Luận văn Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa Xylanase trong nấm mốc

ở nhiệt độ phòng. Chiết DNA một lần bằng phenol, một lần bằng phenol : chloroform. Bổ sung Na – acetate 3M, pH 7,0 (nếu pH = 5,2 như thông thường thì EDTA trong dung dịch sẽ bị kết tủa khi nồng độ > 5 – 10 mM) theo tỷ lệ thể tích 1: 10. Trộn đều và thêm 2 lần thể tích ethanol 100%. Đảo đầu ống Eppendorf vài lần. Giữ ở 0°C trong 15 phút. Ly tâm 12000 v/p, 10 phút, 4°C để thu DNA. Rửa cặn bằng ethanol 70%, ở 4°C. Làm khô DNA và hoà trong TE (pH 7,6) và bảo quản ở – 20°C. Phản ứng khử phosphate được tiến hành như sau: H2O: 29 µl Buffer CIAP: 5 µl CIAP: 1 µl Vector: 15 µl Tổng thể tích: 50 µl Ủ 37° – 1giờ và dừng phản ứng ở 65° – 15 phút * Tinh chế các đoạn DNA và vector tách dòng trên gel agarose Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-), trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy trình tinh sạch DNA gồm các bước sau: Làm tan gel Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng gel và chuyển vào ống Eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được. Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ 10 µl dung dịch/10 mg gel. Vortex và ủ ở 50 - 65˚C cho đến khi gel tan hoàn toàn. Gắn DNA Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch). Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection. Rửa màng Bổ sung 700 µl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 v/p trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía ở ống phía dưới cột Collection. Rửa lại 1 lần bằng cách bổ sung tiếp 500 µl dung dịch rửa, ly tâm 12000 v/p trong 5 phút. Loại bỏ phần dịch ở ống phía dưới cột Collection. Ly tâm tiếp cột 12000 v/p trong 1 phút, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút để bay hơi hết lượng cồn còn lại. Thu DNA Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang 1 ống Eppendorf 1,5 ml sạch. Bổ sung 50 µl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 12000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ cột SV và giữ DNA ở 4˚C hoặc -20˚C. Kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel 0,8 % agarose. * Phản ứng ghép nối Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo Kit tách dòng CloneJETTM PCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase hoặc đã được cắt bằng enzyme giới hạn có vị trí nhận biết điểm cắt tương ứng. Quy trình nối ghép gen: Vetor và đoạn DNA ngoại lai sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn, tinh chế và được tiến hành nối ghép theo phản ứng như sau: H2O: 5µl T4 ligase buffer : 2µl Vector: 2µl T4 DNA ligase: 2µl Sản phẩm cắt enzyme: 9µl Tổng thể tích: 20µl Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 0° – 18°C trong 16 giờ. - Phương pháp ghép nối các đoạn DNA vào vector: các đoạn gen và vector sau khi được xử lý bằng enzyme giới hạn phù hợp sẽ được ghép nối với nhau nhờ enzyme T4 ligase, phản ứng thực hiện ở 14˚C trong 12 giờ. Đặc biệt trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tính chất đặc biệt của 2 loại enzym giới hạn Bam HI (GGATCC) và Bgl II (AGATCT) có 4 điểm nhận biết ở giữa giống nhau, tạo ra đầu dính giống nhau là GATC. Nhờ vào đặc điểm này mà người ta có thể tiến hành ghép nối đoạn DNA được cắt bằng Bam HI với đoạn DNA được cắt bằng Bgl II, khi đó trong phân tử DNA lai điểm cắt của hai enzyme này bị thay đổi. 2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens * Biến nạp vào tế bào E. coli Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hoá chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E. coli H10b hoặc E. coli DH5α: Nhặt một khuẩn lạc cấy ria lên đĩa LB đặc, ủ ở 37°C qua đêm. Nhặt 1 khuẩn lạc trên đĩa ủ qua đêm và nuôi trong 2 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C qua đêm. Chuyển 300 µl dịch nuôi cấy sang 30 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 3 giờ. Chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm đã được làm lạnh trên đá, ly tâm 5000 v/p, 4°C trong 10 phút để thu cặn. Hòa tan cặn nhẹ nhàng (có thể dùng đầu côn để làm tan tế bào) trong 0.7 đến 1.5 ml dung dịch CaCl2 (tùy theo lượng tế bào nhiều hay ít), ly tâm 5.000 v/p, 4°C, 10 phút để thu cặn. Tiếp tục lặp lại bước trên 1–2 lần. Bổ sung glycerol 60% theo tỷ lệ 1 : 2 so với lượng CaCl2 dùng để rửa, dùng pipet trộn đều nhẹ nhàng. Hút 80 µl – 100 µl vào ống Eppendorf 1.5 ml đã được giữ lạnh trên đá và cất ngay trên đá hoặc bảo quản ở tủ –80°C. Tế bào khả biến có thể dùng ngay hoặc để trên bình đá hay cất vào tủ lạnh dùng trong 3 ngày hoặc làm lạnh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở –80°. Quy trình biến nạp: Đặt tế bào khả biến E. coli DH10b hoặc E.coli DH5α vào đá khoảng 30 phút nếu tế bào khả biến cất giữ ở – 80°C. Bổ sung 5ml sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH10b hoặc E. coli DH5α, đảo nhẹ và ủ trong đá 15 phút. Sốc nhiệt ở 42°C trong 70 giây, đặt ngay vào đá 5 phút. Bổ sung 300 ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc 37°C trong 1 giờ. Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicillin hoặc kanamycin (50mg/ml). Nuôi ở 37°C qua đêm, chọn các khuẩn lạc. * Phương pháp biến nạp vào tế bào A. tumefaciens Chuẩn bị tế bào khả biến A. tumefaciens Làm mới giống trên môi trường thạch YEB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong 2 ml môi trường LB ở 28°C, 6 – 8 giờ. Lấy 1 ml dịch vi khuẩn trên nuôi cấy tiếp ở 28°C qua đêm trên 100 ml môi trường LB lỏng + 0,1% glucose đến khi OD660nm đạt 1– 1,5. Làm lạnh mẫu trong đá 15 phút, ly tâm 5000 v/p, 20 phút để thu cặn tế bào Rửa cặn 3 lần trong 10 ml 1 mM HEPES (N–2–hydroxyethylpiperazine–N’–2–ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lần trong 10 ml 10% glycerol. Cặn hòa lại trong 500 – 700 ml 10% glycerol. Chia 100 ml dịch tế bào vào mỗi ống Eppendorf, làm lạnh trong nitơ lỏng và bảo quản ở – 80°C. Quy trình biến nạp vào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện Vector được đưa qua cột thôi gel để tinh sạch, nồng độ sau khi qua cột tinh sạch là 40 – 50 ng/µl. Làm tan tế bào khả biến (TBKB) trên đá 30 phút. Thêm 5 – 10 µl sản phẩm DNA ngoại lai. Để trên đá 10 phút, cuvet được ngâm cồn, chiếu đèn tím khử trùng rồi làm lạnh trong đá 5 phút, sau đó bổ sung dịch TBKB vào trong cuvet. Xung điện ở 25F, 2,5kV, 400Ω. Bổ sung 800 µl SOC vào cuvet, chia ra 3 ống Eppendorf, lắc ở 28°C trong 2 giờ. Trải đĩa với lượng lần lượt là 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl lên đĩa môi trường đặc YEB có bổ sung rifamycin, kanamycin, ampicillin và nuôi ở 28°C trong 2 ngày. Nhặt nuôi một số khuẩn lạc trong 5 ml – 7 ml YEB bổ sung kháng sinh thích hợp. 2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Quy trình: Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50° – 60°C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau khoảng 30 phút, khi gel đã đông cứng, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm. Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 – 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút). Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr (nồng độ 10 mg/ml) trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất. Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio – Rad với tia UV có bước sóng 320 nm. 2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]: Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn. Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân. Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi. PCR bao gồm các thành phần sau đây: Một đoạn DNA khuôn. Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide. Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. Thành phần phản ứng chạy PCR: dNTPs (10 mM) : 1ml Buffer (10 X) : 2.5ml Primer F (10 µM): 1ml Primer R (10 µM): 1ml Taq (5 U/ul): 0.2ml H2O: 18.3ml DNA plasmid: 2ml Tổng thể tích: 25 ml Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph: 94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 43 giây 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút 2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p. * Quy trình tách DNA plasmid từ E. coli Cấy một khuẩn lạc vào ống penicillin đã bổ sung 2 ml môi trường LB lỏng chứa kháng sinh thích hợp. Nuôi qua đêm ở 37°C trong điều kiện lắc 200 v/p. Lưu ý: Thể tích ống penicillin phải lớn gấp 4 lần thể tích nuôi cấy. Các ống phải đậy nắp không chặt quá. Dịch nuôi phải được nuôi cấy trong điều kiện lắc nhẹ. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi sang ống Eppendorf. Ly tâm ở 11000 v/p ở 4°C trong 30 giây. Loại bỏ dịch môi trường để thu cặn tế bào. Lưu giữ những dịch nuôi cấy chưa sử dụng hết ở 4°C. Làm tan cặn tế bào trong 100 ml dung dịch Sol I (giữ trong đá) bằng máy vortex. Bổ sung 200 ml dung dịch Sol II (mới pha) vào mỗi Eppendorf. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ trên đá trong 1 phút. Không được vortex. Bổ sung 150 ml dung dịch Sol III. Đậy nắp chặt, đảo ngược Eppendorf vài lần và giữ ở 0°C trong 3 – 5 phút. Ly tâm 12000 v/p trong 5 phút ở 4°C và hút chuyển dịch sang ống mới. Bổ sung một thể tích tương đương phenol : chloroform. Đảo lẫn hai pha bằng cách vortex và ly tâm ở 12000 v/p trong 2 phút ở 4°C. Hút chuyển pha trên sang ống mới. Tủa nucleic acid bằng cách bổ sung 2 lần thể tích ethanol 98%. Trộn đều bằng vortex và giữ ở – 20°C trong 3 giờ. Thu tủa bằng cách ly tâm 12000 v/p trong 20 phút ở 4°C. Loại sạch ethanol và bổ sung 1 ml ethanol 70%. Ly tâm thu tủa 12000 v/p trong 8 phút ở 4°C. Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút hoặc để mở nắp trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hoà tan DNA trong 50 ml H2O khử in vô trùng (hoặc 50 ml TE pH 8) chứa 20 mg/ml RNase. Kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8 % và giữ mẫu ở – 20°C. * Quy trình tách DNA plasmid từ Agrobacterium Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút để thu tủa tế bào. Bổ sung 10% lyzozyme vào dịch Sol I, bổ sung 150 µl Sol I vào 1 ống ppendorf, đánh tan. Bổ sung 150 µl Sol I, lắc đều + 150 µl Sol III, đảo đều, bổ sung 1 µl RNAse 1 mM/µl, ủ 37oC trong 1h, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu dịch. Bổ sung 1ml EtOH 100%, ủ 3h, sau đó ly tâm 12000 v/p trong 15 phút, thu tủa, bổ sung 30 µl H2O. Điện di 8 µl để kiểm tra DNA plasmid bằng agarose 0.8% 2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn Để xác định chính xác DNA ngoại lai đã được chèn vào vector mong muốn, DNA plasmid mang gen tái tổ hợp đã lựa chọn được cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra. Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt cả hai sợi của phân tử DNA. Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Sau khi đã tách dòng thành công bằng các vector tách dòng, DNA plasmid thu được từ tách chiết plasmid tái tổ hợp cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng kỹ thuật cắt enzyme giới hạn. Enzyme giới hạn được sử dụng để cắt kiểm tra bao gồm: Eco RI và Kpn I, Sma I, Hind III, Bgl II, Nco I, Not I. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau: Eco RI Dung dịch đệm Eco RI Sma I Dung dịch đệm Tango Hind III Dung dịch đệm R Kpn I Dung dịch đệm Kpn I Bgl II Dung dịch đệm Tango Nco I Dung dịch đệm Tango Not I Dung dịch đệm Tango Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần: H2O: 5.8 µl Buffer: 1.0 µl DNA plasmid: 3.0 µl Enzyme cắt: 0.2 µl Tổng thể tích: 10 µl Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 37°C trong 1, 5 giờ và kiểm tra kết quả bằng điện di agarose 0,8%. 2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng * Nguyên tắc chung Trình tự đoạn nucleotide quan tâm được xác định dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 µl. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96˚C - 1 phút; (96˚C - 10 giây; 50˚C - 5 giây; 60˚C - 4 phút) x 25 chu kỳ. Sau đó sản phẩn được giữ ở 4˚C. * Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 µl EDTA 125 mM, 60 µl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó ly tâm 12000 v/p, 15 phút để tủa DNA có trong đó. Bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 µl EtOH 70%. Ly tâm 10000 v/p trong 10 phút. Làm khô tủa và bổ sung 10 µl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95˚C trong 5 phút. Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer. Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 µl. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2. * Phân tích trình tự gen Kết quả giải trình tự gen được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2, Bioedit; Seqscape 2.5 và so sánh với trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn. 2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger * Chuẩn bị nấm sợi A. niger để thu bào tử Cấy ria từ ống giữ chủng A. niger trong glycerol ở – 80°C lên đĩa nuôi cấy có chứa môi trường PDA. Dịch còn lại giữ ở – 20°C. Ủ đĩa nuôi cấy ở 30°C trong 3 ngày, trong tối. Thu hoạch bào tử nấm: bổ sung 5 ml nước muối sinh lý vô trùng và dùng que trải gạt nhẹ nhàng lên bề mặt thạch để thu bào tử. Chuyển bào tử qua màng lọc vào ống falcon 15 ml và tiếp tục bổ sung thêm 5ml nước muối sinh lý. Ly tâm 10 phút, 8000 v/p, ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và hòa tan cặn trong 1ml nước muối sinh lý. Xác định nồng độ bào tử và pha loãng đến nồng độ cuối cùng là 107 bào tử/ml bằng môi trường IM. * Chuẩn bị chủng A. tumefaciens A. tumefaciens mang Ti plasmid tái tổ hợp được cấy ria lên môi trường LC có bổ sung kháng sinh rifampicin 50 mg/ml để ngăn ngừa sự lây nhiễm các vi khuẩn khác và bổ sung đồng thời cả kanamycin 50 mg/ml để chọn lọc A. tumefaciens có mang Ti plasmid tái tổ hợp. Ủ đĩa ở 28°C trong 2 ngày Nhặt 2 khuẩn lạc trên đĩa nuôi cấy cho vào 20 ml môi trường LC đã bổ sung 50 mg/ml rifampicin và 50 mg/ml kanamycin, nuôi lắc ở 28°C, 250 v/p trong 24 giờ. Ly tâm dich nuôi cấy trong Eppendorf 1.5 ml trong 10 phút, 6000 v/p ở nhiệt độ phòng. Bỏ dịch nổi, thu cặn và tiếp tục rửa cặn bằng cách hòa tan cặn trong 250 µl dung dịch IM. Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi. Hòa tan cặn trong 5 ml dung dịch IM có chứa 5µl AS nồng độ 0.2M Ủ dịch nuôi cấy ở 28°C từ 4 giờ – 5 giờ, lắc 100 v/p. Đo OD600nm và pha loãng ra nồng độ cuối cùng là 0.8 (4.108 – 5.108 vi khuẩn/ml). * Nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger: Trộn 100 µl tế bào A. tumefaciens (OD600nm = 0.8) và 100 µl bào tử nấm (nồng độ = 107 bào tử/ml). Sử dụng kẹp vô trùng đặt màng lọc lên đĩa petri có chứa môi trường thạch IM đã bổ sung AS 0.2M. Dùng pipet hút 200 µl hỗn hợp bào tử nấm và vi khuẩn lên trên màng lọc và trải đều bằng que trải. Ủ đĩa ở 24°C trong 3 ngày. * Chọn lọc nấm chuyển gen: Dùng kẹp vô trùng chuyển màng lọc có hỗn hợp dịch nuôi cấy lên đĩa môi trường PDA đã bổ sung cefotaxim (50 mg/ml) và hygromycin (50 mg/ml) Ủ đĩa ở 30°C trong 3 ngày, trong tối cho đến khi xuất hiện bào tử. Nhặt khuẩn lạc sang môi trường chọn lọc để làm sạch và phân lập riêng rẽ từng bào tử. Giữ chủng và tiến hành các thí nghiệm kiểm tra cần thiết Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Gen mã hóa xylanase muốn được chuyển vào nấm mốc A. niger thông qua A. tumefaciens thì phải được gắn vào giữa hai vùng biên phải và trái (LB và RB) của T – DNA trên Ti plasmid. Để giải phóng T – DNA có đoạn DNA ngoại lai, A. tumefaciens được nuôi chung với bào tử nấm trong môi trường có bổ sung chất cảm ứng AS, cảm ứng gen vir để chuyển gen mong muốn sang tế bào chủ. Nấm mốc chuyển gen được chọn lọc dựa trên đặc tính của đoạn DNA ngoại lai hoặc biểu hiện ra sản phẩm protein. Thông thường, cơ thể chuyển gen được chọn lọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh thích hợp [8]. Tiến hành khảo sát một số vector pCAMBIA1300, chúng tôi lựa chọn Ti plasmid vector pCB1300 vì vùng T – DNA của vector này có vị trí nhận biết của nhiều enzyme giới hạn phù hợp với chiến lược thiết kế vector đã đặt ra. Để tạo chủng Agrobacterium làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm, việc đầu tiên là thiết kế Ti plasmid vector biểu hiện, vector này được kí hiệu pCB_xylB_hph gen mã hóa xylanase (xylB) và gen kháng hygromycin B (hph). Vector tái tổ hợp Ti plasmid được kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn hoặc PCR hoặc giải trình tự gen trước khi chuyển vào Agrobacterium. Chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph được nuôi nhiễm với bào tử nấm A. niger. Nấm chuyển gen sẽ được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có bổ sung chất kháng sinh thích hợp. Toàn bộ quy trình thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc được thể hiện chi tiết qua sơ đồ sau: 3.1. Thiết kế vector trung gian (pKS_xylB_hph) mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian Để thiết kế vector trung gian pKS_xylB_hph, xylB và hph được lắp ghép vào vector trung gian pKS–. Tuy nhiên, cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong nấm mốc lại nằm trên vector pAN7.1 – GluA. Do vậy, hai cấu trúc trên được đưa lần lượt vào vector trung gian. Trước hết là tiến hành thiết kế vector trung gian mang cấu trúc biểu hiện xylB dựa trên vector pAN7.1 – GluA, tạo thành vector tái tổ hợp được kí hiệu là pAN_xylB. 3.1.1.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pAN_xylB mang xylB Muốn gen hoạt động và biểu hiện ra sản phẩm protein, gen phải nằm trong một kết cấu hoàn chỉnh gồm đoạn khởi đầu ở phía trước và đoạn kết thúc ở phía sau gen, đoạn khởi đầu và kết thúc này sẽ điều khiển gen hoạt động trong tế bào chủ thích hợp [6, 22, 39]. Bởi vậy, để xylB biểu hiện được, trình tự DNA mang mã di truyền của xylB phải được lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc trên vector pAN7.1 – GluA [22]. Trước hết, trình tự của xylB được nối ghép vào vector tách dòng pJET1.2 để nhân lên lượng lớn, sau đó vector tái tổ hợp được cắt bằng enzyme Bgl II để thu lại đoạn gene mang trình tự xylB làm nguyên liệu lắp ghép vào vector pAN7.1 – GluA. Để có thể nối ghép xylB vào vector pAN7.1 – GluA, vector pAN7.1 – GluA phải được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn. Giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc điều khiển khiển hoạt động của xylB có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bam HI, do đó enzyme Bam HI được sử dụng để cắt vector pAN7.1 – GluA. Kb M 1 2 ~ 8,3 kb ~ 0,7 kb 8 0, 75 0,5 Hình 3. 2: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm tinh sạch của vector pAN7.1 – GluA và gen mã hóa xylanase M: Marker 1 kb 1: Sản phẩm cắt của vector pAN7.1 – GluA bằng enzyme Bam HI 2: Sản phẩm cắt của gen mã hóa xylanase bằng enzyme Bgl II Vector pAN7.1 – GluA được mở vòng bằng Bam HI nên sản phẩm cắt thu được trên điện di đồ (Hình 3. 2) là một băng duy nhất có kích thước khoảng 8,3 kb. Sản phẩm cắt enzyme của gen mã hóa xylanase có kích thước khoảng 0,7 kb. Hai đoạn DNA này có kích thước phù hợp với lý thuyết. Do đó, chúng sẽ được tinh sạch và nối ghép với nhau nhờ T4 DNA ligase. Do trình tự nhận biết điểm cắt của Bgl II tương đồng với trình tự cắt của Bam HI nên chúng có thể nối ghép dễ dàng. Sản phẩm nối ghép được biến nạp vào E. coli để thu lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp. Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào), sau đó phá màng tế bào bằng dung dịch II. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II còn có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3. 3: Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang xylB 1 – 15: Plasmid tái tổ hợp của các dòng khuẩn lạc (kí hiệu pAN_xylB từ (1 – 15)) 16: Đối chứng – vector pAN7.1 – GluA Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid không được chèn thêm đoạn gen ngoại lai (hay được gọi là plasmid gốc). Do vậy, độ cao thấp của các băng trên hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid so với băng đối chứng là cơ sở ban đầu để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA ngoại lai. Trên điện di đồ (Hình 3.3), hầu hết DNA plasmid tái tổ hợp đều cao hơn so với DNA plasmid đối chứng. 4 plasmid có thứ tự từ giếng 1 – 4 tương ứng với các dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1; pAN_xylB2, pAN_xylB3 và pAN_xylB4 được tinh sạch và dùng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho xylB: XylB – F và XylB – R kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector pAN – GluA. Kb M 1 2 3 4 5 ~ 0,7 kb 0,7 Hình 3. 4: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xyB bằng PCR M:Marker 1 kb 1 – 5: Sản phẩm PCR của dòng khuẩn lạc pAN_xylB6– 10 Trên điện di đồ (Hình 3. 4), các băng ở giếng 1 – 5 tương ứng với dòng khuẩn lạc pAN_xylB(6 – 10), đều có kích thước khoảng 0,7 kb, bằng với kích thước lý thuyết của gen xylB. Do đó, chúng tôi khẳng định đã nố