Luận văn Thiết kế và nghiên cứu hệ thống Bioreactor cho cây Dứa Cayenne

hưng chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân…). Ảnh hƣởng của nguồn carbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine. 28 Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Ảnh hƣởng của than hoạt tính Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường để hấp thụ các chất độc ( dạng phenol) do cây tiết ra. Ảnh hƣởng của độ pH và Agar pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Ảnh hƣởng của các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995). Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 2.7.Tổng quan về bioreactor Hệ thống bioreactor được thiết kế vớí mục đích cải thiện và nâng cao hiệu quả cũng như năng suất của quá trình vi nhân giống. Mô hình bioreactor được thiết kế theo dạng fermentor trong nuôi cấy vi sinh vật, tùy vào đối tượng cây mà có nhiều kiểu 29 bioreactor khác nhau nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mô hay cơ quan trong môi trường lỏng có hệ thống làm thoáng khí. Tế bào thực vật khác với tế bào nấm men. Nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không xảy ra sự sinh trưởng đồng thời giống như nấm men. Tuy nhiên bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thì việc nhân sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hóa trong môi trường lỏng thì tỏ ra hiệu quả(Gamborg, 1966; Gamborg, et al, 1968; Gamborg and Shyluk, 1970). Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được thực hiện đầu tiên vào năm 1981 do Takayama thực hiện trên đối tượng cây Begonia (Takayama và Miasawa,1981). Hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loại thực vật khác(Takayama,1991). Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ ( từ 4-10l) trong khoảng 1-2 tháng có thể tạo ra đến 4000-20.000 cây con. Điều này cho thấy một triển vọng lớn trong việc áp dụng bioreactor thương mại đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật(Takayama,1991). Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng nhất và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật(Nhut et al,2004) 1. Cửa nạp nguyên liệu 2. Ống dẫn khí vào 3. Hệ thống sục khí 4. Ống dẫn nướ c 5. Ống thoát nướ c 6. Motor 7. Đai bả o v ệ 8. Thanh truyền độ n g 9. Cánh quạt 10. Bộ phận cảm biến 11. Vách ngăn 12. Lớp giữ nhiệt 13. Cửa rút nguyên liệu Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor 30 Thuận lợi của nuôi cấy bằng bioreactor Theo Takayama và Akita (1994) thì một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là: - Sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường. - Không có sự hạn chế về trao đổi khí. - Có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường. - Tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền. - Dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối. - Dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. - Tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng hơn nếu được tăng cường không khí. - Mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh. - Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn. Khó khăn của nuôi cấy bằng bioreactor Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định. Chẳng hạn như (Ziv, 2000): - Tuỳ vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau. - Thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như: hiện tượng thuỷ tinh thể (vitrification), hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào. Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật. Nấm, vi khuẩn, nấm mốc và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán 31 rắn). Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 2000). Phân loại bioreactor Bioreactor khuấy thoáng khí (Aeration-agitation bioreactor) Kiểu bioreactor này thường được đề cập dưới dạng những bình phản ứng khuấy trộn (stirred tank bioreactors – STRs) có cánh khuấy chẳng hạn như: tua-bin, chân vịt, mái chèo hay ruy-băng xoắn ốc. Mặc dù STRs có ý nghĩa trong nuôi cấy tạo huyền phù nhưng nó cũng gây ra những lực khuấy mạnh. Tuy nhiên, gần đây STRs đã được cải tiến nhằm khắc phục các bất lợi trên. Kiểu cánh khuấy ruy-băng xoắn ốc được xem là có hiệu quả đối với nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật có mật độ cao và nuôi cấy tạo phôi soma (Archambault et al., 1994). Nói chung thì bioreactor dạng này thường được sử dụng trong nuôi cấy tạo phôi. Nhưng hiện nay vẫn còn quá ít các nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa các kiểu bioreactor khác nhau.  Bioreactor hình trống quay (Rotating drum bioreactor) Kiểu bioreactor này gồm có một bình chứa có dạng hình trống được gắn trên một trục quay, trục này có nhiệm vụ nâng đỡ và quay bình chứa. Bình được quay với tốc độ khoảng 2 – 6 vòng/phút nhằm hạn chế tối đa lực xé làm tổn thương tế bào. Một bình phản ứng không có tấm ngăn cách có thể được sử dụng trong nuôi cấy tạo cây con thông qua quá trình tạo chồi và tạo phôi (Takayama và Akita, 1994).  Bioreactor màng lọc xoay (Spin filter bioreactor) Kiểu bioreactor này có một màng lọc xoay có nhiệm vụ hòa trộn huyền phù nuôi cấy và đồng thời lấy đi môi trường đã sử dụng và bổ sung môi trường mới vào. Các màng lọc quay khuấy trộn môi trường không làm xé rách màng tế bào chính là nhờ vào việc tạo ra được những đường khuấy mỏng. Để có thể duy trì được lâu sự tăng trưởng liên tục của mô sẹo và sự phát triển của phôi đạt được sự nhân nhanh, người ta đã thiết kế một bioreactor có hai màng lọc cùng quay. Một chiến lược nhằm nuôi cấy hiệu quả hơn đó là trong giai đoạn tăng sinh tế bào, người ta tiến hành nuôi cấy liên tục. Nhằm tạo sự đồng nhất, ổn định điều kiện nuôi cấy cho các tế bào và duy trì được 32 nhóm tế bào đang tăng trưởng phù hợp cho sự phát triển tạo phôi bất cứ lúc nào. Giai đoạn thứ hai của bioreactor là tạo phôi theo chu kỳ. Sự phát triển của phôi có thể được điều khiển thông qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí. Việc tạo ra các cây con thông qua con đường tạo phôi soma được nhận thấy là thích hợp nhất đối với quá trình nhân sinh khối bằng cách sử dụng bioreactor màng lọc xoay (Honda et al., 2001). Bioreactor có khuấy và không khuấy bằng nén khí (Pneumatically agitated and non-agitated bioreactor) Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có nhiệm vụ là khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột). Trong một số trường hợp, bình nuôi cấy có thể gắn thêm các ống thông (đối với bioreactor air-lift). Bioreactor air-lift Kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dòng xoáy-STRs (nhưng ở đây thì không có cánh khuấy). Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đó là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào, nhờ những dòng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên. Sự hòa trộn dòng khí vào trong pha lỏng trở nên có hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường. Để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn thì dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm. Thường sử dụng màng ceramic. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao (Paek và Debasis, 2003) Bioreactor sục khí dạng đơn giản và bioreactor sủi bọt khí dạng hình cột (Simple aeration bioreactor and bubble column bioreactor) Cũng giống như bioreactor air-lift, bioreactor sủi bọt hình cột cũng tạo ra ít sự cọ sát. Điểm khác biệt chủ yếu giữa bioreactor air-lift và bioreactor sủi bọt hình cột là hệ thống tuần hoàn và chế độ thủy động lực học. Loại bioreactor này thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau thông qua quá trình nuôi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành nhiều phần và 33 cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khối (Buitelaar et al., 1991). Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột là: a) có bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào có khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuôi cấy (trong bọt). Số lượng tế bào bên trong bình biểu thị tổng sinh khối của tế bào. Hiện tượng nổi bọt và tăng trưởng trên thành bình là do đường kính của bình và nắp bình có cùng kích thước. Vấn đề này đã được giải quyết bằng cách cải tiến bình nuôi cấy như miệng bình có đường kính lớn hơn, hay bình có kiểu dạng cầu (Paek et al., 2001). Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này có hình cầu và có nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình có một khóa hình chữ Y hoặc chữ T có nhiệm vụ châm thêm môi trường và là cổng thu sản phẩm. Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm. Ngoài ra, trên nắp bình còn có gắn thêm các thiết bị đo pH, oxy hòa tan. Những bioreactor dạng này được sử dụng trong vi nhân giống tạo phôi soma (Son et al., 1999; Kim, 1999; Lian, 2001; Paek et al., 2001). Bioreactor thổi khí trên bề mặt (Overlay aeration bioreactor) Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đôi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hòa tan khá thấp (nhỏ hơn 1). Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành công lắm trong nuôi cấy mô (Ishibashi et al., 1987). Bioreactor ngập chìm gián đoạn tự động (Automated temporary immmersion bioreactor) Hệ thống ngập chìm tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995). Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một bình dùng cho sự tăng trưởng của thực vật, một bình dùng để chứa môi trường lỏng. Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh. Không khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy môi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai, làm ngập chìm hoàn toàn mẫu thực vật. Sau đó thì khí sẽ rút khỏi bình chứa môi trường, làm cho môi trường ở bình nuôi cấy hạ xuống. Trong mỗi trường hợp như vậy thì không khí được thổi qua một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,2 mm. Một thiết bị điều khiển có thể hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho một chu 34 trình dâng lên và hạ xuống. Có một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đóng mở này. Hệ thống bioreactor này đã được báo cáo là nuôi cấy thành công trên một số cây như: cây lê (Damiano et al., 2000), cây dứa (Esscalo et al., 1999) và cây coffea arabica (Etienne et al., 1999). 2.8. Giới thiệu các phƣơng pháp nhân chồi cây dứa  Hệ thống nuôi cấy in vitro bán rắn Là hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng giá thể chứa chất dinh dưỡng để giữ cho cây đứng vững đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho cây. Khái niệm về giá thể Giá thể là một loại hay một hỗn hợp vật liệu được sử dụng làm vật nâng đỡ, là chỗ cho rễ bám vào trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển. Vật liệu làm giá thể phải chắc chắn và ổn định trong các điều kiện khác nhau, chịu được hấp vô trùng mà không bị biến tính, trơ với các chất trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, vật làm giá thể phải sạch và không được chứa các chất lạ do thành phần của môi trường dinh dưỡng là xác định và cần kiểm soát được trong từng trường hợp nuôi cấy. Chất tạo đông thông dụng nhất là agar, nhưng theo thời gian, nhiều loại giá thể khác được phát triển với những tính năng ưu việt hơn như rockwool, oasis, v.v. Agar Agar là một polysaccharide chiết xuất từ rong biển. Agar được sử dụng như một tác nhân tạo đông trong hầu hết các môi trường nuôi cấy mô in vitro. Agar là loại giá thể sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm. Alginate Giá thể này có đặc tính tương tự như agar nhưng có nồng độ ion calcium cao hơn. Phytagel Được tổng hợp từ glucuronic acid, glucose và rhamnose. Môi trường tạo ra từ loại gel này rất sạch, độ bền cao, trong suốt nên dễ phát hiện ra hiện tượng nhiễm vi sinh vật. Agargel 35 Là hỗn hợp của agar và phytagel. Ưu điểm của giá thể này là có tác dụng giảm được hiện tượng thủy tinh thể (mọng nước) trong nuôi cấy in vitro. Hơn nữa, loại gel này cũng có độ trong cao nên dễ dàng phát hiện vi sinh vật nhiễm trong môi trường. Transfergel Được sử dụng làm đông môi trường nuôi cấy chồi mầm, chồi đỉnh, phôi soma. Các chất tạo gel khác như bacto agar, gellam gum, v.v, có tác dụng tương tự như agar nhưng giá thành cao hơn do có độ tinh khiết cao hơn và có nhiều công dụng hỗ trợ khác cho nuôi cấy mô. Tuy vậy, nuôi cấy mô trên môi trường bán rắn vẫn bộc lộ nhiều khiếm khuyết: - Chất tạo gel biến môi trường dinh dưỡng thành một hệ kín, hạn chế khả năng di chuyển của các thành phần dinh dưỡng, do đó mẫu cấy chỉ hấp thụ được một phần dinh dưỡng ở vị trí gần nó nhất. Hơn nữa, những chất độc do chính thực vật tiết ra bị tích lũy xung quanh mẫu cấy và ức chế trở lại sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (thường gặp nhất là hiện tượng tích tụ phenol gây chết mẫu). - Chất dinh dưỡng được bổ sung cùng với agar trước khi hấp, kết quả là các cấu tử dinh dưỡng phân bố đều khắp các lỗ, trong khi mô cấy chỉ sử dụng được một lượng nhỏ chất dinh dưỡng ở phạm vi hẹp quanh mẫu nên hệ số hấp thu chất dinh dưỡng của mẫu cấy trong môi trường thạch thấp. Khi cây sử dụng hết chất dinh dưỡng xung quanh, cây khó có thể hấp thu phần dinh dưỡng phân bố ở những vị trí xa mẫu, do vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của mẫu bị giảm sút. - Môi trường bán rắn chỉ sử dụng được một lần, không cho phép thay đổi thành phần môi trường cho những giai đoạn phát triển khác nhau của thực vật vi nhân giống, đòi hỏi mẫu cấy phải được cấy chuyền liên tục. - Để hòa tan agar, ta cần sử dụng một nhiệt lượng để nâng nhiệt độ lên 60oC, kết hợp với giá thành agar hiện nay tương đối cao đã làm giảm hiệu quả kinh tế của việc sử dụng agar vào nhân giống in vitro. - Khi đặt mẫu vào môi trường thạch, mẫu sẽ phát triển không đồng đều do có những vị trí trên mẫu không được tiếp xúc với môi trường. Ví dụ như khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trường thạch, sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ không đều do sự trao đổi khí, gradient của các hợp chất gây độc, chất ức chế mà thực vật tiết ra môi trường không giống nhau ở những vị trí tiếp xúc khác nhau giữa khối mô sẹo và môi trường Những 36 nhược điểm trên đã đưa đến yêu cầu về một hệ thống nuôi cấy mới phù hợp hơn, đáp ứng những đòi hỏi ngày càng cao của công tác nhân giống in vitro. Trước tình hình đó, hệ thống nuôi cấy sử dụng môi trường lỏng tỏ ra có triển vọng hơn cả. Hệ thống nuôi cấy in vitro sử dụng môi trƣờng lỏng tĩnh Nuôi cấy lỏng là một cách thức lý tưởng cho mục tiêu giảm chi phí và tự động hóa vi nhân giống thực vật. Nuôi cấy lỏng cung cấp điều kiện nuôi cấy đồng nhất hơn, môi trường có thể thay mới mà không cần phải chuyển mẫu sang bình chứa khác, có thể thực hiện khử trùng bằng vi lọc và việc cọ rửa chai lọ sau khi nuôi cấy cũng đơn giản hơn. So với việc nuôi cấy trên thạch, nuôi cấy lỏng cho phép sử dụng những loại bình nuôi cấy dung tích lớn từ đó giảm được số lần cấy chuyền. Mô của một số loài thực vật biểu hiện tốt hơn trên môi trường lỏng so với trên môi trường đặc, chẳng hạn như chồi cây đào (Prunus persica), phôi soma lúa mì (Triticum aestivum), và phôi soma cây bông (Gossypium hirsutum). Nuôi cấy lỏng thực ra đã có từ rất lâu đời. Trong thời kỳ đầu, Haberlandt đã tiến hành nuôi cấy mô lá của các cây đơn tử diệp bằng môi trường lỏng. Việc nghiên cứu nồng độ khoáng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được thực hiện với môi trường lỏng. Tuy nhiên, môi trường lỏng được sử dụng trong thời kỳ này đơn giản chỉ là môi trường lỏng tĩnh. Hệ thống nuôi cấy lỏng có nhiều lợi điểm không thể phủ nhận: - Môi trường nuôi cấy lỏng có độ đồng nhất cao do các chất tinh dưỡng khuếch tán đều trong dung môi lỏng, tạo điều kiện để mẫu cấy sử dụng triệt để chất dinh dưỡng sẵn có. Hơn nữa, toàn bộ bề mặt mẫu được tiếp xúc trực tiếp với môi trường nên việc hấp thu chất dinh dưỡng hiệu quả hơn, cây sinh trưởng tốt hơn, thời gian nuôi cấy có thể được rút ngắn. - Nuôi cấy lỏng cho phép kiểm soát các thông số hóa lý một cách chủ động, đây là một điều kiện cần có để thực hiện tự động hóa. Do vậy, nuôi cấy lỏng rất phù hợp khi triển khai ra quy mô công nghiệp. - Chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm thấp hơn so với nuôi cấy bán rắn, tiết kiệm được thời gian và lao động. Bên cạnh những mặt mạnh, việc nuôi cấy lỏng cũng vấp phải nhiều khó khăn, nhất là khả năng thoáng khí kém, hiện tượng thủy tinh thể và đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Để hạn chế những nhược điểm này, một số phương pháp đã được đề xuất như bổ sung thêm các giá đỡ mẫu nuôi cấy trong môi trường 37 lỏng tĩnh, bổ sung môi trường lỏng vào môi trường thạch đã sử dụng trước đó, và sử dụng các bioreactor sục khí. Một vấn đề lớn thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là sự nhiễm vi sinh vật. Nấm mốc, vi khuẩn và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân gây mất nguồn mẫu thực vật chủ yếu trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự nhiễm vi sinh vật sẽ là rất nhanh và nghiêm trọng hơn cả so với các loại môi trường khác. Sự gây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm, để hạn chế nguy cơ bị nhiễm, người ta thường tạo một không gian vô trùng bằng dòng không khí được lọc qua các lớp màng lọc. Trước hai mặt được và chưa được của hệ thống này, các nhà khoa học tích cực nghiên cứu phát triển những hệ thống mới để vừa tận dụng được các ưu điểm của nuôi cấy lỏng, vừa khắc phục những yếu điểm cố hữu của nó. Hệ thống nuôi cấy lỏng sử dụng giá thể Giá thể được sử dụng với mục đích nâng một phần hoặc toàn bộ mẫu cấy lên khỏi môi trường lỏng mà vẫn đảm bảo dinh dưỡng cho cây nhờ sự thẩm thấu của các cấu tử dinh dưỡng qua giá thể đến mẫu. Các loại vật liệu làm giá thể rất đa dạng, từ những vật liệu dễ kiếm như bông gòn, giấy lọc đến những vật liệu cao cấp như rockwool, oasis, v.v. Điển hình cho giá thể cao cấp là rockwool. Bản chất của rockwool là thể sợi (wool) có nguồn gốc từ đá (rock). Đá, chủ yếu là đá basalt, được đun chảy ở nhiệt độ 1600oC, được đổ vào các ống và quay với tốc độ cao, biến dịch đá lỏng thành các sợi. Chiều dài và đường kính sợi được kiểm soát thông qua tốc độ quay, nhiệt độ nung và một số các yếu tố khác. Khi nghiên cứu trên đối tượng cây chuối Nam Định, Nhut (2002) đã chứng minh rằng cây nuôi cấy trên rockwool và oasis có chiều cao thân và số lượng lá nhiều hơn hẳn các hệ thống sử dụng agar truyền thống. Hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Mẫu cấy được đặt trong môi trường lỏng và được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ thích hợp. Chuyển động lắc tạo điều kiện cho không khí tự do khuếch tán vào môi trường tốt hơn, tăng lượng oxygen hòa tan trong môi trường, thỏa mãn nhu cầu hô hấp của cây. Tewary P.K. và Oka S. (1999) đã sử dụng hệ thống lỏng lắc để nhân giống chồi bên cây dâu tằm với tốc độ lắc 120 vòng/phút. Kết quả thu được sau 6 tuần rất tốt: 90% mẫu cảm ứng tạo chồi mới với chiều dài mỗi chồi khoảng 3,3cm. 38 Hệ thống nuôi cấy lỏng trong bioreactor Khi nuôi mẫu trong dung dịch lỏng kết hợp với tăng cường độ thoáng khí, mẫu cấy vẫn hô hấp tốt dù bị ngập trong dung dịch. Có thể mở rộng quy mô của hệ thống này bằng cách sử dụng các bình chứa dung tích lớn (hệ thống bioreactor cấp khí cưỡng bức) để nhân sinh khối hay thu hợp chất thứ cấp từ thực vật. Các phương pháp tạo điều kiện thoáng khí khi nuôi cấy lỏng trong các bioreactor gồm có: sục khí cưỡng bức, ngập chìm tạm thời, v.v. Hiện nay có rất nhiều hệ thống bioreactor sục khí được thiết kế nhằm nhân giống cây hoa lily với số lượng lớn. Trong các hệ thống này, mặc dù vảy củ lily chìm xuống đáy bình nhưng sự tăng trưởng của chúng vẫn rất tốt. E. Jiménez và cộng sự (1999) đã chứng minh rằng hệ thống ngập chìm tạm thời cho hiệu quả tạo củ khoai tây bi tốt hơn so với môi trường bán rắn truyền thống: củ bi được hình thành trên tất cả các đốt thân sau 9 tuần nuôi cấy, trung bình khoảng 3,1 củ/đốt. Trọng lượng tươi và kích thước củ cũng lớn hơn củ hình thành trên môi trường thạch. Tóm lại, các hệ thống cải tiến đều có những tiến bộ và hầu hết đều tập trung giải quyết vấn đề thoáng khí khi nuôi cấy trong môi trường lỏng. Ngoài ra, một yếu tố không thể thiếu cần cân nhắc khi thiết kế các hệ thống mới là hiệu quả kinh tế của hệ thống. Có như vậy, hệ thống mới được nhanh chóng thương mại hóa và có khả năng cạnh tranh với những hệ thống nhân giống truyền thống khác. Các hệ thống bioreactor nuôi cấy in vitro được tìm hiểu trong đề tài này cũng hướng đến các yếu tố đó với mục đích chọn lựa được hệ thống nuôi cấy phù hợp cho một số đối tượng thực vật cụ thể. 2.9. Các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm định kỳ Thời gian ngập chìm Thời gian để mẫu ngập trong môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa rất quan trọng do nó ảnh hưởng đến sự hấp thu chất dinh dưỡng củ