thiếu máu (bệnh thiếu máu địa trung hải, bệnh thiếu máu cấp, tủy xương giảm khả năng sản xuất hồng cầu đối với người xạ trị) hoặc do máu không thực hiện được chức năng (bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm v.v) [4]. 1.1.3. Phân loại các hệ thống nhóm máu ở người Việc sử dụng máu để điều trị đã được áp dụng từ thế kỷ 17 và trong suốt thế kỷ 18, tuy nhiên nhiều tai biến rất nguy hiểm đã xảy ra nhưng mãi đến năm 1900 con người mới bắt đầu hiểu được nguyên nhân của tai biến là do sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận. Năm 1901, Karl Landsteiner là người đầu tiên phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO, phân loại các nhóm máu dựa vào kháng nguyên bề mặt trên màng tế bào hồng cầu, với phát hiện này, ông đã được nhận giải Nobel về sinh lý và y học năm 1930. Nghiên cứu của ông chỉ ra rằng kiểu nhóm máu của những người khác nhau có thể không giống nhau và phụ thuộc vào kháng nguyên tồn tại trên màng hồng cầu. Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc không có mặt của kháng nguyên A hoặc kháng nguyên B trên màng hồng cầu và việc xác định nhóm máu trước khi truyền máu là cần thiết [5]. Năm 2014, theo thống kê của Hiệp hội truyền máu Quốc tế có khoảng 35 hệ thống phân loại nhóm máu (hệ ABO, hệ Rh, hệ MNS, hệ Kell, hệ Kidd, hệ Lewis, hệ Duffy, hệ Indian,) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau [6]. Trên màng hồng cầu người có khoảng 30 loại kháng nguyên thường gặp và hàng trăm loại kháng nguyên hiếm gặp. Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng cầu có tính kháng nguyên yếu, thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền chỉ có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong 5 truyền máu và trong sản khoa. Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường (glycan hoặc carbohydrate) hoặc protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu. DNA của người quy định kiểu kháng nguyên hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ: kháng nguyên đường; kháng nguyên protein (protein xuyên màng một lần, nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol). Kháng nguyên nhóm máu ABO có bản chất là đường. Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham gia của các enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường. DNA quy định kiểu enzyme của mỗi cá thể thông qua đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành tương ứng trên màng tế bào hồng cầu. Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh lại có bản chất là protein, DNA của cá thể mang thông tin di truyền quy định protein - kháng nguyên. Gen RhD mã hóa kháng nguyên D, được biểu hiện ở những người mang gen, một vài người có gen không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ. Bên cạnh kháng nguyên đường, tế bào hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng một lần, protein xuyên màng nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9]. Hình 1.1. Kháng nguyên nhóm máu ở người 1.1.4. Hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên nhóm máu ABO Theo Landsteiner, trên màng hồng cầu có những kháng nguyên được gọi là 6 ngưng kết nguyên. Có 2 loại ngưng kết nguyên là A và B. Ngưng kết nguyên là polysaccharide có mặt trên màng hồng cầu từ giai đoạn sớm của bào thai. Ðồng thời trong huyết tương có những kháng thể đặc hiệu của nhóm máu được gọi là ngưng kết tố. Có 2 loại kháng thể đặc hiệu là kháng A (anti-A) và kháng B (anti-B). Các kháng thể này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu khi hồng cầu nhóm máu A gặp anti-A, hoặc hồng cầu nhóm máu B gặp anti-B. Tùy theo, sự có mặt hoặc vắng mặt của một trong hai hoặc cả hai kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu, Landsteiner phân hệ thống nhóm máu ABO thành 4 nhóm máu A, B, AB và O (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Các nhóm máu hệ ABO ở người Nhóm máu Hồng cầu có kháng nguyên A hoặc B Huyết thanh có kháng thể anti-A hoặc anti-B A A anti-B B B anti-A AB A và B (không có) O (không có) anti-A và anti-B Về bản chất, kháng nguyên nhóm máu ABO là các carbohydrate có mặt trên màng hồng cầu và nhiều mô, được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu (Hình 1.2). Các chuỗi đường này được gắn trên bề mặt hồng cầu bởi một phần có cấu trúc giống nhau được gọi là thân carbonhydrate (kháng nguyên H). Chuỗi đường cơ bản này không gây ngưng kết hồng cầu nên hồng cầu mang chuỗi đường cơ bản được kí hiệu là nhóm máu O. Khi chuỗi đường cơ bản gắn thêm một gốc đường galactose hoặc galactosamine thì chúng gây ngưng kết hồng cầu B, nên đặc trưng cho nhóm máu B. Chuỗi đường đặc trưng nhóm máu B được gắn thêm một nhóm N-acetyl thì chúng gây ngưng kết hồng cầu A nên đặc trưng cho nhóm máu A [10]. 7 Hình 1.2. Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO (RBC – tế bào hồng cầu, GLU – Glucose, GAL – Galactose/Glucosamine, FUC – Fructose, NAc – N-Acetyl) Hệ miễn dịch có hiện tượng chống lại các kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân của hồng cầu. Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh. Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể kháng A trong huyết thanh. Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh. Còn người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B [11]. 1.2. Truyền máu và nguyên tắc truyền máu 1.2.1. Nguyên tắc truyền máu Truyền máu là quá trình đưa các thành phần của máu vào trong tĩnh mạch của một người khác. Trước đây, sử dụng máu toàn phần để truyền máu nhưng hiện nay các thành phần của máu được truyền trong các trường hợp khác nhau, hồng cầu được sử dụng để tăng khả năng vận chuyển oxy máu, tránh sự mệt mỏi và các biến chứng khác. Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích máu được truyền. Hầu hết truyền máu được thực hiện tại bệnh viện nhưng nó cũng được thực hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết. Trong hầu hết trường hợp, máu có nguồn gốc từ những tình nguyện viên đã sàng lọc bằng huyết thanh 5 bệnh nhiễm trùng: HIV, HCV, HBV, giang mai, sốt rét [12]. Màng của mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên tự thân, được 8 bỏ qua bởi hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, trong quá trình truyền máu, các kháng thể nhóm máu có trong huyết tương của người nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng cầu cho nào mang kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy hồng cầu gây ra phản ứng tan máu cấp tính. Do đó, xác định sự tương thích nhóm máu giữa người cho và người nhận cũng như sự tương tích nhóm máu giữa người cho và người nhận là cần thiết để truyền máu an toàn [13]. Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt hồng cầu (A hoặc B) và kháng thể trong huyết thanh (anti-A hoặc anti-B) quá trình truyền máu được thực hiện theo nguyên tắc sau [15]. - Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng nguyên B, có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu A hoặc AB. - Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể kháng A trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu B hoặc AB. - Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh, do đó chỉ có thể truyền máu cho người có nhóm máu AB. Người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B do đó có thể truyền máu cho tất cả các nhóm máu. Hình 1.3. Sơ đồ truyền máu 9 1.2.2. Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO Nhóm máu hệ ABO được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu hoặc phương pháp hồng cầu mẫu. Theo thông tư của Bộ Y tế (2013) để kết luận một nhóm máu thuộc hệ ABO thì mẫu máu phải được định nhóm bằng cả hai phương pháp: phương pháp huyết thanh mẫu và phương pháp hồng cầu mẫu. Phương pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trước kháng thể cho phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu từ đó xác định được kiểu nhóm máu của bệnh nhân. Các mẫu huyết thanh dùng để xác định nhóm máu hệ ABO bao gồm: huyết thanh mẫu anti- A, anti-B và anti-AB. Cách xác định nhóm máu thông qua phương pháp huyết thanh mẫu như sau (Bảng 1.2). - Không bị ngưng kết với 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu là nhóm máu O. - Ngưng kết với cả 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu thuộc nhóm máu AB. - Ngưng kết ở mẫu anti-A và anti-AB thì mẫu là nhóm máu A. - Ngưng kết ở vị trí Anti-B và Anti-AB thì mẫu kiểm tra là nhóm máu B Bảng 1.2. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu Anti-A Anti-B Anti-AB Nhóm máu A + - + Nhóm máu B - + + Nhóm máu AB + + + Nhóm máu O - - - (+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết; (-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng nguyên cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt trong huyết thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân. 10 Bảng 1.3. Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu Hồng cầu mẫu A Hồng cầu mẫu B Hồng cầu mẫu O Nhóm máu A - + - Nhóm máu B + - - Nhóm máu AB - - - Nhóm máu O + + - (+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết; (-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết 1.3. Kháng thể đơn dòng 1.3.1. Khái niệm Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành kháng thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được tạo ra. Chúng phản ứng với cả thụ thể của tế bào T. Trên mỗi phân tử kháng nguyên có các yếu tố quyết định kháng nguyên gọi là epitope và mỗi epitope đặc hiệu với một kháng thể do đó một kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau. Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính kháng nguyên (có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cơ thể); 2) tính miễn dịch (có khả năng kết hợp với kháng thể và các tế bào lympho). Kháng nguyên chia ra thành 2 loại kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức (yêu cầu sự tham gia của tế bào T) hoặc kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể mà trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu) [14]. Kháng thể là các phân tử glycoprotein sản xuất bởi tế bào B của hệ miễn dịch. Mỗi phân tử kháng thể gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau được gọi là chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau được gọi là chuỗi nặng. Bốn chuỗi này được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ Y. - Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng cố định (trình tự axit amin không thay đổi có thể là kappa - κ hoặc lamda - λ) và một vùng biến đổi (có trình tự axit amin biến đổi là vị trí liên kết với kháng nguyên). 11 - Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng cố định (CH1, CH2, CH3) và một vùng biến đổi (VH) đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ, có trình tự amino acid rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể. Hầu hết phần khác nhau này thuộc khu vực siêu biến đổi và thường chỉ gồm 6-10 amino acid. Chuỗi nặng của kháng thể có thể là γ (IgG), α (IgA), µ (IgM), ε (IgE) hoặc δ (IgD), IgG, IgA và IgD có 3 vùng hằng định và một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhưng không có vùng bản lề [17]. Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế bào B và nhận diện đặc hiệu một epitope trên kháng nguyên. Hình 1.4. Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 1.3.2. Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có giá trị kinh tế cũng như giá trị y học lớn. Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng đã được ứng dụng cho chẩn đoán, trị liệu và các xét nghiệm có độ nhạy cao [18]. Một số ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong lĩnh vực khoa học, công nghệ, y tế [6]: - Xác định hormon: Kháng thể đơn dòng được sử dụng để xác định mức hormon trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán các bệnh liên quan đến tuyến nội tiết như định lượng các hormon LH, FSH, progesteron, ostrogen. - Trong phân loại vi sinh vật: Kháng thể đơn dòng giúp định loại vi khuẩn, 12 virus, nấm gây bệnh ở người, động vật. - Trong dược học: Nghiên cứu dược động học của thuốc (quá trình biến đổi và đào thải của thuốc trong cơ thể). Dùng phát hiện các thuốc bị cấm sử dụng (doping, các chất gây nghiện), các chất độc hại với cơ thể tồn dư trong lương thực, thực phẩm. - Trong ghép tủy xương: Sau khi ghép tủy xương, muốn tránh hiện tượng đào thải mảnh ghép, người ta phải sử dụng thuốc chống đào thải làm ức chế hệ miễn dịch dẫn đến hệ thống phòng ngự của cơ thể bị tê liệt, dễ nhiễm bệnh. Đưa mAb đặc hiệu có định hướng vào cơ thể, chúng chỉ ức chế các yếu tố gây hiện tượng đào thải mảnh ghép mà không ức chế toàn bộ hệ thống miễn dịch của cơ thể, vì vậy mà sức đề kháng của cơ thể ít bị suy giảm hơn. - Thử thai: Khi một người nữ mang thai, hormon HCG được bài tiết qua nước tiểu. Dung dịch mAb kháng HCG liên kết với một enzyme sẽ bị biến đổi màu khi có sự hiện diện của HCG (Human Chorionic Gonadotropin). Do đó, khi cho dung dịch này vào ống nghiệm đựng nước tiểu nếu nước tiểu đổi màu thì có thai và ngược lại. - Trong bệnh tim mạch: Tơ myosin là một loại tơ cơ cấu thành nên các tế bào cơ. Một phần myosin của cơ tim bị phá hủy sau cơn nhồi máu. Bằng cách tiêm mAb đáp ứng với myosin ta có thể xác định được số lượng myosin mất để đánh giá tình trạng tổn thương của tim. Kháng thể đơn dòng được dùng để xác định vị trí cục máu đông trong cơ thể bệnh nhân bằng cách gắn vào sợi fibrin khi có cục máu đông. Việc này giúp các bác sĩ chẩn đoán và xử lý kịp thời. - Trong việc chống thải loại mô ghép: Kháng thể đơn dòng giúp xác định mô người cho có tương thích với người nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn dịch của bệnh nhân thải loại mô ghép. - Trong lĩnh vực chẩn đoán: Việc ứng dụng mAb vào lĩnh vực chẩn đoán đã đưa ra thị trường sản phẩm que thử nhanh, kit ELISA chẩn đoán nhanh (dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên và kháng thể). Đây là ứng dụng nổi bật và phổ biến nhất của mAb, trong đó mAb là yếu tố cơ sở không thể thiếu để sản xuất các 13 loại que thử nhanh, kit ELISA phát hiện nhiều loại kháng nguyên khác nhau như hormon (que thử thai phát hiện HCG, que thử phát hiện LH xác định rụng trứng ở phụ nữ), tác nhân gây bệnh, morphin, tồn dư kháng sinh, các dấu ấn ung thư như PSA, AFP. Hình 1.5. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể - Trong việc định nhóm máu hệ ABO và Rh: Kháng thể đơn dòng là những công cụ thiết yếu trong nghiên cứu, điều trị và kỹ thuật chẩn đoán [7, 24]. Nhưng thành công lớn của mAb là sử dụng trong miễn dịch, huyết học. Ngày nay mAb dần thay thế kháng thể đa dòng vì tính đặc hiệu, khả năng cung cấp với số lượng lớn, chi phí sản xuất thấp. Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có nguồn gốc từ người hoặc dịch chiết lectin của thực vật. Ngày nay, mAb được sử dụng để tạo thuốc thử định nhóm máu hệ ABO [16]. Kháng thể đơn dòng chuột có nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người ở việc nhận diện kháng nguyên A và B yếu, không lẫn tạp kháng thể, giá thành thấp và không bị phụ thuộc. Đã có nhiều công bố về việc sản xuất thành công mAb chuột để định nhóm máu hệ ABO. Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều sinh phẩm định nhóm máu hệ ABO có bản chất là mAb đã được thương mại như: Febrile Antigen Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin 14 international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient). 1.3.3. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng Một vài phương pháp được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng của người gồm: bất tử tế bào B, công nghệ phage display, chuột chuyển gen, công nghệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp [15].  Bất tử tế bào B sản xuất kháng thể đơn dòng Bất tử tế bào B được thực hiện bằng công nghệ lai tế bào hoặc công nghệ bất tử EBV (Epstein-Barr virus). Với công nghệ lai tế bào, sự dung hợp giữa tế bào lympho B miễn dịch và tế bào myeloma (người hoặc chuột) tạo ra tế bào lai mang đặc tính của cả 2 dòng tế bào đó là khả năng sinh trưởng vô hạn và sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên gây miễn dịch. Biến nạp EBV là cách làm bất tử tế bào lympho B. Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV không thể sinh trưởng vô hạn bởi vì chúng không phải là các tế bào ung thư, chúng khó nhân dòng và chỉ sản xuất một lượng nhỏ kháng thể. Công nghệ tế bào lai - EBV được thiết lập dựa trên sự kết hợp của 2 phương pháp và duy trì những ưu điểm của cả hai.  Công nghệ phage display sản xuất kháng thể đơn dòng Công nghệ phage display chọn lọc các gen quy định vùng chức năng (vùng biến đổi) của kháng nguyên để biểu hiện các mảnh kháng thể chức năng. Các bước chính trong phage display bao gồm: xây dựng thư viện kháng thể, biểu hiện trên bề mặt phage, lựa chọn phage biểu hiện kháng thể, sàng lọc phage biểu hiện kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích. Mảnh gen VH và VL được khếch đại từ mARN của tế bào lympho B sử dụng RT-PCR. Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment variable - scFv) được tạo ra bằng cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH và VL sử dụng PCR. Thư viện sau đó sẽ được tách dòng để biểu hiện scFv trên bề mặt của thực khuẩn thể. Lựa chọn phage biểu hiện scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong muốn bằng cách cho các dòng thực khuẩn thể biểu hiện scFv liên liên kết với các kháng nguyên hoặc hapten khác nhau. Các kháng thể không bám được loại bỏ bằng cách rửa sau đó kháng thể bám được rửa giải và nhân lên bằng cách lây nhiễm vào 15 E. coli. Lặp lại bước này một vài lần thì có thể lựa chọn được các mảnh scFv đặc hiệu kháng nguyên. Sau đó, sự đặc hiệu của mảnh scFv có thể được sàng lọc sử dụng phương pháp miễn dịch enzyme hoặc lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang nếu protein liên kết màng tế bào là đích. Khi sự đặc hiệu đã được phân lập, gen của các vùng biến đổi kháng thể được đưa vào vector biểu hiện toàn bộ kháng thể người và chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng người. Một thư viện phage display phân lập mAb đã được cấp phép bởi FDA và ít nhất 35 mARN người tạo ra từ công nghệ phage display đã được thử nghiệm lâm sàng.  Chuột chuyển gen sản xuất kháng thể đơn dòng Sử dụng chuột biến đổi gen là một kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng. Kỹ thuật chuyển gen chuột gồm sự phân cắt các locus gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ của chuột và chuyển gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ kappa của người vào.  Công nghệ kháng thể tái tổ hợp sản xuất kháng thể đơn dòng Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B sản xuất kháng thể được tiến hành như sau:đầu tiên tiến hành phân lập được tế bào B đơn từ lách chuột hoặc tế bào máu ngoại vi người (bằng vi hạt mang marker chọn lọc tế bào B) sau đó tách mRNA tổng hợp cDNA gen mã hóa cho các đoạn biến đổi trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể (bằng RT-PCR), tiến hành tổ hợp các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (sử dụng kỹ thuật PCR overlapping), cuối cùng biểu hiện trong vector nhân dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng người đặc hiệu in vitro. Đây là phương pháp biểu hiện kháng thể đơn dòng người có hiệu quả cao, tạo ra lượng lớn kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên trong một thời gian ngắn và yêu cầu một số lượng ít tế bào.  Công nghệ tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng Tế bào lai là tế bào được tạo ra sau quá trình dung hợp 2 tế bào và có chức năng sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn. Tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng (kháng thể đặc hiệu kháng nguyên) được tiến hành như sau: gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên đặc hiệu. Sau một vài tuần, thu máu từ chuột đã gây miễn dịch để định lượng kháng thể trong huyết thanh. Khi hiệu giá kháng thể 16 đủ cao, thu lách chuột để tách tế bào lympho B. Dung hợp tế bào lympho và ung thư tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase), nuôi cấy tế bào trong môi trường HAT (hypoxanthyl aminoteptrin thymidine). Tế bào myeloma mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme HGPRT (enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine). Ban đầu, sự vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đường thay thế để tổng hợp purine. Tuy nhiên, khi tế bào nuôi cấy trong môi trường aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đường thay thế khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT để tồn tại. Tế bào lympho B được phân lập từ chuột có enzyme HGPRT và cũng có khả năng sản xuất kháng thể, khi t

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdf01050003391_1_6546_2002689.pdf
Tài liệu liên quan