Luận văn Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VN93-1 và VC1973A bằng kỹ thuật nuôi cấy In Vitro

t¹o vËt liÖu Phôc vô chän dßng chÞu h¹n ë gièng ®Ëu xanh vn93 – 1 vµ vc1973a b»ng kü thuËt nu«i cÊy in vitro Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu Học viên: Bùi Hồng Xuyến LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành Di truyền học Mã số: 60.42.70 Thái Nguyên- 2010 - Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học là Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trò quan trọng thứ ba sau cây đậu tương và lạc (2 loại cây công nghiệp ngắn ngày). 1. ĐẶT VẤN ĐỀ - Cây đậu xanh thuộc nhóm cây trồng chịu hạn trung bình, quả chín không tập trung gây khó khăn cho quá trình thu hoạch. Trong ngành thực phẩm: Cây đậu xanh cung cấp nguồn dinh dưỡng rất lớn cho người và gia súc Trong lĩnh vực y học: Đậu xanh có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù… Trong nông nghiệp: Trồng đậu xanh giúp cải tạo đất. - Chương trình chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta hiện nay không chỉ hướng tới tạo giống có tiềm năng năng suất cao, ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn mà còn phải chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chịu hạn. "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn ở giống đậu xanh VN93 - 1 và VC1973A bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro". 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạọ dòng đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước và xác định sự thay đổi trong hệ gen của các dòng chọn lọc và giống gốc. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát môi trường tạo mô sẹo, môi trường tái sinh cây từ phôi đậu xanh. - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh nghiên cứu ở mức độ mô sẹo. - Chọn dòng biến dị soma ở giai đoạn mô sẹo thông qua các ngưỡng xử lí thổi khô. - Sử dụng kỹ thuật RAPD với các mồi ngẫu nhiên để khuếch đại các phân đoạn ADN của các dòng chọn lọc và giống gốc. - Xác định hệ số sai khác và khoảng cách di truyền của các dòng chọn lọc so với giống gốc. Với 43 tài liệu tham khảo trong nước và nước ngoài, cùng với một số trang web chuyên ngành, luận văn tập trung vào các nội dung sau: 1. Đặc điểm sinh học của cây đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 2. Đánh giá khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị soma bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật 3. Ứng dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) trong phân tích hệ gen của cây trồng TỔNG QUAN TÀI LIỆU VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Hai giống đậu xanh VN93-1, VC1973A do bộ môn hệ thống canh tác của Viện nghiên cứu ngô cung cấp được sử dụng làm nguyên liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Đặc điểm nông học và năng suất của hai giống đậu xanh nghiên cứu 2. Phương pháp nghiên cứu * Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh - Khử trùng hạt - Tạo mô sẹo - Tái sinh cây - Kéo dài chồi đậu xanh - Tạo cây hoàn chỉnh 2.1. Phương pháp nuôi cấy in vitro * Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo - Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô - Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây - Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc - Phương pháp ra cây 2.3. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 2.4. Phuơng pháp sinh học phân tử - Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ lá cây đậu xanh - Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD 2.2. Phương pháp nghiên cứu ngoài đồng ruộng - Các dòng đậu xanh được trồng thành từng lô thí nghiệm riêng. - Chế độ chăm sóc giống nhau ở các dòng và giống gốc. - Theo dõi sự phát triển của các dòng chọn lọc qua các giai đoạn sinh trưởng trong vụ xuân hè. - Quả mỗi dòng được đánh dấu và thu hoạch riêng để gieo trồng vụ tiếp theo. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở HAI GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 3.1.1. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của hai giống đậu xanh - 2 giống đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo với tỷ lệ khá cao từ 86,36% - 95,67%. - Tỷ lệ tái sinh lại thấp hơn rất nhiều, dao động từ 12,54% - 18,32%. - Giống VN 93-1 có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp hơn nhưng tỷ lệ tái sinh lại cao hơn so với giống VC1973A. 3.1.2. Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi các giống đậu xanh 3.1.2.1. Mức độ mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô Bảng 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô (% khối lượng tươi) Hình 3.1. Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô 3.1.2.2. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô 1 tuần nuôi phục hồi Hình 3.2. Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi phục hồi trên môi trường tái sinh 3.1.2.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sống sót sau thổi khô Bảng 3.3. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Hình 3.3. Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô Hình 3. 5. Một số hình ảnh cây tái sinh sau khi xử lý bằng thổi khô (giống VC1973A) A. Sau 2 tuần B. Sau 3 tuần ở môi trường kéo dài chồi C. Sau 7 tuần Hình 3.4. Ảnh mô sẹo khi xử lý bằng thổi khô (giống VC1973A) A. Thổi khô 5 giờ B. Sau 3 ngày cấy tái sinh (thổi khô 5 giờ) A B 3.1.2.4. Kết quả Kết quả chọn dòng mô sẹo đã thu được 160 dòng mô chịu mất nước và 117 cây xanh của hai giống đậu xanh. Trong đó giống VC1973A có 47 dòng cây tái sinh ở ngưỡng thổi khô 5 giờ. Đây là nguồn vật liệu phong phú cho chọn dòng chịu hạn ở cây đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước. 3.1.3. Phân tích mức độ biến động di truyền của một số đặc điểm nông học ở quần thể R0, R1 Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R0, R1 của giống đậu xanh VC1973A * Kết quả phân tích và chọn lọc quần thể R0, R1 của giống nghiên cứu và các dòng đậu xanh được tạo ra từ mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô ở ngưỡng 5 giờ : - Quần thể R0 có mức độ biến đổi về đặc điểm nông học lớn hơn so với quần thể R1 và biến đổi rất lớn so với giống gốc. - Các dòng đậu xanh được tạo ra sau khi xử lý thổi khô đều có khả năng sinh trưởng, phát triển, ra hoa và kết quả, tuy nhiên số lượng hoa và quả chắc ít hơn so với đối chứng. - Dòng 32 và 40 cho số lượng quả/cây là 42, số hạt /quả trung bình là 8, đa số hạt đều là hạt chắc, cao hơn hẳn các chỉ tiêu tương tự ở đối chứng. - Những cây xuất phát từ hạt của dòng số 2 (R1) cho thời gian sinh trưởng rất ngắn (trung bình 60 ngày). Hình 3.7. Một số hình ảnh các dòng cây tái sinh và Quần thể cây VC1973A đối chứng (A. Hoa và quả của D20; B. Các cây thế hệ R1 của các dòng D2, D32, D40; C. D40; D. Quần thể cây VC1973A đối chứng). Hình 3.6. Một số hình ảnh quần thể R0, R1 ngoài đồng ruộng A. Các dòng quần thể R0 ra hoa và kết quả ngoài ruộng B. Quần thể R1 mới gieo A B 3.2. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN HỆ GEN CỦA MỘT SỐ DÒNG ĐẬU XANH CÓ NGUỒN GÔC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƯỚC 3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số Bảng 3.7. Độ tinh sạch và hàm lượng ADN của 6 mẫu đậu xanh 3.2.2 Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 3.2.2.1. Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản Bảng 3.8. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen của các dòng và giống đậu xanh khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên Bảng 3.9. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD của 6 mẫu đậu xanh với 7 mồi 3.2.2.2. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử Bảng 3.10. Hệ số sai khác di truyền của các dòng chọn lọc và giống gốc  Hình 3.16. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống gốc Hình 3.17. Các dòng đậu xanh ưu việt ở R1 3.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA MỘT SỐ DÒNG ƯU VIỆT KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1. Cả hai giống đậu xanh nghiên cứu VN 93-1, VC 1973A đều có khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây. Các dòng mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng kỹ thuật thổi khô đều có khả năng tái sinh cao. 2. Ngưỡng chọn dòng chịu hạn của các giống phụ thuộc vào khả năng chịu mất nước của mô sẹo từng giống. Xác định được đối tượng chọn dòng là giống đậu xanh VC1973A với ngưỡng xử lý thối khô là 5 giờ. Kết quả thu được 160 dòng mô có khả năng chịu mất nước và 117 cây xanh của hai giống đậu xanh phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Trong đó giống VC1973A có 47 dòng cây tái sinh ở ngưỡng thổi khô 5 giờ. 4. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên đã xác định 7/10 mồi cho tính đa hình của các phân đoạn ADN được nhân bản. Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc từ 0,3276- 0,4310, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng D2 và dòng D20. 5. Các dòng chọn lọc (D2, D15, D20, D32, D40) đã có sự thay đổi trong cấu trúc hệ gen so với giống gốc. Khoảng cách di truyền của các dòng chọn lọc so với giống gốc là 39%. 3. Quần thể R0, R1 có mức độ biến động cao ở nhiều tính trạng nông học, đặc biệt là quần thể R0. Ở thế hệ R1 đã chọn được 4 dòng (dòng D2, D15, D20, D40) biểu hiện một số tính trạng tốt như cây thấp, chắc, chín sớm, thời gian sinh trưởng ngắn, nhiều quả và nhiều hạt chắc/quả. Cần tiếp tục theo dõi, phân tích các dòng thu được (đặc biệt là dòng D2, D15, D20 và D40) ở các thế hệ tiếp theo về các đặc điểm nông học, hóa sinh, khả năng chịu hạn... để chọn ra các dòng triển vọng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu xanh theo hướng tăng cường khả năng chịu hạn. 2. Đề nghị