Luận văn Thử nghiệm sử dụng phức hợp vi sinh vật trong chế biến phomai từ đậu hũ và bã đậu nành (okara)

hu bột okara hiện đại của nước ngoài thì okara có thành phần như sau [28]: Okara dạng ướt có hàm ẩm: 17,76%, xơ: 1,75% Okara dạng bột có hàm ẩm: 6,7%, béo: 10,59%, xơ: 7,99% và đạm: 36,43% Cho tới thời điểm cuối năm 2006, lượng okara do Vinamilk sản xuất (có hàm lượng đạm 39,5% và xơ thô 8,36%) trên dây chuyền thiết bị hiện đại của nước ngoài (có công suất khoảng 10 tấn/giờ) mới chỉ dùng làm thức ăn thô cho chăn nuôi [9]. Tại công ty Tribeco theo quy trình sản xuất sữa đậu nành lọc sữa 1 lần chỉ thu được khoảng 50% protein của hạt đậu nành (ở nước ngoài lọc 2 lần sẽ thu được khoảng 65 – 70%). Từ 1kg đậu nành thu được 1,5kg bã đậu nành ướt (sau ly tâm), chứa khoảng 20% chất khô. Bã ướt là dạng phế liệu cuối cùng của công nghệ sản xuất sữa đậu nành và hiện nay mới chỉ được sử dụng cho chăn nuôi [12]. Cho tới vài năm gần đây chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về okara và tất cả tập trung tại TP.Hồ Chí Minh. Vũ Văn Độ và các cộng tác viên [3] nghiên cứu dùng nấm sợi của các loại nấm lớn (Linh chi - Ganoderma lucidum, Bào ngư - Pleurotus florida) xử lý okara để chế biến bánh bistcuit, trà túi lọc... Lê Chiến Phương và các cộng tác viên (2004) [17] xử lý okara bằng nấm mốc Mucor và vi khuẩn lactic. Ngô Đại Nghiệp dùng Asp.oryzae chế biến okara thành tương xay. Lại Mai Hương và các cộng tác viên có dự định dùng enzyme kết hợp với phương pháp cơ học xử lý cellulose trong okara để sản xuất chế phẩm giàu chất xơ bổ sung vô một số thực phẩm [10]. Chưa có sản phẩm nào trong số các sản phẩm nêu trên được triển khai sản xuất thử ở quy mô công nghiệp. Điều này cho thấy ở Việt Nam ngay cả nơi có sản xuất okara ở quy mô công nghiệp, hiện đại như công ty sữa Việt Nam, loại phụ phế liệu đậu nành này vẫn chưa được tận dụng có hiệu quả vào các mục đích khác ngoài thức ăn chăn nuôi Thành phần dinh dưỡng của okara (tính theo 100g) Năng lượng: 77kcal, protein: 3,22g, béo tổng số: 1,73g, béo no: 0,193g, béo 1 nối đôi: 0,295g, béo nhiều nối đôi: 0,755g, tro: 0,88g, carbohydrate: 12,54g, Ca: 80mg, Fe: 1,30mg, Mg: 26mg, P: 60mg, K: 213mg, Na: 9mg, Zn: 0,56mg, Cu: 0,2mg, Mn: 0,4mg, Se: 10,6mcg, Thiamin: 0,02mg, Riboflavin: 0,02mg, Niacin: 0,1mg, Pantothenic acid: 0,088mg, Vitamin B6: 0,115mg. Quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành [21] Sơ đồ 1.1. Quy trình thu nhận okara từ công nghệ sản xuất sữa đậu nành 1.1.5.2. Định nghĩa về chất xơ [34] Xơ tổng: chất xơ gồm các phần còn lại của tế bào thực vật, các polysaccharide, lignin và các chất liên quan chịu được sự thủy phân của các enzyme trong hệ tiêu hóa người. Tùy theo độ phân tán trong nước mà chất xơ được chia thành 2 loại là tan và không tan. Tất cả các thức ăn có nguồn gốc từ thực vật đều có cả 2 loại chất xơ này. Xơ không tan [26][34] : loại xơ này chiếm khoảng 2/3 lượng xơ trong thực phẩm. Chủ yếu là cellulose, ngoài ra còn có hemicellulose, lignin, cutin… Chất xơ Hạt đậu nành Ngâm nước nóng đối lưu (5phút, 85-90oC) Thải bỏ nước Bóc vỏ Nghiền Trích ly Dịch sữa Bã Sấy 15 phút, 150-170oC Sấy rung Okara không hòa tan có đặc tính thẩm thấu nước trong ruột, trương lên tạo điều kiện cho chất bã thải dễ thoát ra ngoài. • Cellulose: là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật, được cấu tạo bởi các β-D glucose-pyranose, các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết glucose. Cellulose không tan trong nước (cả nước nóng và nước lạnh), tan trong acid và kiềm. Khi đun sôi với acid sulfuric đậm đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo nên disaccharide cellobiose. Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì không tiêu hóa được ở ống tiêu hóa. Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì trong ruột của chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme cellulase là enzyme thủy phân cellulose. Hình 1.6. Cellulose • Hemicellulose: là nhóm polysaccharide không tan được trong nước, chỉ tan được trong dung dịch kiềm. Hemicellulose cũng là thành phần của thành tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các phần như vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được các monosaccharide thuộc nhóm hexose (như manose, galactose) và nhóm pentose (như arabinose, xilose). Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy nhiều trong rơm, rạ… Hình 1.7. Hemicellulose Xơ tan [26][34]: gồm pectin, β-glucan, galactose, mannan, gum… Chất xơ hòa tan khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng vào máu, và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa. • Pectin: là polysaccharide có nhiều ở quả, củ hoặc thân cây. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng: dạng protopectin không tan (tồn tại chủ yếu ở thành tế bào) và dạng hòa tan của pectin (tồn tại ở dịch tế bào). Dưới tác dụng của acid, enzyme protopectinase hoặc khi đun sôi, protopectin chuyển sang dạng pectin hòa tan. Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt acid và đường, nó có khả năng tạo thành chất gel, vì vậy nó được ứng dụng rộng rãi trong kỹ nghệ sản xuất mứt kẹo. Hình 1.8. Pectin Công dụng của chất xơ [34]: vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu đã đưa ra bằng chứng về những tác dụng đáng kể của chất xơ trong việc phòng và chữa bệnh, ngoài một vài tác dụng đã biết đến từ rất lâu. Tác dụng phòng và điều trị của chất xơ chủ yếu tập trung vào các chứng bệnh mạn tính gắn với tuổi già: - Phòng ngừa táo bón: do có đặc tính hút nước, chất xơ không hòa tan trương lên khi ở trong ruột, làm nở và mềm khối phân, kích thích thành ruột, tăng nhu động ruột khiến việc đẩy phân ra ngoài dễ dàng hơn. Tác dụng này được coi là một tác dụng kinh điển của chất xơ. Ngoài ra, chất xơ có tác dụng hấp phụ các chất độc có trong hệ tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch của hệ thống này, tăng cường hoạt động của hệ vi khuẩn đường ruột nên giảm được nguy cơ nhiễm trùng đường tiêu hóa, nhất là bệnh tiêu chảy. - Phòng ngừa bệnh ung thư: các chuyên gia về ung thư học của Mỹ đã khẳng định rằng: chất xơ có tác dụng rất mạnh trong việc phòng ung thư đường tiêu hóa mà đặc biệt là ung thư đại tràng. Nó làm tăng khả năng miễn dịch của hệ thống tiêu hóa, khuyến khích hệ vi khuẩn hữu ích trong ruột phát triển. Chính hệ vi khuẩn này đã tác động thường xuyên lên thành ruột, hạn chế sự phân chia bất thường của các tế bào, kìm hãm sự phát sinh, phát triển các túi nang bất thường trên thành ruột. Hơn nữa, khi ở trong ruột, chất xơ còn tạo môi trường có tính khử cao, chống lại các chất oxy hóa, chất độc phát sinh trong quá trình chuyển hóa thức ăn ở đại tràng. Các chất xơ hòa tan giữ vai trò trong chuyển hóa lipid, glucid và lipoprotein. Vì thế, nó làm giảm thời gian thức ăn tồn đọng trong hệ tiêu hóa, giúp hệ thống này ít phải chịu sức ép của thức ăn về góc độ khối lượng cũng như sinh hóa. Chất xơ còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ ung thư vú ở phụ nữ. Với những phụ nữ có chế độ ăn nhiều chất xơ, ít chất béo và đạm thì nguy cơ ung thư vú có liên quan đến oestrogen giảm đáng kể. Ở những trẻ em gái có chế độ ăn như vậy, tuổi xuất hiện kinh nguyệt cũng muộn hơn và vì thế sẽ ít bị ung thư vú hơn khi trưởng thành. - Giảm mỡ máu: khi các chất xơ không hòa tan hút nước, chúng giữ luôn một phần muối mật nên kích thích cơ thể tăng cường sản xuất muối mật để bù vào lượng thiếu hụt, vì thế mà tăng sử dụng cholesterol. Lượng cholesterol tích lũy sẽ giảm đi kéo theo lượng cholesterol trong máu cũng giảm. Còn các chất xơ hòa tan tác động lên quá trình chuyển hóa lipid nên giảm nguy cơ xơ vữa động mạch. Các chuyên gia khuyên rằng những người bị tăng cholesterol máu nên tăng lượng chất xơ trong khẩu phần hằng ngày. - Phòng ngừa và điều trị tiểu đường: chất xơ làm hạn chế tăng đường huyết sau khi ăn (nhất là các chất xơ hòa tan) do có khả năng tăng tính nhạy cảm của insulin. Nó tham gia chuyển hóa triglycerid nên giúp kiểm soát nồng độ đường trong máu một cách hiệu quả. Đường sẽ được giải phóng từ từ vào máu, duy trì được nồng độ đường/máu một cách ổn định. Đây chính là mục đích của việc phòng ngừa và kiểm soát bệnh tiểu đường. - Chống béo phì: chất xơ không có giá trị dinh dưỡng nên chỉ tạo cảm giác no mà không tăng lượng calo cho cơ thể. Vì thế, nó rất lợi cho những người bị béo phì. Mặt khác, do chất xơ có thể hạn chế và kiểm soát lượng đường trong máu nên không tạo ra tình trạng thừa đường để chuyển hóa thành mỡ dự trữ. Ngay trong quá trình tiêu hóa thức ăn, cả chất xơ hòa tan và không hòa tan đều làm tăng tốc độ vận chuyển thức ăn trong ruột, hạn chế được sự hấp thu các chất dinh dưỡng nên cũng hạn chế tăng cân. - Điều trị sỏi mật: khi kết hợp với acid mật, các chất xơ tự nhiên ngăn chặn nguy cơ tạo ra sỏi mật. Chất xơ quan trọng như vậy nhưng vẫn ngày càng giảm đi trong khẩu phần ăn hằng ngày. Theo một khảo sát gần đây, lượng chất xơ trong khẩu phần ăn của chúng ta hiện nay chỉ bằng 40-50% so với 30 năm trước. Điều này có thể được giải thích là do sự phổ biến loại thực phẩm tinh chế (đã bị loại bỏ gần hết chất xơ). Đây cũng chính là một trong những nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc các căn bệnh của xã hội hiện đại như ung thư, tim mạch, tiểu đường... Với người Việt Nam, để có đủ chất xơ trong một ngày, mỗi người cần ăn tối thiểu 300 g rau xanh và 100g quả tươi. 1.1.6. Phomai sữa và phomai đậu nành 1.1.6.1. Phomai sữa [15] Phomai là một sản phẩm rất giàu dinh dưỡng được chế biến từ sữa. Phương pháp sản xuất phomai được mô tả như một quá trình tách nước, đường lactose và một vài loại khoáng có trong sữa để có được một khối đông giàu béo và protein, sau đó, khối đông này được dùng để chế biến tiếp thành phomai. Hiện nay, trên thế giới có hàng trăm loại phomai. Các sản phẩm phomai khác nhau về cấu trúc, mùi, vị, màu sắc, các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh. Quy trình công nghệ sản xuất phomai cũng rất đa dạng. Người ta có thể sử dụng các nguyên liệu sữa và giống vi sinh vật khác nhau để sản xuất phomai. Có nhiều phương pháp khác nhau để phân loại phomai. - Hàm lượng nước trong phomai thường được biểu diễn thông qua tỉ lệ phần trăm giữa lượng nước và tổng khối lượng phomai đã trừ béo, được ký hiệu là MFFB (Moisture on Fat Free Basis): Dựa vào giá trị MFFB, người ta chia phomai thành 5 loại Bảng 1.3. Phân loại phomai theo MFFB Loại sản phẩm Giá trị MFFB (%) Loại sản phẩm Giá trị MFFB (%) Phomai rất cứng Phomai cứng Phomai bán cứng <41 49 - 56 54 - 63 Phomai bán mềm Phomai mềm 61 – 69 > 67 - Dựa vào quy trình công nghệ sản xuất phomai có quá trình ủ chín hay không và dựa vào hệ vi sinh vật gây nên các biến đổi trong giai đoạn ủ chín sản phẩm, người ta chia phomai thành 2 nhóm chính: Bảng 1.4. Phân loại phomai theo quá trình ủ chín Loại sản phẩm Đặc điểm • Phomai tươi • Phomai có qua giai đọan ủ chín • Không qua giai đoạn ủ chín • Hệ vi sinh vật tham gia trong quá trình ủ chín: - Vi khuẩn - Vi khuẩn và nấm mốc MFFB = Hàm lượng nước trong phomai x 100% Tổng khối lượng phomai (g) – Lượng chất béo trong sản phẩm (g) • Các biến đổi trong giai đoạn ủ chín diễn ra chủ yếu: - Trên bề mặt khối phomai - Trong bề sâu khối phomai Ngoài ra còn có một loại phomai đặc biệt khác gọi là phomai nấu chảy (Tiếng Pháp: fromage fondu), được sản xuất từ một số loại phomai khác. 1.1.6.2. So sánh phomai đậu nành với phomai sữa [19] Bảng 1.5. So sánh phomai đậu nành với phomai sữa TT Sản phẩm Các chỉ tiêu Phomai sữa Phomai đậu nành 1 Nguyên liệu Sữa tươi Đậu nành 2 Phương pháp đông tụ protein Vi khuẩn lactic thuần chủng, rennin (từ bao tử bê sữa), CaCl2 Vi khuẩn lactic thuần chủng 3 Vi sinh vật dùng để lên men Vi khuẩn lactic Penicillium roquefoti P.camemberti Propionibacterium… Vi khuẩn lactic B.subtilis P. roquefoti P.camemberti Propionibacterium… 4 Phương pháp cấy giống vi sinh vật Bề mặt, sâu trong lòng cơ chất Bề mặt, sâu trong lòng cơ chất 5 Tính tích cực của phương pháp lên men Chủ động Chủ động 6 Thời gian lên men Lâu mau tùy ý, tùy sản phẩm Lâu mau tùy ý, tùy sản phẩm 7 Kích thước sản phẩm Lớn, nhỏ tùy ý Lớn, nhỏ tùy ý 8 Độ khô của sản phẩm Có độ mềm cứng khác nhau, điều tiết được. Có độ mềm cứng khác nhau, điều tiết được. 9 Mùi Mùi được điều tiết Mùi được điều tiết 10 Hình dạng sản phẩm Đa dạng, phong phú Đa dạng, phong phú 11 Độ mặn (hàm lượng NaCl bảo quản) Tùy sản phẩm, điều tiết được Tùy sản phẩm, điều tiết được 1.2. Các giống vi sinh vật sử dụng 1.2.1. Bacillus subtilis 1.2.1.1. Hệ thống phân loại [48] Giới: Prokaryota Ngành: Protophyta Lớp: Schyzomycetales Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 1.9. Khuẩn lạc B.subtilis 1.2.1.2. Phân bố [6] B.subtilis có mặt ở khắp mọi nơi trong tự nhiên, chúng có nhiều trong rơm cỏ nên còn gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”. Chúng còn phân bố trên bề mặt các loại hạt và các sản phẩm được chế biến từ các loại hạt đó. Trong bột mì, B.subtilis chiếm khoảng 75-95% vi khuẩn tạo bào tử. Trong các sản phẩm thực phẩm truyền thống như mắm, tương, cơm mẻ (cơm lên men chua)… chúng cũng có mặt và có vai trò đáng kể trong quá trình biến đổi sinh học. 1.2.1.3. Hình thái [5] [33] Là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có kích thước 0,5-2,5 x 1,2-10μm, thường xếp thành cặp đôi hay chuỗi ngắn, hai đầu tế bào tròn hoặc hơi vuông. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,6 – 0,9μm, không phân bố theo một nguyên tắc chặt chẽ nào - lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm. Hình 1.10. Hình nhuộm tế bào vi khuẩn B.subtilis Là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí, khi còn non di động bằng tiên mao; về già, tiên mao rụng nên mất khả năng di động. Khuẩn lạc khô hoặc nhớt, vô màu hay có màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hay tạo thành lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào mặt thạch [5]. 1.2.1.4. Cấu trúc [46] [47] Như hầu hết các vi khuẩn Gram dương khác, cấu trúc bề mặt của Bacillus khá phức tạp và có các đặc tính kết dính và chống chịu điều kiện khắc nghiệt cao. Bề mặt tế bào được cấu tạo bởi các lớp giáp mạc, lớp bề mặt có tính chất protein (S-layer), một vài lớp lót peptidoglycan và các protein trên mặt ngoài của màng tế bào. Hình 1.11. Cấu trúc vi khuẩn B.subtilis Hình 1.12. Bề mặt vi khuẩn Bacillus C=Capsule; S=S-layer; P=Peptidoglycan. S-layers Hiện diện trong một số thành viên của giống Bacillus. Chức năng chưa được xác định một cách rõ ràng, nhưng dường như có liên quan đến tính kết dính của vi khuẩn. Giáp mạc (capsules) Thành phần hóa học của lớp vỏ nhày ở các vi khuẩn khác nhau cũng khác nhau, thường là được tạo nên từ các polysaccharide, nitrogen, phosphorite và có thể có cả polypeptide, nhưng thành phần chủ yếu vẫn là nước (98%), có nhiệm vụ như một hàng rào thẩm thấu để bảo vệ tế bào chống lại quá trình khô. Vách tế bào Vách tế bào rất mỏng (100-200Å) và trong suốt không màu. Vách tế bào có tính chất đàn hồi và có độ bền rất lớn, có thể chịu được áp suất cao. Thành phần hóa học chủ yếu là glucid, một số chất béo, protide và các acid amin. Thành phần hóa học thay đổi tùy loại vi khuẩn và môi trường sống. Tiên mao (flagella) Hầu hết các vi khuẩn tạo bào tử hiếu khí đều di động nhờ vào các tiên mao, là các sợi lông rất mảnh mọc trên những phần xác định của tế bào vi khuẩn. Nó có cấu trúc là protid. Chiều dài tiên mao thường bằng chiều dài tế bào, nhưng cũng có thể dài hơn tùy từng loại vi khuẩn. Số lượng và vị trí tiên mao ở các tế bào vi khuẩn khác nhau ở mỗi loài. Tiên mao có thể mọc ở một đầu, mọc ở hai đầu, mọc xung quanh v.v…. B.subtilus có tiên mao mọc xung quanh tế bào vi khuẩn. Hình 1.13. Tiên mao của A. B. subtilis; B. P. polymyxa; C. B. laterosporus; D. P. alvei. 1.2.1.5. Sự hình thành bào tử [6] Cấu tạo của bào tử: ở vi khuẩn sinh bào tử, nang bào tử là vỏ tế bào mẹ. Màng ngoài nằm ở ngoài cùng, khi có khi không, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử. Thành phần chủ yếu là lipoprotein, một lượng nhỏ acid amin, có tính thẩm thấu kém. Lớp áo bào tử nằm dưới màng ngoài dày khoảng 3nm, gồm 3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng. Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử, vỏ bào tử chiếm thể tích rất lớn (30- 60%) trong bào tử, chứa một lượng lớn peptidoglican đặc biệt, dipicolinat canxi DPA-Ca, không chứa acid teicoic. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử, cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân. Sự hình thành bào tử: một số vi khuẩn vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hoá chất, kháng áp suất thẩm thấu. Trong thời kỳ nghỉ, không thấy bào tử vi khuẩn thể hiện bất kỳ một hoạt lực trao đổi chất nào cả. Người ta gọi đó là trạng thái sống ẩn. Bào tử có thể giữ sức sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống 200-300 năm của bào tử vi khuẩn B.subtilis. Một trong những đặc điểm quan trọng của của B.subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Các tế bào sinh bào tử khi gặp điều kiện cạn kiệt thức ăn hoặc có tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại sẽ bắt đầu thực hiện quá trình hình thành bào tử. Về mặt hình thái, có thể chia quá trình hình thành bào tử ra thành các giai đoạn: Hình thành những búi chất nhiễm sắc Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử. Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ. Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều PG và tổng hợp DPA, tích lũy canxi. Tính chiết quang tăng cao. Kết thúc việc hình thành áo bào tử. Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử, bắt đầu có tính kháng nhiệt. Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài 1.2.1.6. Hệ enzyme của B. subtilis Hệ enzyme protease [13][37] B. subtilis được nuôi trên môi trường lỏng để kích thích việc sinh tổng hợp enzyme protease (trung tính và kiềm). Điều kiện tối ưu cho việc sinh tổng enzyme protease là : nồng độ cơ chất: 0,5%, thời gian ủ: 30 giờ, nhiệt độ ủ: 40oC, pH: 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, môi trường dinh dưỡng: nước chiết thịt bò có bổ sung muối, nguồn C: lactose, nguồn N: (NH4)2SO4, nguồn acid amin: valine; các acid hữu cơ như acid acetic, acid lactic, acid citric ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm khả năng sinh tổng hợp protease. Enzyme protease được tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4 và màng lọc sephadex G200. Điều kiện để hoạt tính enzyme protease đạt cực đại là: pH 7, dung dịch đệm: đệm phosphate, thời gian ủ: 24 giờ, nhiệt độ ủ: 35oC B. subtilis tổng hợp protease ngoại bào (exoprotease) phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Hệ enzyme amylase [13] B. subtilis có khả năng tạo một lượng lớn α - amylase ngoại bào Amylase của B. subtilis không có các liên kết sulfihidril và có khả năng phân giải tinh bột nhanh gấp 2÷2,5 lần so với α - amylase nấm mốc. α - amylase của vi khuẩn B. subtilis thủy phân tinh bột tạo ra các dextrin có mạch dài khoảng 6-8 gốc glucose. Các dextrin này lại bị phân giải tiếp tục theo sơ đồ: G6 → G1 + G5 G7 → G1 + G6 hay G2 + G5 (ít) G8 → G2 + G6 hay G3 + G5 (ít) Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân cơ chất bởi amylase là glucose và maltose. Ở vi khuẩn tỉ lệ này là 1: 5. pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của α - amylase B. subtilis là từ 5,6÷6,2. 1.2.1.7. Công dụng của B.subtilis [24] [37] - Tạo kháng sinh: subtilin, eumycin, bacillin, bacillomin chống được nhiều loại vi trùng gây bệnh. - Người ta cũng thường thu α - amylase chịu nhiệt cao, dùng trong công nghiệp dệt để tách hồ tinh bột trên vải từ B. subtilis. Chế phẩm amylase từ vi khuẩn B. subtilis được thay thế đại mạch nảy mầm (malt) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. Amylase của B. subtilis chỉ được tạo thành ở giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng, bền nhiệt hơn so với enzyme của nấm mốc. - Các enzyme thủy phân protein được tìm thấy ở khắp nơi, trong tất cả các sinh vật sống, quan trọng cho sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào. Mặc dù có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng chỉ có vài loài sinh tổng hợp được enzyme protease có giá trị thương mại, trong đó B.subtilis có vai trò nổi bật trong các ngành công nghiệp khác nhau như thực phẩm, sữa, dược, dệt. Protease là một trong những nhóm enzyme công nghiệp quan trọng nhất, chiếm gần 60% tổng lượng enzyme được bán ra, được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa khô, sản xuất các loại thuốc tiêu hóa, thuốc điều trị các vết thương do bỏng hay do tác nhân virus. 1.2.2. Vi khuẩn lactic 1.2.2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic [6][33] Là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tuỳ ý, hầu hết không di động. Tế bào ở dạng cầu khuẩn có đường kính 1µm hay trực khuẩn với kích thước 1 x 2-3µm, tồn tại ở dạng tế bào đơn, kết đôi, kết tư (tetracoccus) hay kết thành chuỗi. Có khả năng lên men đường lactose có trong sữa tạo acid lactic đồng hình hay dị hình. Môi trường sống phải hiện diện hầu hết các chất dinh dưỡng. Được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men như sữa chua, dưa muối chua, nem chua… Theo khóa phân loại Bergey, vi khuẩn lactic thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Pediococcus Họ: Enterococcaceae Giống: Enterococcus Họ: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Lactococcus Căn cứ vào kiểu lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm [6]: • Vi khuẩn lactic đồng hình: sản phẩm chính là acid lactic • Vi khuẩn lactic dị hình: sản phẩm cuối khá đa dạng: acid lactic, ethanol, acid acetic, CO2. ¾ Lên men lactic đồng hình: Quá trình lên men tạo sản phẩm chính là acid lactic, lượng acid lactic chiếm 90-98% tổng sản phẩm lên men, có thể có một lượng ít các sản phẩm phụ khác như ethanol, acid acetic, acetoin, CO2. Các vi khuẩn lactic đồng hình phân giải glucose theo con đường Embden – Mayerhof, chúng có đầy đủ các hệ enzyme cần thiết cho sự phân giải này trong đó có adolase là enzyme chủ yếu của con đường phân giải. Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình: C6H12O6 VK 2CH3-CHOH-COOH Sơ đồ chuyển hóa: C6H12O6 2CH3COCOOH Acid pyruvic 2NAD 2NADH2 2CH3CHOHCOOH Lactat dehydrogenase Acid lactic Enzyme Sơ đồ 1.2. Sơ đồ chuyển hóa acid lactic Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có đủ enzyme carboxylase nên acid pyruvic không bị phân giải tiếp tục mà chỉ nhận hydro để tạo thành acid lactic. Một phần nhỏ acid pyruvic bị decarboxyl để tạo lượng nhỏ sản phẩm phụ nói trên. Vi khuẩn thực hiện kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Giống Lactobacterium (loài điển hình là L.bulgaricus) với nhiệt độ thích hợp cho lên men là 40-48oC, có khả năng tích lũy 3,0-3,5% acid lactic, L.plantarum lên men tốt ở 30°C và tích lũy 0,9-1,2% acid lactic,… Giống Streptococcus (loài điển hình là S.lactis) phát triển thích hợp nhất ở 30-35°C, có thể phát triển ở 10°C. Khi phát triển trong sữa chúng có thể tích lũy 0,8-1,0% acid lactic. S.cremoris lên men sữa ở nhiệt độ thích hợp là 25-30oC, lên men được glucose, maltose, lactose, galactose. Lên men lactic đồng hình có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp sản xuất acid lactic và công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong công nghiệp sữa như sản xuất sữa chua, phomai. Chúng đóng vai trò quan trọng cùng với vi khuẩn propionic trong việc tạo hương cho các loại phomai rắn. ¾ Lên men lactic dị hình: Sản phẩm lên men ngoài acid lactic còn có hàng loạt các sản phẩm khác với tỷ lệ khá cao như acid lactic 40%, acid acetic 10%, các chất khí 20%. Phương trình tổng quát: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + COOH(CH2)COOH + CH3COOH + C2H2OH + CO2 +H2… Cơ chế chuyển hóa trong lên men dị hình chưa được giải thích đầy đủ. Theo giả thiết hiện nay thì các vi khuẩn lactic dị hình thiếu enzyme chủ yếu của con đường Embden – Mayerhof, đó là adolase và triosephosphate isomerase nên glucose sẽ chuyển hóa theo chu trình pentosephosphate qua hàng loạt sản phẩm trung gian để tạo xilulose 5-phosphate sau đó bị phân ly thành aldehyde và acetyl phosphate. Từ aldehyde, phosphoglycerinic chuyển tiếp tạo thành acid succinic và acid lactic, còn acetyl phosphate tiếp tục chuyển hóa theo hai hướng để tạo ethanol và acid acetic. Giống vi khuẩn chủ yếu lên men lactic dị hình là Leuconostoc (L.mensenteroides, L.dextranicum, L.citrovorum) và giống phụ Betabacterium. Lên men lactic dị hình ít có