Luận văn Tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa Interferon alpha 2B của người trên hệ thống pichia pastoris

MỤC LỤC

TRANG

MỤC LỤC . i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮVIẾT TẮT . iii

DANH MỤC CÁC BẢNG . iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ. v

MỞ ðẦU . 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 2

I.1. INTERFERON . 2

I.1.1. Các dạng Interferon . 2

I.1.2. Cơchếhoạt ñộng của Interferon . 4

I.1.3. Các ứng dụng của Interferon . 6

I.1.4. Tình hình nghiên cứu Interferon hiện nay . 8

I.2. HỆTHỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS. 8

I.2.1. Các hệthống biểu hiện Interferon alpha 2b . 8

I.2.2. Ưu nhược ñiểm của hệthống biểu hiện Pichia pastoris. 10

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . 12

II.1. VẬT LIỆU . 12

II.1.1. Dụng cụvà thiết bị. 12

II.1.2. Hóa chất và môi trường . 13

II.1.3. Nguyên vật liệu . 15

II.2. PHƯƠNG PHÁP. 20

II.2.1. Tách chiết DNA người tổng sốbằng Chelex . 20

II.2.2. Phương pháp PCR (dùng ñểkhuếch ñại ñoạn gene mục tiêu và kiểm tra

khuẩn lạc mang gene mục tiêu) . 20

II.2.3. Phương pháp tinh sạch DNA từgel agarose . 21

II.2.4. Phương pháp ñiện biến nạp cho E. coli. 21

II.2.5. Phương pháp cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn . 22

II.2.6. Phương pháp nối DNA bằng enzyme T4 ligase. 22

II.2.7. Phương pháp tách chiết plasmid từtếbàoE. coli. 23

II.2.8. Phương pháp ñiện biến nạp cho Pichia pastoris. 23

II.2.9. Phương pháp lai khuẩn lạc . 24

II.2.10. Phương pháp lên men Pichia pastoris.24

II.2.11. Phương pháp Bradford dùng ñể ño hàm lượng protein . 25

II.2.12. Phương pháp ñiện di SDS-PAGE . 25

II.2.13. Phương pháp Western blot . 27

Trang ii

Chương III KẾT QUẢVÀ BIỆN LUẬN . 28

III.1. TẠO DÒNG ESCHERICHIA COLI MANG GENE MÃ HÓA CHO

INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 28

III.1.1. Tổng hợp gene mã hóa cho Interferon alpha 2b của người . 28

III.1.2. Tạo dòng Escherichia coliDH5αmang vector nhân dòng gene mã hóa

Interferon alpha 2b của người . 30

III.2. TẠO DÒNG PICHIA PASTORISBIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA

2B CỦA NGƯỜI . 34

III.2.1. Tạo dòngEscherichia coli DH5αmang vector biểu hiện Interferon alpha

2b của người . 34

III.2.2. Tạo dòng Pichia pastoriscó khảnăng biểu hiện Interferon alpha 2b của

người . 37

III.3. BIỂU HIỆN INTERFERON ALPHA 2B CỦA NGƯỜI . 38

Chương IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 43

IV.1. Kết luận . 43

IV.2. Kiến nghị. 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO . 44