Luận văn Tạo virus cúm A tái tổ hợp mang gene NA của chủng H5N1 Việt Nam bằng kỹ thuật di truyền ngược
MỤC LỤC Trang phụbìa Trang Mục Lục .i Danh mục các chữviết tắt .iv Danh mục các bảng .vii Danh mục các hình.vii Đặt vấn đề.ix 1. Tổng quan tài liệu. 2 1.1 Tình hình dịch tễvirus cúm A. 2 1.2 Đại cương vềvirus cúm A. 5 1.2.1 Phân loại và cách đọc tên . 5 1.2.2 Đặc điểm sinh thái virus cúm A . 6 1.2.3 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A . 6 1.2.4 Đặc điểm vật chất di truyền và chức năng . 7 1.2.5 Kháng nguyên Neuraminidase (NA) . 11 1.2.5.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng . 11 1.2.5.2 Các đột biến quan trọng trên NA . 15 1.2.6 Chu trình sinh sản của virus cúm trong tếbào chủ. 16 1.2.6.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏcủa virus ởtếbào chủ. 16 1.2.6.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus . 17 1.2.6.3 Quá trình đóng gói và nẩy chồi. 18 1.2.7 Đặc điểm di truyền của virus cúm A . 20 1.2.7.1 Đột biến thường xuyên (Antigenic Drift) . 20 1.2.7.2 Tái sắp xếp vật liệu di truyền (Antigenic Shift) . 21 1.3 Kỹthuật di truyền ngược cho virus cúm A . 22 1.3.1 Khái niệm vềkỹthuật di truyền ngược . 22 1.3.2 Sửdụng kỹthuật di truyền ngược đểtạo virus cúm A. 22 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu . 29 2.1 Vật liệu. 29 2.1.1 Hóa chất . 29 2.1.2 Các bộKit sửdụng . 30 2.1.3 Các plasmid . 30 2.1.4 Các dòng tếbào và chủng E.coli. 31 2.1.5 Các thiết bị. 31 2.1.6 Các vật liệu khác. 32 2.2 Phương pháp. 33 2.2.1 Biến nạp các plasmid vào tếbào khảnạp TOP10 . 33 2.2.1.1 Nối DNA mục tiêu vào vector . 33 2.2.1.2 Biến nạp các plasmid vào tếbào E.colikhảnạp TOP10 . 33 2.2.1.3 Phân tích kết quảbiến nạp . 33 2.2.1.4 Tách plasmid mục tiêu từtếbào TOP10 . 34 2.2.1.5 Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn . 35 2.2.2 Định lượng plasmid DNA . 35 2.2.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tếbào . 36 2.2.4 Phương pháp chuẩn độvirus TCID50. 37 2.2.5 Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination test) . 37 2.2.5.1 Chuẩn bịhồng cầu gà. 38 2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết . 38 2.2.6 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) . 39 2.2.6.1 Tách RNA virus . 39 2.2.6.2 Tổng hợp cDNA . 40 2.2.6.3 PCR với các cặp primers đặc hiệu . 40 2.2.6.4 Điện di. 40 2.2.7 Phương pháp giải trình tựDNA . 41 2.2.7.1 Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự. 42 2.2.7.2 PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình tự. 42 2.2.7.3 Xửlý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy CEQTM8000 . 42 3. Kết quảvà bàn luận . 44 3.1 Dòng hóa các gene N1 vào vector plasmid PCR®2.1 . 44 3.1.1 Thu nhận gene N1 từRNA bệnh phẩm . 44 3.1.2 Biến nạp các plasmid PCR® 2.1 chứa gene N1 vào tếbào TOP10 . 45 3.2 Giải trình tựgene N1 của các chủng H5N1 . 47 3.3 Tạo virus cúm A bằng kỹthuật di truyền ngược. 56 3.3.1 Biến nạp plasmid pHW2000 chứa gene N1 vào tếbào TOP10 . 56 3.3.2 Tách plasmid bằng Kit Midi và định lượng plasmid. 60 3.3.3 Chuyển nhiễm các plasmid vào hỗn hợp tếbào . 61 3.3.4 Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) . 65 3.3.5 Giải trình tựgene N1 . 65 4. Kết luận và đềnghị. 68 4.1. Kết luận . 68 4.2. Đềnghị. 69 Các công trình đã công bố. 70 Tài liệu tham khảo . 71 Phụlục. 76
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 7.pdf
- 1_2.pdf
- 2_2.pdf
- 3.pdf
- 4.pdf
- 5_2.pdf
- 6_4.pdf
- 8.pdf
- 9.pdf
- 10_3.pdf
- 11.pdf
- 12.pdf
- 13.pdf
- 14.pdf