Luận văn Theo dõi hàm lượng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá ( Croton tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae

tionary and Mobile phase Liquid <400 bar <400 l 1 ml/min light detector <1000 C Mobile phase Pump Injector Data evaluation Detector Column Oven Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là: Octa -Si-(CH2)7CH3 C8 Octadecyl -Si-(CH2)17CH3 C18 Phenyl -Si-(C6H5)2 C6H5 Cyanopropyl -Si-(CH2)3CN CN Aminopropyl -Si-(CH2)3NH2 NH2 - Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các phân tử chất tan mang điện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồi cột là nhựa trao đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh. - Cột sắc ký gel (size exclusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các lỗ hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của phân tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt qua pha tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn. Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồi cột dùng làm pha tĩnh trong HPLC thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m có dạng hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có đường kính trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm. Một cách lý tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong suốt quá trình phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra khỏi cột cũng phải tương đương với nhiệt độ của đầu dò. Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ thuộc vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng dòng. Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm và trong trường hợp không có tương tác với pha tĩnh thì nó sẽ ra khỏi cột với tốc độ bằng tốc độ của pha động. “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỷ lệ dung môi đã sử dụng. Pha động càng “mạnh” thì mẫu sẽ được rửa giải càng sớm. Với cột pha thường, do bề mặt phân cực nên độ mạnh của pha động đồng nghĩa với độ phân cực của dung môi. Độ mạnh của dung môi theo thứ tự tăng dần của độ phân cực trình bày như sau: Hexane = heptane = pentane < cyclo hexane < chloroform < toluen < dichloro methane < ethylacetate = THF < diethylete < acetone = acetonitrile < ethanol < H2O <acetic acid. Trong sắc ký lỏng pha ngược bề mặt của vật liệu nhồi cột không phân cực và nước hoặc dung dịch nước có thể dùng làm pha động. Độ mạnh của pha động tăng dần khi độ phân cực của dung môi giảm dần (nghĩa là trật tự ngược với trường hợp pha thường). Pha động yếu nhất là nước sạch, acetonitryle hoặc THF là các pha động rất mạnh. Detector UV-VIS là loại detector hay được dùng vì nó có khả năng ứng dụng rộng rãi và giá thành rẻ hơn các loại detector khác, nó có độ nhạy trung bình, tín hiệu không ảnh hưởng bởi nhiệt độ và áp suất. Tuy nhiên, detector UV-VIS chỉ sử dụng được khi mẫu có hấp thụ ánh sáng trong vùng 200 - 700nm. Detector chỉ số khúc xạ (RID) là một loại detector phổ thông, dựa trên khả năng phân biệt sự thay đổi chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cảm với nhiệt độ và áp suất cũng như khí bị hoà tan trong pha động, nên độ nhạy phân tích không cao. Ngoài hai loại detector trên người ta còn sử dụng detector huỳnh quang, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 detector điện hoá, detector độ dẫn ... trong sắc ký lỏng cao áp. 1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Mẫu được bơm tự động qua cột LC (pha lệch) dưới áp cao và dung môi rửa giải thích hợp. Sau đó các thành phần tách qua cột được phát hiện bằng đầu dò detector UV. Từng thành phần được đưa thứ tự vào buồng ion hóa (ESI – Electron Spray Ionization). Các ion tạo thành qua bộ phận phân tích đến Detector, các tín hiệu được chuyển qua dạng tín hiệu điện từ, qua bộ phận lọc và khuyếch đại cho các phổ khối lượng của từng phần. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thuộc loại thực vật đặc hữu của Việt Nam là cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh phổ biến, những hiểu biết về thành phần hóa học và dược lý của cây cho biết có tác dụng chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực [10]. Nhiệm vụ của bản luận văn này là chiết xuất phân lập một số ent - kauran ditecpen của cây Khổ sâm cho lá và theo dõi sự biến đổi hàm lượng ent -kauran ditecpenoit chính ở một số thời gian sinh trưởng của cây trong năm. 2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là mẫu cành và lá khô. Mẫu cành, lá tươi được thu theo các tháng 1,3,4,5/2008 tại Tân Yên, Bắc Giang và các mẫu thu ở các vùng Sóc Sơn, Ninh Bình, Phú Thọ, Hưng Yên. Các mẫu nói trên đã được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) giám định là đồng nhất về mặt thực vật và định danh là Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae. Ảnh 2.1: Hoa và quả cây Khổ sâm Ảnh 2.2: Lá và quả cây Khổ sâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Mẫu cây tươi lấy về được sấy ngay ở 110 C trong 10 phút để diệt men, sau đó hong khô ở nơi thoáng mát, hoặc sấy ở nhiệt độ 50-60 C cho tới khi khô giòn. Mẫu khô đem nghiền nhỏ, cho vào bình ngâm chiết với cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Các dịch chiết được cất kiệt dung môi ở áp suất giảm để nguội, rồi đem cân. Việc phân lập các chất ra khỏi hỗn hợp của chúng được kết hợp những phương pháp khác nhauV: dùng dung môi có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần như nhau làm cho hỗn hợp ban đầu đơn giản hơn, sau đó dùng cách kết tinh phân đoạn hoặc tách trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế v.v...để được chất tinh khiết. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm. 2.1.2. Phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất từ dịch chiết. Để theo dõi sự biến động thành phần hoá học của cây C.tonkinensis thu ở các thời điểm khác nhau đã dùng phương pháp bán định lượng bằng cách cân trực tiếp các chất phân lập được từ khối lượng ngâm chiết. Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng như phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký như: - Sắc ký lớp mỏng (TLC) - Sắc ký cột thường - Sắc ký lỏng áp suất cao 2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc hoá học các chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, R f, điểm nóng chảy, v.v.. khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Đối với những chất rắn có dạng tinh thể rõ ràng, có thể dùng để ghi phổ nhiễu xạ tia X, nhờ đó biết được các thông số về cấu trúc của phân tử đem nghiên cứu. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ, hoá chất Các dung môi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thước khác nhau đã dùng loại silicagel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hoá ở nhiệt độ 120 C thời gian từ 1, 5 giờ đến 2 giờ. Sắc ký lớp mỏng đế nhôm tráng sẵn Kieselgel 60F254 độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Các hệ dung môi triển khai SKLM: 1. n-Hexan - EtOAc (8 : 1) hệ A 2. n-Hexan - EtOAc (4 : 1) hệ B 3. n-Hexan - EtOAc (2 : 1) hệ C 4. Cloroform - metanol (9 : 1) hệ D Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) được soi dưới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử Vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 o C để phát hiện các hợp chất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0, 040 đến 0,063 mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boởtus hoặc trên máy Electrothermal IA -9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), dạng viên nén KBr. - Phổ khối ghi trên máy MS -Engine-5989-HP (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE /WILLEY 250L. - Phổ 1 H và 13 C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE VARIAN -400MHz, Varian Unity 600 chuẩn nội TMS, dung môi CDCl3, DMSO-d6. - Phổ nhiễu xạ tia X trên máy Mac Science MX C18 2.3. Thu nhận các dịch chiết từ cây C. tonkinensis Mẫu cây tươi mới thu hái được phân loại riêng lá, thân, cành. Mẫu sấy khô đem nghiền nhỏ rồi ngâm kiệt với Cloroform ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhạt màu. Dịch chiết Cloroform được cất loại dung môi ở áp suất giảm. Việc thu nhận các chiết phẩm từ mẫu nghiên cứu được tóm tắt trong sơ đồ 2.1 ngâm chiết mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Sơ đồ 2.1: Chiết tách, phân lập các ent -kauran từ cây khổ sâm Các dịch ngâm chiết nói trên được làm khô bằng Na2SO4 , lọc rồi cất kiệt dung môi ở áp suất giảm, cặn được sấy khô và cân. Như vậy từ mỗi bộ phận của cây sẽ có 2 loại chiết phẩm được ký hiệu là: F1 và F2. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho lá ở Tân Yên, Bắc Giang được nêu trong bảng 2.1 và 2.2. Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết lá cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 F2 Tháng 1/08 Lá 240 16.4 12.1 Tháng 3/08 Lá 200 19.7 15.8 Tháng 4/08 Lá 200 25.9 12.9 1.ChiÕt CHCl3 2.Gép, cÊt lo¹i dung m«i 1. ChiÕt MeOH 2. CÊt lo¹i dung m«i Nguyªn liÖu kh« nghiÒn nhá CÆn chiÕt CHCl3 (F1) B· CÆn chiÕt MeOH (F2) B· Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Tháng 5/08 Lá 133 13.3 9.5 Bảng 2.2: Khối lƣợng cặn chiết cành cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Tân Yên - Bắc Giang. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 F2 Tháng 1/08 Cành 200 6.0 9.4 Tháng 3/08 Cành 200 6.4 4.3 Tháng 4/08 Cành 200 8.3 5.2 Tháng 5/08 Cành 180 9.7 7.7 Bảng 2.3: Khối lƣợng cặn chiết cành và lá cây C.tonkinensis thu theo các thời điểm khác nhau tại Sóc Sơn -Hà Nội. Thời gian thu hái Bộ phận Khối lượng (g) Khối lượng cặn chiết (g) F1 Tháng 4/07 Lá 200 16,1 Cành 200 16,3 Tháng 5/07 Lá 200 23,4 Cành 200 17,1 Tháng 11/07 Lá 200 18,1 Cành 200 15,2 2.4. Phân lập và tinh chế các chất. 2.4.1.Các dịch chiết CHCl3 của cây Khổ sâm thu vào tháng 1/2008 2.4.1.1.Các dịch chiết CHCl3 của lá cây Khổ sâm (dịch chiết F1L1) Lấy 16, 4g cặn CHCl3 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. Rửa giải cột bằng hệ dung môi nR -hexan-etyl axetat (15:1) và (10:1) đã thu được khối ch?t r? n kết tinh hình kim, không màu. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được khối kết tinh hình kim. Hỗn hợp này đem tách lại trên cột silicagel loại nhỏ, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (5:1); (3:1) và (1:1) đã thu được các chất ký hiệu D1 (Crotonkin-1) và D2 (Crotonkin-3). Kết tinh lại trong axeton cho khối chất rắn vô định hình và một số tinh thể hình kim. 2.4.1.1.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxy-16-kauren-15-on (Crotonkin-1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan - etyl axetat (4:1), thu được chất kết tinh hình kim, Rf B=28, nóng chảy ở 142-143 C, Rt =23.9. Phổ FT -IR max (cm -1 ): 3482, 2933, 1744, 1717, 1642, 1466, 1253, 1043. Phổ khối EI -MS m/z (%): 360 [M] + (13); 342 [M-H2O] + (7); 332 (25); 269 (9); 225 (4); 161 (9); 135 (24); 107 (48); 91 (77); 79 (100); 55(75). Phổ 1 H-NMR (400 MHz, CDCl3); (ppm): 5,94 (1H, t, J 1,0Hz, H- 17B); 5,257(1H, t, J 1,0 Hz, H-17A); 4,00 (1H, dd, J 4,5Hz, 11,7Hz, H-7 ); 3,84 (1H, d, J 11,1 Hz, HB-18); 3,62 (1H, d, J 11,1Hz, HA-18); 3,08 (1H, m, H-13); 2,03 (1H, d, J 2,3Hz, H-14); 1,955 (1H, tdd, J 2,7Hz, 6,2Hz, 13,2Hz, H-12); 1,74 (1H, ddd, J 3,2Hz, 3,1Hz, 12,8Hz, H-1 ); 1,67 (1H, ddd, J 1,9Hz, 4,7Hz, 11,8Hz, H-6 ); 1,411 (1H, q, J 12,0Hz, H-6 ); 1,36 (1H, d, J 4,3Hz, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 H-3 ; 1,25 (1H, dd, J 1,6Hz, 12,3Hz, H-5); 0,82 (3H, s, CH3-19), 1,11 (3H, s, CH3-20); 1,19 (1H, d, J 8,5Hz, H-9); 0,71 (1H, td, J 0,9Hz, 3,8Hz, 12,9Hz, H- 1 ). 13 C-NMR (100 MHz, CDCl3); (ppm): 209,8 (s, C-15); 171,2 (s, OCOCH3); 149,1 (s, C-16); 114,9 (t, C-17); 72,2 (t, C-18); 70,7 (d, C-7); 58,3 (s, C-8); 51,7 (d, C-9); 46,2 (d, C-5); 39,6 (s, C-10); 38,8 (t, C-1); 37,5 (d, C- 13); 36,4 (s, C-4); 35,4 (t, C-3); 32,8 (t, C-12); 27,8 (t, C-14); 27,6 (t, C-6); 21,0 (q, CH3CO); 18,1 (q, C-20); 17,9 (t, C-11); 17,5 (q, C-19); 17,5 (t, C-2). Phổ X -Ray của Crotonkin-1: 2.4.1.1.2. Ent-1 -axetoxy-7 ,14 -dihydroxy-16-kauren-15-on (Crotonkin- 2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (4:1) đã thu được chất kết tinh hình kim, RfC=70, nóng chảy ở 97-98 C, Rt=21.6 . Phổ FT -IR (KBr) max (cm -1 ): 3272, 1727, 1651, 1464, 1373, 1243, 1178, 1154, 1118, 1095, 1028, 994, 961. Phổ khối EI -MS m/z(%):377[M+H] + (0.02), 358(0.2), 316[M- CH3COOH] + (4), 299 (4), 298 (10), 284 (2), 283 (9), 255 (1), 245 (2), 229 (3), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 227 (4), 145 (2), 121 (4), 117 (5), 107 (11), 105 (17), 79 (13), 69 (14), 55 (26), 43 (100). Phổ HREI -MS m/z (%): 376,2248 [M] + tính theo công thức C22H32O5 376,2250. Phổ 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) (ppm): 6,04 (d, 1H, J 4,9, OH); 6,16 (s, 1H, OH); 5,92 (s, 1H); 5,38 (s, 1H); 4,73 (s, 1H); 4,68 (m, 1H); 4,00 (td, 1H, J 4,9, 12,4 Hz); 1,38 (dt, J 4,1, 14,0 Hz); 2,91 (s, 1H); 1,84 (m, 1H); 1,51 (d, 1H, J 8,8Hz); 1,28 (dd, J 5,8, 16,4 Hz); 1,24 (dd, J 1,7; 12,4Hz); 0,90 (s, CH3); 0,83 (s, CH3); 1,06 (s, CH3). Phổ 13 C-NMR (150MHz, DMSO) (ppm): 207,1 (s, C=O); 169,7 (s, COCH3); 148,3 (s); 116,8 (t); 72,9 (d); 72,3 (d); 46,8 (d); 46,3 (d); 60,0 (s); 74,4 9d); 45,7 (d); 42,1 (s); 34,7 (t); 32,6 (s); 33,1 (q); 30,6 (t); 28,6 (t); 22,3 (t); 21,3 (q); 21,0 (q); 18,0 (q); 16,5 (t). Phổ X -Ray của Crotonkin-2: 2.4.1.1.3. Ent-(16S)-7 -hydroxy-18-axetoxy-kauran-15-on (Crotonkin-3) Tiếp tục rửa giải cột bằng hỗn hợp hexan -etylaxetat (3:1) đã thu được chất kết tinh, không màu, không mùi, Rf C= 63, nóng chảy ở 177-179 C, Rt = 22.4 . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Phổ FT -IR max (cm -1 ): 3489, 2934, 2868, 1732, 1707, 1461, 1380, 1291, 1253, 1056, 934. Phổ EI -MS m/z (%):362[M] + (2); 344 [M-18] + (7); 304 (21); 284 (15); 271 (11); 152 (34); 123 (70); 109 (100); 95 (53); 81 (83); 67 (75); 55 (89). Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3) (ppm): 3,90 (1H, dd, J 3,9, 11,6); 3,86 (1H, d, J 11,1), 3,64 (1H, d, J 11,1); 2,25 (1H, q, J 7,0 Hz); 2,07 (3H s,); 1,98 (1H, dd, J 4,2, 10,0 Hz); 1,78 (1H, td, J 13,0, 3,5Hz)); 1,65m; 1,50m; 1,46m; 1,26 (1H, dd, J 3,9, 13,4); 1,28 (1H, d, J 13,2); 1,10 (3H, d, J 7,1q); 1,12 (3H s,); 0,83 (3H s,). Phổ 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) (ppm): 223,9 (s); 171,3 (s); 72,3 (t); 71,3 (d); 58,4 (s); 51,8(d); 48,4 (d); 46,5 (d); 39,3 (s); 38,7 (t); 36,4 (s); 35,8 (t); 34, 5 (d); 28,5 (t); 28,4 (t); 25,3 (t); 21,1 (q); 18,3 (q); 17,9 (t); 17,6 (t); 17,5 (q); 10,0 (q). Phổ X -Ray của Crotonkin-3: 2.4.1.2. Các dịch chiết CHCl3 của cành cây Khổ sâm (F1C1) Làm tương tự như mục 2.4.1.1 từ 6.0g cặn F1C1 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 khoảng cách nhỏ (5 10ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi. Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi nT -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được chất kết tinh hình kim nhỏ: CT4 (crotonkin-4), chất D1 (Crotonkin- 1). Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (3:1) đã thu được chất kết tinh Crotonkin -3 ở dạng hình kim. 2.4.2. Các dịch chiết CHCl3 của lá cây Khổ sâm thu vào tháng 3/2008 Cũng tương tự như trên lấy 19.7g cặn F1L3 đem tách trên cột silicagel, rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat (20:1); (15:1); (10:1); (5:1); (3:1) và (1:1). Khi rửa giải cột bằng hệ dung môi n -hexan-etyl axetat (5:1) đã thu được hỗn hợp khối kết tinh vô định hình. Sau đó đem tách trên cột silicagel loại nhỏ, rồi rửa giải cột bằng hệ dung môi hexan -etyl axetat bắt đầu từ (10:1); (5:1); (3:1) thu được Crotonkin -5, Crotonkin-1, Crotonkin-2, Crotonkin-3, . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thực nghiệm và các kết quả đạt đƣợc Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen từ cây Khổ sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on. Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 3.1), cấu trúc hoá học và một vài đặc tính vật lý của chúng (bảng 3.2). Bảng 3.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep., Thứ tự Tên chất CTPT Tên khoa học Thời gian công bố Tài liệu 1 Crotonkin-1 C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 - hydroxykaur-16-en-15- on 25/10/1999 13/2/2003 14,16 2 Crotonkin-2 C22H32O5 ent-1a-axetoxy-7 ,14a- dihydroxykaur-16-en- 15-on 10/11/2002 28/3/2003 15,18 3 Crotonkin-3 C22H34O4 ent-16(S)-18-axetoxy- 7 -hydroxykaur-15-on 13/02/2003 01/3/2004 16,20 4 Crotonkin-4 C20H30O3 ent-7 ,14a- dihydroxykaur-16-en- 15-on 9/7/1998 28/3/2003 17,18 5 Crotonkin-5 C22H32O5 ent-18a-axetoxy- 7a,14 -dihydroxykaur- 16-en-15-on 28/03/2003 18 6 Crotonkin-6 C20H30O3 ent-7 ,18- dihydroxykaur-16-en- 15-on 09/9/2003 19 7 Crotonkin-7 C24H34O6 ent-1a,14a-diacetoxy- 7 -hydroxykaur-16-en- 01/03/2004 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 R5 O R4 R1 R2-H2C R3 15-on 8 Crotonkin-8 C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy- 14a -hydroxykaur-16- en-15-on 01/03/2004 20 9 Crotonkin-9 C22H32O4 ent-18-axetoxy-14a- hydroxykaur-16-en-15- on 01/03/2004 20 10 Crotonkin-10 C22H32O5 ent-11a -axetoxy- 7 ,14a-dihydroxykaur- 16-en-15-on Chem. Pharm.Bull . 2002,50, 808-813. 29/12/2004 . 21,24 11 Crotonkin-11 C20H28O3 ent-kaur-16-en-15-on- 18-oic acid Phytochem. 1973, 12, 2712-2723. 29/12/2004 . 22,24 12 Crotonkin-12 C20H32O ent-18- hydroxykaur- 16-en Phytochem. 1988, 27, 3209-3212. 29/12/2004 23,24 13 Crotonkin-13 C26H36O7 ent-1a,7 ,14a- triacetoxykaur-16-en- 15-on 2007 13,15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Bảng 3.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các crotonkin từ cây Croton tonkinensis Gagnep., Th ứ tự R1 R2 R3 R4 R5 M mp( o C) Rt (phút) 1 H OAc OH H =CH2 360 142-143 23.9 2 OAc H OH OH =CH2 376 97-98 21.6 3 H OAc H OH CH3 362 177-179 22.43 4 H H OH OH =CH2 318 210-212 22.63 5 H OAc OH OH =CH2 376 21.39 6 H OH OH H =CH2 318 155-156 7 OAc H OH OAc =CH2 418 22.64 8 OAc H OAc OH =CH2 418 23.01 9 H OAc H OH =CH2 360 10 11-OAc H OH OH =CH2 376 11 H COOH H H =CH2 316 12 H OH H H =CH2 288 13 OAc H OAc OAc =CH2 460 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 3.2. Chiết tách, phân lập các hoạt chất chính ent -kauran từ cây Khổ sâm. Với nhiệm vụ phân lập một số ent -kauran là thành phần chính của cây Khổ sâm và dịch chiết của lá, cành. Mẫu cây đem phân loại riêng cành và lá. Nguyên liệu đã xấy khô, nghiền nhỏ và được ngâm chiết theo sơ đồ 2.1. Từ mẫu cây thu vào tháng 1/2008 tại Tân Yên Bắc Giang đã phân lập được một số hợp chất sau: 3.2.1. Ent-7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-1) Từ lá và cành cây này chúng đã thu được chất crotonkin -1 [4]. Hiện màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím đỏ, với thuốc thử Dragendorf cho màu vàng cam xỉn, sau đó chuyển sang màu nâu, dưới ánh sáng tử ngoại (254 nm) không cho huỳnh quang. Khi kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 142 0 -143 0 C. Việc so sánh đối chiếu các dẫn liệu phổ FT -IR ,MS, 1 H- và 13 C-NMR đưa ra cấu trúc ent -7 -hydroxy-18-axetoxykaur-16-en-15-on (crotonkin-1) hoàn toàn phù hợp với [4] . Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.1. Phối cảnh không gian của crotonkin -1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 3.2.2. Ent-1a-axetoxy-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2) Chất này được phân lập từ bộ phận cành và lá. ent -kauran này dễ tan trong các dung môi hữu cơ, ít tan trong ete dầu hoả, cho phản ứng màu da cam tươi với thuốc thử Dragendorff, màu tím đen với thuốc thử vanilin - H2SO4 5%. Kết tinh lại trong axeton cho khối chất rắn vô định hình nóng chảy ở 107-108 0 C và một số tinh thể hình kim nóng chảy ở 97-98 0 C. Kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -n-hexan cho tinh thể hình kim, nóng chảy ở 97- 98 0 C. So sánh các đặc trưng vật lý với chất chuẩn và các dữ liệu phổ FT -IR ,MS, 1 H- và 13 C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -1a-axetoxy- 7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-2). Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X rõ ràng và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.2. Phối cảnh không gian của crotonkin -2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 3.2.3. Ent-16(S)-18-axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3) ent-kauran ditecpen này được phân lập từ cành cây C.tonkinensis. Crotonkin-3 hiện màu trên SKLM với thuốc thử vanilin -H2SO4 cho màu tím đỏ, không cho huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại (254 nm) và cũng không có phản ứng màu với thuốc thử Dragendorff. Kết tinh lại trong hỗn hợp etylaxetat -hexan cho những tinh thể hình kim, nóng chảy ở 177C-179 0 C. Các đặc trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ thu được FT -IR, MS, 1 H- và 13 C-NMR hoàn toàn phù hợp với cấu trúc ent -16(S)-18- axetoxy-7 -hydroxykaur-15-on (Crotonkin-3). Những tinh thể hình kim của chất này cho phổ nhiễu xạ tia X và phối cảnh không gian của nó nêu trong hình 3.3. Phối cảnh không gian của Crotonkin -3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 3.2.4. Ent-7 ,14a-dihydroxykaur-16-en-15-on(Crotonkin-4) Từ lá cây C. tonkinensis đã phân lập được chất Crotonkin -4. Các đặc trưng vật lý như giá trị Rf, điểm nóng chảy ở 210-212 o C các phép ghi phổ thu được so với các dữ liệu phổ chuẩn [16], [17] cho phép xác định là ent -7 ,14 a -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-4). 3.2.5. Ent-18a-axetoxy-7a,14 -dihydroxykaur-16-en-15-on (Crotonkin-5) Từ cành khổ sâm thu vào tháng 3 đã phân lập được Crotonkin -5. Những số liệu phân tích lá và cành cây khổ sâm trên máy LC -MS cho biết, trong lá thường có các ent -kauran chủ yếu là crotonkin -1, -2, -7, và -8, ở trong cành cũng có các thành phần tương tự, riêng crotonkin -3 thường trội hơn, còn crotonkin -7 và -8 lại thấp hơn rất nhiều. Sau khi xử lý khối lượng lá và cành nói trên đã thu được các ent -kauran như sau: Tên chất Khối lƣợng Tên chất Khối lƣợng Crotonkin-1 30mg Crotonkin-4 20mg Crotonkin-2 18mg Crotonkin-5 10mg Crotonkin-3 15mg Crotonkin-7 và -8 7,8mg Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng một số thành phần chính của hỗn hợp ent -kauran. Số liệu phân tích định tính các dịch chiết từ cây Khổ sâm cho biết các ent -kauran trong lá và cành của Croton tonkinensis thường có chứa 3-4 thành phần chính, tuỳ thuộc vào bộ phận dùng (lá, cành), thời điểm thu hái và nơi sinh trưởng. Để có thể xác định mộ