Luận văn Thử nghiệm tác dụng tăng cường miễn dịch in vitro của các chế phẩm cây trinh nữ hoàng cung

a những tế bào NK, gần như không gắn được IL-2 được như đã miêu tả và không hoạt hóa được tế bào T. Nhận xét này gợi ý rằng, phải có một cấu trúc phức tạp hơn để tạo nên bởi liên kết giữa IL-2Rβ với những protein khác, làm thay đổi cấu hình, từ đó dẫn đến thay đổi ái tính gắn dính với nó. Takeshita và cs đã chứng minh rằng IL-2Rγ có thể thực hiện được chức năng này. Quá trình hoạt hóa tế bào T gồm 3 bước: Bước 1: IL-2Rα và IL-2Rβ có thể tương tác với sự vắng mặt của IL-2. Chúng tạo thành phức hợp ái tính cao “giả”, có khả năng gắn IL-2. Số lượng vượt trội của IL-2Rα sẽ thúc đẩy sự cân bằng theo hướng tạo thành những phức hợp này. Thêm nữa IL-2R có ái tính cảo khởi động những tín hiệu vận chuyển, làm tăng sự tổng hợp IL-2Rα. IL-15 nhận biết IL-2Rβ có thể cạnh tranh (ganh đua) với việc tạo thành phức hợp này. Bước 2: IL-2Rγ sẽ gắn với phức IL-2Rαβ + IL-2 tạo thành IL-2 có ái tính cao. Bằng cách gắn với IL-2Rγ, IL-4, 7, 9, 15 có thể cạnh tranh âm với việc tạo thành IL-2R có ái tính cao. Bước 3: IL-2Rα bị giáng hóa, sự tổng hợp IL-2 bị giảm bớt. Phức hợp lúc này bị tách ra và tế bào lympho T mất nhạy cảm với IL-2. Các tế bào lympho T nghỉ chỉ có một ít chuỗi α và hầu như không có chuỗi β. Những receptor có ái tính cao với IL-2 là phức hợp αβγ có khả năng gây cảm ứng sự tăng trưởng các tế bào. Receptor có ái tính trung gian chỉ có chuỗi β đơn không hoạt hóa được tế bào lympho T. Như vậy tế bào biểu lộ IL-2Rβ và IL-2Rγ như tế bào NK, tế bào mono sẽ cảm ứng việc gắn IL-2R có ái tính trung gian trong khi những tế bào biểu lộ cả 3 (αβγ) như tế bào lympho T hoạt hóa sẽ biểu lộ receptor có ái lực gắn cao. Đa số những tế bào lympho T nghỉ, tế bào lympho B, LGL và mono không biểu lộ IL-2Rα nhưng chúng có thể xảy ra sự biểu lộ receptor này. Đa số LGL (Langer gramilan lymphocyte) biểu lộ chủ yếu IL-2Rβ và IL-2Rγ nhưng một số nhỏ dưới nhóm của LGL, 1% tế bào mono trình diện biểu lộ cả CD56 và IL-2Rα. Thêm IL-2 vào LGL sẽ tăng cường hoạt tính diệt của tế bào NK và dẫn tới sự hình thành LAK biểu lộ IL-2Rα. Ngược lại với việc ít biểu lộ IL-2Rα ở tế bào nghỉ bình thường, IL-2Rα được biểu lộ bởi những tế bào bất thường ở những bệnh nhân Leukemia; bệnh nhân tự miễn và liên quan với ghép dị gen. Thêm nữa, những bệnh nhân này, có tăng nồng độ IL-2Rα hòa tan trong huyết thanh được giải phóng từ tế bào hoạt hóa [46]. * Đáp ứng với IL-2 Khi tế bào lympho T bị kích thích bởi lectin hay kháng nguyên, một số tế bào sản xuất IL-2, một số trở thành đáp ứng với IL-2, hoặc vừa sản xuất vừa đáp ứng. IL-2 từ dịch nổi có thể được sử dụng bởi các tế bào lympho T hoạt hóa chứ không phải tế bào lympho T nghỉ. Các IL-2R trên màng tế bào lympho T hoạt hóa được xem như nơi đáp ứng của tế bào lympho với IL-2. Khoảng 6 giờ sau khi cho thêm một tín hiệu bên ngoài, các tế bào lympho bắt đầu biểu lộ các IL-2R. Song nếu không có IL-2 thì không có tăng sinh xuất hiện, các tế bào ở trong giai đoạn G1 (chỉ sản xuất IL-2). Số lượng IL-2R tăng tối đa sau 2 – 3 ngày và giảm thấp nhất sau 6 ngày (không phát hiện được). Khi ấy sự tăng trưởng ngừng, các tế bào giữ giai đoạn G1, kết quả này xuất hiện ngay cả khi có mặt IL-2 với nồng độ cao. Tuy nhiên, nếu bổ xung lần thứ hai một tín hiệu bên ngoài, lại kích thích sự xuất hiện với số lượng tối đa các IL-2R trên mặt tế bào, các tế bào này lại tăng trưởng khi có mặt IL-2. Hiện tượng này có thể lặp lại nhiều lần. Các tín hiệu cần để cảm ứng các receptor có ái tính cao với IL-2 bao gồm các kích thích ngoại sinh (các kháng nguyên hoặc các kích thích đa clon) và nhiều kích thích nội sinh. IL-2 được nhận dạng là một chất trung gian làm tăng sự biểu lộ các receptor có ái tính thấp với IL-2. Vì vậy nó gắn được ít IL-2 hơn các receptor có ái tính cao. Sự bổ xung IL-2 làm đẩy mạnh một số chức năng của tế bào lympho T trước khi xảy ra tăng sinh. Ngoài việc chế tiết IL-2, các lympho T hoạt hóa còn sản xuất các lymphokin khác kể cả các IFNγ, BCDF (B cell Diffrention Factor). * Chức năng của IL-2 - Tác dụng tự kích (autocrin): IL-2 được tiết ra từ tế bào Th hoạt hóa có tác dụng gây tăng sinh và biết hóa ngay trên bản thân những tế bào này. - Hoạt hóa Tc, Th: Giống như một yếu tố phát triển nó hỗ trợ cho sự tăng sinh và biệt hóa của những tế bào nào có receptor với IL-2. Lympho T có hai dưới nhóm Th và Tc. Khi được kích thích bằng kháng nguyên đặc hiệu hoặc mitogen, số lượng thực tế của chúng tăng lên. Sự kết hợp của IL-2 với receptor đặc hiệu của chúng gây tăng sinh và biệt hóa chức năng của những tế bào này. Vì thế, IL-2 rất cần cho sự phát triển của Tc là tế bào đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống virus và chống ung thư. Thêm nữa việc gắn IL-2 vào receptor trên không chỉ kích thích sự tăng sinh của tế bào này mà còn phóng thích thêm những lymphokin (cytokin) khác. Đặc trưng của đáp ứng này được duy trì bởi tương tác của kháng nguyên và các receptor đặc hiệu trên bề mặt tế bào T đáp ứng. - Hoạt hóa tế bào B đã được hoạt hóa: Lympho B sau tiếp xúc với PWM (Pokeweed mitogen) – một lectin thực vật gây phân bào đối với lympho B phụ thuộc T – cũng gây ra sự biểu lộ IL-2R. Sự tăng sinh của tế bào B do PWM đòi hỏi sự có mặt của IL-2 do tế bào Th1 cung cấp. Tuy nhiên các yếu tố khác như IL-4 cũng cần cho sự biến hóa của tế bào B thành tương bào sản xuất kháng thể. - Hoạt hóa tế bào NK: Tế bào NK có thể diệt một số tế bào ung thư nuôi cấy và tế bào nhiễm virus invitro. Tế bào NK ở người diệt tế bào K 562 và có thể đo được bởi việc đánh dấu tế bào đích với 51Cr. Lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy ít nhất trong 1 giờ với IL-2 thì thấy khả năng diệt của tế bào NK tăng lên đáng kể. Khi NK được xử lý với IL-2 sản xuất IFNγ làm tăng khả năng gây độc của tế bào này. * Các ứng dụng của IL-2 Trên bệnh nhân ung thư, người ta ứng dụng đưa IL-2 vào trị liệu nhằm làm tăng cường hệ thống đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân chống ung thư, Việc nghiên cứu IL-2 và IL-2R như là một dấu ấn cho theo dõi hiệu quả trị liệu ung thư vẫn còn tương đối ít và các kết quả vẫn chưa thống nhất. Sự tăng cao hàm lượng của IL-2 và IL-2R thường gặp ở một số bệnh máu ác tính (Waldmann TA. 1986) và các rối loạn tự miễn như lupus bản đỏ hệ thống, viêm đa khớp (Semanzato G. et al 1988). Trong UTVMH, các tác giả Lai NK. Et al (1991); Hsu M.M 1995; Tan GL. (1993) nhận thấy sự thay đổi hàm lượng IL-2 trong huyết thanh bệnh nhân có liên quan đến tiên lượng bệnh. IL-2R là dấu hiệu tốt cho sự theo dõi hiệu quả điều trị của bệnh nhân. Tóm lại, việc định lượng IL-2 trong huyết thanh và đặc biệt là trong dịch nổi nuôi cấy lympho bào bệnh nhân UTVMH nói riêng và ung thư nói chung giúp ta đánh giá hoạt động của hệ miễn dịch, đặc biệt là đáp ứng miễn dịch tế bào, qua đó đánh giá tiên lượng bệnh nhân. 1.3.2.2. Yếu tố hoại tử u - Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) Vào đầu thế kỷ 20 William Coley một nhà ngoại khoa đã quan sát thấy rằng những bệnh nhân ung thư bị nhiễm một số loại vị khuẩn nhất định thì khối u của họ có thể bị hoại tử. Với hy vọng rằng đây có thể là cứu cánh cho các bệnh nhân ung thư, Coley đã tiến hành tiêm cho các bệnh nhân ung thư nước nổi phân lập từ nuôi cấy một số vi khuẩn khác nhau. Những nước nổi nuôi cấy này được gọi là “độc tố Coley” gây ra được hoại tử chảy máu khối u nhưng lại có một số tác dụng không mong muốn do vậy mà không thể dùng chúng điều trị ung thư. Nhiều thập kỷ sau người ta mới biết rằng thành phần hoạt động của độc tố Coley chính là một lipopolysaccharide (nội độc tố) của thành tế bào vi khuẩn. Nội độc tố này tự nó không thể gây ra hoại tử khối u được nhưng thay vào đó nó kích thích đại thực bào sản xuất và giải phóng vào huyết thanh một yếu tố gọi là yếu tố hoại tử u alpha (TNFa). Cytokin này có tác dụng gây độc trực tiếp đối với tế bào u mà không có tác dụng đối với các tế bào bình thường. Cơ chế tác dụng gây độc đặc hiệu của TNFa đối với khối u cho đến nay vẫn còn chưa hiểu hết [20]. TNFa không chỉ có tác dụng gây hoại tử khối u mà còn đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của một đáp ứng viêm hữu hiệu có tác dụng thanh lọc các tác nhân gây bệnh khác nhau xâm nhập vào cơ thể. Cùng với IL-1, TNFa hoạt động trên rất nhiều các loại tế bào khác nhau bao gồm các tế bào T, tế bào B, bạch cầu đa nhân trung tính, các nguyên bào sợi, các tế bào nội mô, các tế bào tủy xương làm cho tế bào này chế tiết rất nhiều độc tố khác nhau cần thiết cho sự phát triển của một đáp ứng viêm hữu hiệu [33]. Tuy nhiên việc sản xuất TNFa là một con dao hai lưỡi, nó có thể dẫn tới những phản ứng có hại, đôi khi có thể gây tử vong. Vào cuối những năm 1980 Cerami và cộng sự đã cố xác định xem tại sao khi bị nhiễm một số ký sinh trùng, vi khuẩn và khối u lại dẫn đến tình trạng dị hóa mạnh gây gây suy mòn và đôi khi có thể dẫn tới sốc và tử vong. Các tác giả này đã phát hiện ra rằng có một yếu tố có nguồn gốc từ đại thực bào đã gây ra trạng thái suy mòn nói trên và họ gọi yếu tố này là yếu tố gây suy mòn. Việc clon hóa các gene mã hóa yếu tố hoại tử u alpha và yếu tố gây suy mòn đã cho thấy rằng hai yếu tố này hóa ra lại là cũng một protein nay cùng được ký hiệu là TNFa [21]. * Sinh học phân tử TNFα TNFα là một polypeptide có trọng lượng phân tử 17k Da, có oqr dạng dimer, trimer, hoặc pentamer tùy thuộc vào loại và phương tiện tách chiết. Những nghiên cứu invitro đã chỉ ra rằng ở chuột, thỏ và người, polypeptide được sản xuất như một tiền hormone không hoạt động. TNFα của người bao gồm 157 acid amin, ngược lại polypeptid của nó thêm 16 acid amin nữa. Gen TNFα tru khú ở nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 6 gần vùng gen của lymphotoxin được gọi là TNFβ, và những gen mã hóa kháng nguyên hòa hợp tổ chức [34]. TNFα được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào sau đó đi vào máu rồi đến các mô và cơ quan khác, TNFα còn được tổng hợp trong các tế bào giết tự nhiên (NK), các tế bào u hắc tố và một vài dòng tế bào ung thư. mARN của TNFα cũng được người ta xác định trong bạch cầu hạt, các lympho bào B, T và các tế bào sừng. Sự tổng hợp và bài tiết TNFα được kích thích chủ yếu bởi các độc tố vi khuẩn do hoạt hóa của các thụ thể CD14 và CD18. Ngày nay, người ta cũng xác định TNFα tiết ra từ tế bào mô mỡ, từ các vi tế bào đệm, các tế bào sao và từ nội mạc mạch máu [38]. * Sinh học phân tử thụ thể TNFα Giống như những cytokin khác, TNFα ảnh hưởng tới các tế bào đích qua trung gian những thụ thể đặc hiệu. Cho đến nay người ta đã xác định được hai loại thụ thể là p75 và p55. Phản ứng của TNFα với những thụ thể này làm hoạt hóa protein kina hay tyrosin kinase và protein G sau đó chuyển giao kích thích này đến cấu trúc nhân. Trong nhân tế bào có sự hoạt hóa hàng loạt những yếu tố sao mã đối với protein điều hòa và các enzyme cũng như tăng cường tổng hợp một số protein và cytokin. Tác dụng sinh học sau đó của TNFα tùy thuộc và từng loại tế bào đích và sự phối hợp với các cytokin khác như là IL-1 và IL-6. Các cytokin kích thích sản xuất các protein trong đoạn cấp và sau đó tăng cường hiện tượng thực bào, kìm hãm hoạt động của các enzyme phân hủy protein và một vài quá trình đề kháng. Thông qua sự tương tác với thụ thể xuyên màng mà TNF có thể kiểm soát sự sống còn hay làm chết tế bào thần kinh theo chương trình. Trọng tâm của các tác dụng đối ngược này là kết quả của sự hoạt hóa protein NF-κB. Hoạt hóa TNF qua thụ thể TNFR1 dẫn đến hiện tượng chết tế bào theo chương trình, ngược lại nếu TNF hoạt hóa qua thụ thể TNFR2 lại có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh qua con đường NF-κB [35] . Thụ thể TNFR1 có mặt ở hầu hết các mô trong khi đó thụ thể TNFR2 được điều hòa chặt chẽ và kết hợp chủ yếu với hệ miễn dịch. Thụ thể type 2 chỉ được hoạt hóa bởi TNF màng trong khi thụ thể type 1 được hoạt hóa bởi cả TNF màng và TNF hòa tan [48]. 1.3.3. Levamisole - thuốc điều trị suy giảm miễn dịch Levamisole (phenyl emido thiazole hay 2,3,5,6 tetrahydro - 6 - phenyllimidazo (2,1) thiazo) là chất kích thích miễn dịch được phát hiện từ năm 1971 bởi Andricec J.M và cộng sự. Khởi đầu levamisole được dùng làm thuốc chống giun sán, sau nhận thấy nó có tác dụng làm tăng các lympho bào T và có tác dụng phục hồi cân bằng hoạt động giữa lympho bào T hỗ trợ và lympho bào T ức chế vì vậy được sử dụng như chất điều biến miễn dịch [1], [43], [49]. Những nghiên cứu tiếp theo đã cho người ta thấy rằng phần sunfua trong công thức phân tử của chúng có liên quan tới tác dụng kịch thích miễn dịch. Từ đó là cơ sở để nghiên cứu cải tiến cấu tạo phân tử của các chất bằng tổng hợp hóa học để nâng cao kết quả kích thích miễn dịch. Các biệt dược NPT 16416; ADA 202 - 718 là các thiazol benzimidazole của levamisole đang được thử nghiệm [45]. Trên thực tế cũng như lâm sàng levamisole đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng. Đến nay levamisol vẫn là thuốc kích thích miễn dịch cổ điển mà các nghiên cứu đã làm sáng tỏ mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân tử. Vì vậy, Levamisol được sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi in vitro của công trình này, với vai trò là chứng dương [47]. 1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC Cây TNHC Crinum latifolium L. đã được nhân dân sử dụng để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung, ngoài ra còn được sự dụng để điều trị bệnh ung thư như ung thư vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt. Trong những năm qua đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu ở trong và ngoài nước về cây thuốc quý này [14], [17], [27]. Yui và cộng sự đã chứng minh alkaloid lycorin, hoạt chất chính từ cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L. có tác dụng kích thích tế bào lympho T trong ống nghiệm và trên sinh vật hoạt động phát triển. Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nước nóng từ lá cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 in vitro [40]. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, và cộng sự cũng đã tiến hành thử nghiệm gây ung thư trên chuột cống trắng Wistar 50 – 55 ngày tuổi, bằng cách cấy dưới da chất hóa học gây ung thư 20-methylcholantrene và tiến hành thí nghiệm cho uống dịch chiết bằng nước nóng của lá cây TNHC và kéo dài đời sống của súc vật mang u (53 ngày/73 ngày) [15]. Kết quả này cho thấy dịch chiết này đã làm chậm sự tăng trưởng khối u thực nghiệm. Ở Ấn Độ, tác giả Ghosal khẳng định một số alkaloid từ TNHC như crinafolin, crinafolidin đã được thử nghiệm với tế bào ung thư và cho kết quả dương tính [26]. Để chứng minh tác dụng của viên Crila, một loại thuốc được chiết xuất từ lá cây TNHC (đã được dung trên bệnh nhân u xơ tuyến tiền liệt và u xơ tử cung) có hỗ trợ điều trị ung thư (tác dụng tăng cường miễn dịch trên thực nghiệm, khả năng chữa tình trạng suy tủy xương của bệnh phóng xạ cấp, bán cấp và có thể loại bỏ được tác dụng phụ nặng nề của hóa trị liệu) hay không, Phan Thị Phi Phi và cộng sự trường Đại học Y Hà Nội đã sử dụng mô hình chiếu tia xạ bán cấp cho chuột nhắt để gây suy giảm dòng tế bào tủy và dòng tế bào lympho và tế bào diệt tự nhiên (NK-natural killers) rồi điều trị với viên Crila, sau đó đánh giá khả năng hồi phục dòng tế bào lympho T, tế bào NK (cả về số lượng và chức năng tiết hai cytokin chủ yếu của miễn dịch chống ung thư: IL-2 và TNFα), và khả năng hồi phục dòng tế bào tủy của những chuột bị chiếu tia gamma này [19]. Sự giảm sút nặng nề của dòng tủy và dòng lympho xảy ra ở chuột nhắt chiếu tia cấp, bán cấp là các biến đổi đã được các nhà nghiên cứu y học và thực hành lâm sàng khẳng định. Kết quả thu được của Phan Thị Phi Phi phù hợp với các tác giả đã được công bố trước đây. Khi nhận định bằng hình thái học, chủ yếu dựa vào kích thước tế bào thì không phát hiện được sự thay đổi của bạch cầu ái toan và nhất là bạch cầu diệt tự nhiên NK, nhưng khi sự nhận dạng được dựa trên dấu ấn miễn dịch (kháng nguyên CD16+/56+ của NK) rõ ràng, chính xác thì tia gamma đã làm NK giảm sút đặc biệt có ý nghĩa, cả trong máu ngoại vi và trong lách, với p đều dưới 0,001 [17]. Các tế bào NK được phát hiện vào những năm 1980, khi người ta thấy máu có khả năng gây độc với virus, với các tế bào máu gốc và tế bào ung thư. Dưới tác dụng của tế bào NK, các tế bào ung thư máu, myeloma, carcinoma, sarcoma, melanoma của người bị dung giải hay ức chế. Các chuột Beige có hoạt tính NK kém, rất nhạy cảm với bệnh ung thư máu. NK được chính thức xem như một quần thể chống ung thư mạnh của miễn dịch bẩm sinh không đặc hiệu vì không cần mẫn cảm trước với kháng nguyên. Chuột chiếu tia, uống viên Crila làm số lượng NK khôi phục về trị số sinh học. Các tế bào TCD4, TCD8 là các quần thể gây độc với virus và với ung thư thông qua 2 cytokin quan trọng nhất là IL-2 và TNF-α hay là trực tiếp gây dung giải tế bào ung thư và tế bào nhiễm virus. Liều tia xạ đã sử dụng trong thực nghiệm đã gây giảm có ý nghĩa đặc biệt toàn bộ các nhóm tế bào lympho, đặc biệt là dòng T và NK. Số lượng hai loại TCD8a (CD8α/α) và TCD8b (CD8α/β) đều giảm mạnh cả ở lách và máu ngoại vi. TCD8b là quần thể chủ yếu, chiếm đa số các tế bào tuyến ức chín và và tế bào T chín ở máu ngoại vi, được giới hạn trong MHC lớp 1, có thể đại diện cho TCD8 chín và có chức năng. Tế bào TCD8 (hay chủ yếu là TCD8b) là tế bào gây độc đặc hiệu chính với tế bào ung thư. Ở đây tia gamma không những gây giảm có ý nghĩa số lượng tế bào của những quần thể này mà chức năng của chúng cũng giảm mạnh, thể hiện bằng giảm IL-2. Do TNF-α có nhiều nguồn ngốc hơn (đại thực bào, tế bào Mast, tế bào lympho) nên hàm lượng nó vẫn duy trì được. Khi được điều trị bằng Crila, các quần thể tế bào lympho CD3, CD4, CD8a và CD8b, kể cả NK ở máu ngoại vi và ở lách được hồi phục cả số lượng, tỷ lệ % và cả chức năng chế tiết IL-2 về gần trị số sinh học. IL-2 có tác dụng làm tăng sinh và tăng biệt hóa tế bào lympho T, hoạt hóa Tc (T cytotoxic) và hoạt hóa đại thực bào, có vai trò quan trọng trong miễn dịch chống ung thư. Hàm lượng TNF-α được sản xuất từ nhiều loại tế bào. TNF-α có tác dụng hoạt hóa các đại thực bào, bạch cầu hạt và các tế bào gây độc, tăng cường sự dính của bạch cầu với tế bào nội mạc, gây gầy mòn, sốt, cảm ứng sự tiết protein pha cấp, kích thích sự tạo mạch máu, tăng cường sản xuất các phần tử MHC lớp 1. Tác dụng của TNF-α vì thế có trên 1 phổ rộng hơn, trong đó có cả tác dụng gây độc tế bào ung thư, tăng các phần tử MHC lớp 1 cho tế bào Tc hoạt động, nhằm tiêu diệt các tế bào ung thư. Khi dùng Crila để điều trị cho chuột chiếu tia thì các tế bào đều có xu hướng gây tăng chế tiết, đưa về trị số sinh học hay cao hơn của hai cytokin nghiên cứu là IL-2 và TNFα. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2012 đến tháng 12/2012. Các mẫu máu bệnh nhân được thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội. Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thu dịch nổi, chiết tách ARN và phân tích được tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội. 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.2.1. Bệnh nhân 10 ml máu được lấy từ bệnh nhân UTVMH giai đoạn trước điều trị tia xạ, hóa chất nằm tại khoa xạ 1 và xạ 3, Bệnh viện K Hà Nội từ tháng 3/2012, tuổi từ 12 đến 78 tuổi. 2.2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân * Tiêu chuẩn lâm sàng Bệnh nhân mới, được chẩn đoán xác định là UTVMH dựa vào kết quả giải phẫu bệnh của mô sinh thiết lấy từ khối u vòm họng. Các bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu này được xếp loại giai đoạn từ III đến IVB với T1-4N0-3M0 theo cách phân loại T.N.M và giai đoạn lâm sàng của Liên ban phân loại ung thư đầu, cổ Hoa Kỳ (American Joint Committee on Canner – AJCC) năm 1997 cụ thể. Giai đoạn II: gồm T1-2N0-1M0 Giai đoạn III: gồm T1-2N2 hoặc T3N0-2M0 Giai đoạn IVA: T4N0-2M0 Giai đoạn IVB: T bất kỳ N3M0 * Tiêu chuẩn xét nghiệm Thể mô bệnh học được lựa chọn là thể ung thư biểu mô không biệt hóa (UCNT) dựa trên kết quả của phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh, bệnh viện K Hà Nội. 2.2.1.2. Các đối tượng không đưa vào nghiên cứu Các thể mô bệnh học khác ngoài ung thư biểu mô không biệt hóa. Các bệnh nhân ở giai đoạn I, II và có di căn (M1) trước khi được điều trị tia xạ lần đầu (quá muộn nên bệnh nhân thường xin về nhà). Các bệnh nhân tái phát hoặc đến khám định kỳ 2.2.2. Người bình thường 10 ml máu được lấy từ người khỏe mạnh về lâm sàng, tuổi từ 20 đến 60 là cán bộ, sinh viên trường Đại học Y Hà Nội. 2.2.3. Vật liệu nghiên cứu Thuốc viên nén Crilin T hàm lượng 250 mg/viên, được cung cấp bởi Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Công ty Thiên dược, Bình Dương, Việt nam. ARN của tế bào dòng chuẩn CTLL-2 và L929 làm chứng cho mARN của IL-2 và TNFα trong kỹ thuật RT-PCR được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Khoa Vi sinh, Sinh học tế bào và Khối u, Viện Karolinska, Stockhkolm, Thụy điển. Môi trường và dung dịch sử dụng Môi trường RPMI 1640, dạng lỏng có màu cam, trong, pH 7.4, bảo quản 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Môi trường RPMI dạng bột có thể sử dụng trong vòng 36 tháng kể từ ngày sản xuất. Cả hai dạng này đều bảo quản ở tủ mát 4 - 80C. Dung dịch sử dụng Dung dịch PBS (Phosphat Butffer Saline) Bảng 2.1. Thành phần dung dịch PBS Thành phần Hàm lượng NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g Nước cất vừa đủ 1000 ml Chuẩn pH đến 7.4 Hấp vô trùng dung dịch ở 1210C Bảo quản trong tủ mát 40C Dung dịch FBS (Fetal Bovine Serum) Dung dịch được sản xuất bởi GIBCOTM tại Mexico đạt tiêu chuẩn nhập khẩu của USDA. Dung dịch FBS đã qua các thử nghiệm kiểm tra tính chất, đảm bảo không có sự hiện diện của mycoplasma, virus và nội độc tố. Bảo quản ở tủ lạnh 4oC Dung dịch tách lympho: Ficol 1.070 (GE heathcare, Bjorgatan 30 751 84 Uppsala, Sweden) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nuôi cấy tế bào lympho 10 ml máu chống đông EDTA của người thường hoặc bệnh nhân ung thư vòm họng giai đoạn III, IV chưa điều trị được nuôi cấy theo quy trình sau: 10 ml máu chống đông được pha loãng gấp đôi với môi trường RPMI Chuyển máu đã pha loãng sang ống nghiệm nhựa Falcon 50 ml Cho 10 ml ficoll xuống đáy ống nghiệm Ly tâm 3000 vòng/phút x 20 phút, ly tâm lạnh (nhiệt độ 40C) Hút lấy vòng bạch cầu lympho chuyển sang ống nghiệm mới 10 ml Rửa tế bào lympho bằng RPMI hoặc dung dịch PBS, ly tâm 1200 vòng/phút trong 10 phút, tiến hành rửa 2 lần Tái hòa tan tế bào trong môi trường RPMI (bổ sung đủ 1000ml) Đếm tế bào: 1 giọt tế bào + 1 giọt xanh trypan để phân biệt sống chết. Nhỏ 1 x 106 tế bào vào các giếng của phiến nhựa, mỗi mẫu bao gồm 8 giếng (4 giếng IL-2, 4 giếng TNFα) Nhỏ thuốc vào các giếng: chứng âm, chứng dương (levamisole), Critin T liều thấp (nồng độ 0,25mg/ml), Critin T liều cao (0,5mg/ml). Đặt phiến nhựa vào tủ ấm có 5% CO2, theo dõi thu hoạch tế bào ở các thời điểm thí nghiệm: thu hoạch giếng để phân tích TNFα trong 4 giờ, thu hoạch giếng để phân tích IL-2 trong 8 giờ. Hút RPMI có tế bào và cho vào các ống nghiệm nhựa 5ml Ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút Chuyển dịch nổi sang ống nghiệm mới (5ml) bảo quản - 200C Rửa cặn tế bào bằng ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút trong PBS Cặn tế bào được bảo quản trong tủ -20oC đến khi tách ARN. 2.3.2. Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho Số lượng bạch cầu và các dòng tế bào bạch cầu lympho được tiến hành trên máy phân tích huyết học tự động KX - 21 của hãng Sysmex (Nhật Bản). Nguyên lý: Đếm tế bào trên dòng chảy theo kích thước tế bào. Tiến hành: Máu toàn phần được chống đông bằng EDTA, sau đó dựa vào máy phân tích tự động, sau một phút cho kết quả nhiều thông số trong đó có số lượng bạch cầu và số lượng dòng bạch cầu lympho (lấy máu xong làm ngay trong 6 giờ đầu). 2.3.3. Chiết tách ARN từ tế bào nuôi cấy Kỹ thuật chiết tách ARN được sử dụng theo hóa chất Trizol (Invitrogen Life Techonologies, Hoa kỳ), theo quy trình hướng dẫn bởi công ty gồm các bước như sau: Phá vỡ tế bào Cho 1ml dung dịch Trizol vào ống Eppendorf 1,5 ml có chứa cặn tế bào lympho, trộn đều bằng pipette và ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Tách lớp có chứa ARN Cho 0,2 ml choloroform, lắc đều trong 15 giây. Để hỗn hợp thu được ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở 40C. Hút lớp không màu ở trên cùng sang một ống eppendorf sạch để tủa ARN. Kết tủa ARN Cho isopropanol vào ống eppendof chứa ARN theo tỷ lệ thể tích (1:1), trộn đều và để hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở 40C, thu kết tủa ARN. Rửa ARN Cho 1 ml ethanol 70%, vortex để trộn đều cặn ARN. Ly tâm 7000 vòng/phút x 5 phút ở 4oC, thu kết tủa ARN và để vừa khô trong tủ hút thông khí. Hòa tan ARN. Cho 50 µl H2O khử ion không có RNase Trộn đều và để trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra chất lượng và số lượng ARN Xác định nồng độ ARN dựa trên giá trị OD260 và chất lượng dựa vào tỷ lệ OD260/280. Điện di ARN thu được để kiểm tra chất lượng về kích thước, độ đứt gãy của ARN tổng số. Bảo quản ARN ở -800C. 2.3.4. Tổng hợp cADN cADN được tổng hợp từ khuôn mẫu ARN theo quy trình của kit tổng hợp cADN SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Các bước như sau: Tổng thể tích 10 µl (0,3 µg ARN tổng số, 1 µl dNTPS 10 mM, 1 µl mồi ngẫu nhiên 0,5 µg/µl và H2O). Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 5 phút và làm lạnh trong đá trong ít nhất 1 phút. Bổ sung 9 µ