Luận văn Tinh sạch và đánh giá ảnh hưởng của hợp chất prodigiosin từ chủng serratia marcescens đến mạng lưới nội chất tế bào

iên cứu về khả năng gây chết, sự biến đổi hình thái biểu hiện của quá trình tự chết trên dòng tế bào ung thƣ dạ dày HTG – 1 bằng phƣơng pháp MTT (3-(4,5 – dimethylthiozol – 2-yl)-2,5- diphenyl tetrezolium bromide), sự phân mảnh của DNA, nhuộm Hoechest 13 33342 và nghiên cứu về cấu trúc sợi actin. Các tế bào đƣợc xử lý với Pg đã cho thấy có sự sụt giảm số lƣợng tế bào bởi quá trình apoptosis. Phân tích hình thái tế bào xử lý bằng Pg cho thấy Pg gây ra co rút tế bào, ngƣng kết nhiễm sắc thể, cấu trúc lại sợi actin, tách rời các tế bào từ chất nền nuôi cấy.Từ các kết quả trên cho thấy Pg tác động tới quá trình apoptosis trong tế bào ung thƣ dạ dày HTG – 1và Pg có khả năng đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc hóa trị liệu mới [15]. Năm 2009, Eric và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm, đặc tính dƣợc lý của của Pg và các dẫn xuất của Pg, bao gồm các dẫn xuất Pg tổng hợp mới có độc tính thấp hơn nhƣ GX15-070(Obatoclax)[39]. Cơ chế đích phân tử của các hợp chất này đã cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị lâm sàng. Năm 2012, Mu-Yun Pan và cộng sự tại Viện Khoa học y sinh Đài Loan đã chỉ ra rằng Pg làm chết tế bào ung thƣ bằng cách gây ra stress lƣới nội chất dẫn tới apoptosis [30]. Các con đƣờng kích hoạt phản ứng stress lƣới nội chất đƣợc Renata Sano và John C. Reed thảo luận chi tiết trong “ER stress – induced cell death mechanisms”[40]. Năm 2017, Yenkejeh và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính của Pg trên dòng tế bào ung thƣ tế bào gan (HepG2) ở ngƣời và quan sát sự biến đổi hình thái tế bào, số lƣợng tế bào, ức chế tăng trƣởng, biểu hiện sống sót, kích hoạt caspase – 3, tỷ lệ apoptosis bằng kính hiển vi soi ngƣợc, buồng đếm tế bào, phƣơng pháp MTT, Reverse Transcription – PCR, kiểm tra enzyme miễn dịch huỳnh quang. Kết quả cho thấy sau prodigiosin đã làm biến dạng tế bào và phá vỡ các kết nối tế bào. Đồng thời, hợp chất này ức chế tăng trƣởng và giảm hoạt động trao đổi chất, ức chế tồn tại của mRNA, tăng kích hoạt caspase-3 ở các tế bào HepG2. Từ đó có thể thấy sử dụng Pg là một hƣớng tiếp cận mới trong điều trị hƣớng đích ung thƣ gan [34]. Cơ chế điều chỉnh capase-3 của Pg cũng đƣợc làm sáng tỏ bởi Mohammad Reza Sam và Somayyeh Ghoreishi năm 2018 [41]. Năm 2019, Chee – HooYip cũng đã thảo luận về triển vọng ứng dụng Pg trong phát triển thuốc kháng sinh, chống sốt rét và chống ung thƣ trong điều trị lâm sàng [24]. 14 Hiện nay, các nghiên cứu về prodigosin ngày càng nhiều và tập trung theo hƣớng: sàng lọc các chủng S. marcescens có hiệu suất sản xuất Pg cao; tối ƣu hóa quy trình lên men, tách chiết và tinh sạch Pg; thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào. Từ đó mở ra nhiều hƣớng thử nghiệm cơ chế đích phân tử của Pg trên các dòng tế bào ung thƣ khác nhau. 1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA PRODIGIOSIN LÊN MẠNG LƢỚI NỘI CHẤT 1.2.1. Mạng lƣới nội chất và hiện tƣợng ER stress Mạng lƣới nội chất (ER – Endoplasmic Reticulum) là hệ thống xoang dẹt gắn liền với màng nhân, tổng diện tích lƣới nội chất chiếm hơn một nửa tổng số màng nội bào trong tế bào nhân thực. Các xoang lƣới nội chất chứa cacbohydrate, glycoprotein, enzyme khử độc Dựa vào cấu tạo và chức năng, lƣới nội chất đƣợc chia thành hai loại: lƣới nội chất trơn – màng không gắn ribosome và lƣới nội chất hạt gắn các hạt ribosome. Trong đó, lƣới nội chất hạt đóng vai trò quan trọng trong việc đóng gói các protein của tế bào. Các ribosome trên bề mặt lƣới nội chất hạt tham gia vào quá trình xử lý và phân loại protein. Trong quá trình dịch mã tại ribosome, một peptide tổng hợp sẽ đƣợc định hƣớng đivào ER dựa trêntrình tự tín hiệu. Sau đó, chuỗi tín hiệu đƣợc phân tách, và protein đƣợc giải phóng vào khoang của ER. Protein sau khi đƣợc đƣa đếnER để hình thành cấu trúc có thể đƣợc tiết ra ngoại bào hoặc tồn đọng trong ER. Bất kể đích đến cuối cùng của protein là ở đâu, chúng cũng phải trải qua các quá trình khác nhau trong các xoang dẹt của lƣới nội chất. Chúng liên quan đến việc cuộn xoắn tạo thành cấu trúc bạc cao, tập hợp thành phức hợp đa đơn vị, hình thành liên kết disulfua, glycosyl hóa và bổ sung glycolipid. Khoảng một phần ba số protein trong tế bào là protein tiết, trong đó protein xuyên màng đƣợc trƣởng thành trong ER. Các chức năng của nó đòi hỏi môi trƣờng trong ER phải có tính oxy hóa và giàu canxi và các phân tử đóng vai trò cuộn xoắn protein khác. Nhu cầu về số lƣợng protein tiết và tốc độ tổng hợp protein tiết khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào. Đặc biệt là các tế bào có chức năng bài tiết, chúng có cấu tạo giàu ER để đáp ứng nhu cầu của cơ thể. Các protein tiết đƣợc cuộn xoắn bởi chaperones và các phân tử chuyển động khác, giúp gấp lại chính xác cấu hình ban đầu của chúng khi đi 15 qua ER. Tuy nhiên, đôi khi các tế bào có thể gặp phải các điều kiện bất lợi khiến việccuộn xoắn protein ER quá nhiều. Sau đó, các chức năng cuộn xoắn protein ER sẽ bị ảnh hƣởng bởi các nhiễu loạn khác nhau nhƣ nhiễm virus, ung thƣ, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đƣờng, viêm nhiễm, bệnh gấp protein và các sai lệch khác ở cấp độ tế bào. Điều này dẫn đến sự tích tụ của các protein không đƣợc cuộn xoắn hoặc cuộn xoắn sai trong lƣới nội chất, đƣợc gọi là stress ER. Hiện tƣợng stress lƣới nội chất đƣợc kích hoạt bởi nhiều yếu tố bao gồm thiếu glucose, sai hỏng glycoprotein, thiếu ion Ca2+ từ ống dẫn của lƣới nội chất, tồn đọngcác protein không đƣợc cuộn xoắn hoặc các protein cuộn gập sai trong xoang ER [35, 42, 43]. Những sự kiện trong tế bào nhƣ thiếu oxy, thiếu glucose, thiếu hụt ion Ca 2+ trong ER, stress oxy hóa, nhiễm virus và đột biến làm suy giảm protein có liên quan đến sự khởi đầu của stressER. Tuy nhiên, tế bào đã phát triển một cơ chế để phát hiện những thay đổi này và khôi phục cân bằng nội môi bằng cách kích hoạt các đƣờng dẫn truyền tín hiệu, đƣợc gọi là Unfolder Protein Respone (UPR). Quá trình này đƣợc bảo tồn từ nấm men sang ngƣời. Ban đầu, hệ thống UPR cố gắng khôi phục cân bằng nội môi bằng cách tạo ra phiên mã của các enzyme cuộn gấp, chaperone, các chất oxy hóa và giảm quá trình dịch mã protein. Trong trƣờng hợp thất bại của quá trình thích ứng này do stress kéo dài, UPR sẽ kích hoạt các con đƣờng chết theo chƣơng trình của tế bào để loại bỏ các tế bào bị stress ER nhƣ một quá trình sinh lý bình thƣờng. Nếu sự chết theo chƣơng trình này không kiểm soát đƣợc sẽ trở thành bệnh lý, dẫn đến mất tế bào ở các cơ quan thiết yếu [44]. Do đó, UPR là một quá trình cơ bản thiết yếu trong việc kiểm soát chất lƣợng của protein không chỉ trong giai đoạn stress ER mà còn trong điều kiện tăng trƣởng bình thƣờng. Tế bào động vật có vú phản ứng với stress ER bằng cách kích hoạt phản ứngcuộn gập protein trong lòng lƣới nội chất. Phản ứngnày đƣợc cảm ứng bởi hai loại proein: protein liên kết miễn dịch có tên là BiP (binding immunoglobulin protein) và GRP78 (glucose regulated protein 78). Các protein không đƣợc cuộn xoắn này khiến BiP tách khỏi các protein màng lƣới nội chất 16 là inositol requiring enzyme 1 (Ire1), PKR – like ER kinase (PERK) và activating transcription factor-6 (ATF6), từ đó kích hoạt các protein này[45]. PERK photphoryl hóa eIF-2α dẫn đến làm giảm dịch mã mRNA cục bộ, đồng thời làm tăng dịch mã của một số mRNA, bao gồm cả yếu tố phiên mã ATF6. ATF6 kích hoạt sự biểu hiện của một số gen bao gồm gen biểu hiện các chất vận chuyển axit amin, chaperone và homologous protein C/EBP (gọi chung là CHOP). CHOP cũng tạo ra biểu hiện của GADD34, liên kết với protein phosphatase 1 (PP1) để khử photphoryl hóa eIF-2α , do đó tiếp tục dịch mã.Ire1α có hoạt tính kép kinase và endoribonuclease. Khi Ire1α bị photphoryl hóa sẽ kích hoạt hoạt tính endoribonuclease để cắt nối Xbp1 mRNA, tạo ra yếu tố phiên mã hoạt động sXbp1. Khi kích hoạt Ire1α cũng kích hoạt con đƣờng Jun N – terminal kinase (JNK).Sau khi tách khỏi BiP, ATF6α chuyển đến khoang golgi và bị phân tách bởi protein nội bào tạo ra một yếu tố phiên mã hoạt động hòa tan (hình 1.4). Hình 1.4 Các con đƣờng truyền tín hiệu của phản ứng cuộn gập protein[45]. 17 Cả 3 con đƣờng truyền tin này phối hợp đồng bộ để tăng khả năng cuộn gập protein trong khoang lƣới nội chất bởi chaperone, giảm protein bị thiếu và giảm tải protein mới vào lƣới nội chất nhằm thiết lập lại sự cân bằng trong khoang bào quan này. Tuy nhiên, hiện tƣợng ER stress kéo dài làm tăng hàm lƣợng oxy hoạt động (ROS) trong lƣới nội chất và chuyển đổi bản chất thích nghi của phản ứng cuộn gập protein trong lƣới nội chất thành phản ứng chết tế bào, chủ yếu thông qua các con đƣờng trung gian của Ire1, JNK và PERK, yếu tố phiên mã CHOP (phiên mã các gen liên quan đến cái chết của tế bào và kích hoạt JNK) [40]. 1.2.2 Stress lƣới nội chất ở tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Nấm men Saccharomycescerevisiae có kích thƣớc hệ gen nhỏ (khoảng 12Mb trên tổng số 16 nhiễm sắc thể[45], thời gian thế hệ ngắn, hơn 40% trình tự gen bảo tồn ởnấm men đƣợc dự đoán là có mặt trong hệ gen ngƣời, các cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào ở nấm men hoặc trong các tế bào khối u tồn tại tƣơng tự với nhiều hơn hoặc ít hơn các chức năng trong tế bào ngƣời[47]. Do đó S.cerevisiae đƣợc sử dụng làm sinh vật mô hình của sinh vật nhân chuẩn trong nghiên cứu các khía cạnh sinh lý, sinh hóa, di truyền, và sinh học phân tử. Ire1α là protein xuyên màng loại I chức năng kép với các hoạt tính kinase protein Ser/Thr và hoạt tính endoribonuclease (RNase). Đây là nhánh cổ điển và đƣợc bảo tồn nhất của phản ứng cuộn gập protein trong khoang lƣới nội chất. Ban đầu, gen Ire1 đƣợc phân lập từ sàng lọc các đột biến di truyền của nấm menS. cerevisiae đƣợc biết đến nhƣ một đặc trƣng cần thiết cho sự biểu hiện của chaperones lƣới nội chất và thích nghi với stress lƣới nội chất trong nấm men. Sau đó, hai gen động vật có vú là Ire1α và Ire1β đã đƣợc xác định, với sự tƣơng đồng đáng kể với nấm men ở đầu C và phân nhánh ở đầu N. Ire1α và Ire1β khác nhau về trình tự axit amin vùng luminal không đƣợc bảo tồn, đặc biệt là liên quan đến protein BiP.Ire1α đƣợc biểu hiện rộng rãi ở khắp các tế bào, còn Ire1β chỉ biểu hiện giới hạn ở biểu mô ruột [48], hay niêm mạc đƣờng hô hấp [49]. Hai protein này khác nhau cả về mặt chức năng và tính đặc hiệu cơ chất theo miền RNase của chúng. Ire1α có miền 18 lumal ER – terminal, vùng xuyên màng và miền carboxy – terminal mang cả hoạt tính xúc tác kinase và RNase. Sau khi phân tách từ liên kết BiP, Ire1α làm giảm dần, chuyển nhóm photpho và kích hoạt RNase. Hoạt tính RNase của Ire1α rất cần thiết cho việc cuộn xoắn protein. Trình tự axit amin của vùng cảm biến, vùng kinase và vùng RNase trên Ire1α và Ire1β của con ngƣời có độ tƣơng đồng lần lƣợt là 48%, 80% và 61% so với nấm men [50]. Hoạt tính RNase của Ire1 ảnh hƣởng đến yếu tố phiên mã Hac1 mRNA ở nấm men và Xbp1 mRNA ở động vật có vú. Ire1α kích hoạt yếu tố phiên mã hộp Xbp1 thông qua một sự kiện nối exon không theo quy luật trong khi Ire1β làm giảm một phần sản phẩm dịch mã bằng cách cắt intron 28sRNA và Xbp1 [50]. Sau khi kích hoạt, Ire1α cắt intron ở nucleotide thứ 252 của mRNA Hac1 dịch chuyển khung đọc mã và xuất hiện một codon kết thúc mới trong trình tự mã hóa [51]. Hơn nữa, Ire1α hoạt hóa cũng làm tăng các gốc oxy hóa tự do (ROS) gây ra stress lƣới nội chất. Khi Ire1α hoạt hóasẽ làm tăng hàm lƣợng ROS trong tế bào dẫn đến stress ER. Sự mất cân bằng ROS trong tế bào gây ra cái chết của tế bào dẫn tới kết cục apoptossis [52]. Mặc dù chức năng của Ire1 rất đa dạng, tuy nhiên, chúng chủ yếu liên quan đến đáp ứng ER. Sự khác nhau về loại mô tế bào, thuộc tính bệnh lý, cƣờng độ stress và sự liên kết hay phân ly của các phân tử làm nhiệm vụ cuộn xoắn protein sẽ quyết định bản chất của hoạt động Ire1. Các phân tử protein màng ER linh hoạt này kiểm soát các chức năng khác nhau của tế bào, bao gồm sự hình thành tế bào, truyền tín hiệu, bài tiết và điều chỉnh nhiều bệnh mãn tính. Sự biểu hiện Ire1 trong tế bào phải đƣợc điều hòa một cách nghiêm ngặt vì sự biểu hiện quá mức Ire1α và Ire1β ở động vật có vú gây ra quá trình apoptosis [53]. Khi tình trạng stress càng nghiêm trọng, hoạt động của Ire1 càng tăng, điều này kích hoạt phân tử cảm ứng apoptosis và dẫn đến chết tế bào. Các cơ chế điều hòa khác nhau của Ire1α trong các điều kiện sinh lý và các mức độ căng thẳng khác nhau vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Việc sử dụng sinh vật mô hình là nấm men Saccharomyces cerevisiae giúp tiết kiệm đƣợc rất nhiều thời gian và chi phí nghiên cứu.Các kết quả 19 nghiên cứu của luận văn này sẽ góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật. 1.2.3. Ảnh hƣởng của prodigiosin lên mạng lƣới nội chất Prodigiosin kích hoạt cả ba nhánh tín hiệu của UPR gây ra stress ER. Pg ảnh hƣởng cục bộ với ER và gây ra tự thực bào. Năm 2012, Pan và cộng sự báo cáo rằng đích tác động của Pg là yếu tố phiên mã CHOP và gây ra stress ER trong nhiều dòng tế bào ung thƣ vú ở ngƣời bởi cơ chế này. CHOP đƣợc công nhận là một trong những trung gian phân tử trung tâm chịu trách nhiệm cho quá trình chết theo chƣơng trình của tế bào do stress ER. Việc ức chế BCL – 2 phụ thuộc CHOP là một bƣớc trung gian của Pg để gây ra cái chết tế bào qua trung gian stress ER [35]. Pg gây chết tế bào tự thực bào bằng cách kích hoạt con đƣờng JNK. Prodigiosin cũng điều chỉnh giảm đáng kể con đƣờng AKT / mTOR và gây ra hoạt động caspase – 3[40].Prodigiosin có tƣơng quan mạnh với calnexin – protein chaperone gắn màng ERliên quan đến stress ER [22]. Tự thực bào là một phản ứng tế bào quan trọng để duy trì cấu trúc và chức năng của ER. Thông thƣờng, tực thực bào có cả tác động tích cực và tiêu cực. Chẳng hạn, khi các tế bào ung thƣrơi vào stress ở các mức độ khác nhau, phản ứng stress ER cho phép sự sống của tế bào. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sựthực bàoquá mức gây chết tế bào thông qua các cơ chế khác hơn là chết theo chƣơng trình và chết tế bào hoại tử. Cheng và cộng sự (2018)đã quan sát thấy sự tích lũy của LC3 puncta, một dấu hiệu tự phát, tăng trong vòng vài phút sau khi ủ tế bào u nguyên bào thần kinh đệm với Pg. Họ đã phát hiện các dấu hiệu stress ER đƣợc điều hòa theo biểu thức BiP/ GRP78 và sXbp1 trong cả hai tế bào u nguyên bào thần kinh đệm U87MG và GBM8401[22]. Những kết quả này đã chứng minh rằng prodigiosin nằm trong ER và gây ra stress ER. Tác động đến phản ứng cuộn xoắn protein gây apoptosis đang là hƣớng đi tiềm năng trong nghiên cứu thuốc điều trị ung thƣ hƣớng đích. Trong nghiên cứu này, tôi cung cấp cơ chế prodigiosin gây chết tế bào nấm men 20 thông qua gây stress mạng lƣới nội chất bởi sự tác động đến protein màng Ire1 và sự biểu hiện của Hac1 mRNA. Những phát hiện của tôi trong luận văn này góp phần hiểu rõ cơ chế tác động của Pg đến tế bào nấm men, từ đó có cơ sở để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế ảnh hƣởng của Pg đến tế bào động vật và ngƣời. 21 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Nguyên liệu Chủng vi khuẩn S. marcescensVTCC910027 và nấm men KMY 1516 lƣu trữ tại phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các chủng đƣợc giữ giống trong ống thạch nghiêng trên môi trƣờng NA ở 4oC và bảo quản bằng glycerol 25% ở –80oC. 2.1.2 Hoá chất Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là có độ tinh sạch cao thuộc các hãng uy tín nhƣ: Pg (Sigma), PBS trypsin – EDTA0,025% (Gibco, Mỹ), cao nấm men, cao thịt, peptone, glycerol, NaCl (Meck), dầu lạc (Việt Nam). Các dung môi tuyệt đối đƣợc mua từ Trung Quốc: n-hexan, toluen, ethyl acetate, acetone. Các dung môi nhƣ EtOAc, MeOH, n-hexan, acetone đƣợc cất lại và làm khan trên hạt rây phân tử (3A, 4A) trƣớc khi sử dụng. 2.1.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy và đệm Thành phần một số môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu đƣợc pha theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Các thành phần môi trƣờng và đệm Tên môi trƣờng Thành phần SD lỏng 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 0,015% uracine SD đặc 2% glucose, 0,66% yeast nitrogen base, 2% bactoagar, 0,015% uracine NA 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; 15g agar; pH 7 NB 5g peptone; 3g cao nấm men; 5g NaCl; pH 7 – 7.5 Agarose 1,5% 1,5g agarose, 100ml TBE 1X 22 2.1.4 Trang thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Box cấy vi sinh clean beach Trung tâm chuyển giao công nghệ, Việt Nam Cân phân tích AB 240 Sartorius (Thụy Sỹ) Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc) Máy đo pH Metrohm (Thụy Sỹ) Máy lắc nuôi cấy Certomat HK(Đức) Máy li tâm lạnh Miikro 22R Hettich (Đức) Máy quang phổ UV – 2500 LaboMed Inc (Mỹ) Máy cô quay Buchi Buchi (Đức) Máy ly tâm Sorvall Legend XTR (Nhật) Nồi khử trùng ES – 315 Tomy (Nhật) 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hoạt hóavà lên men thu sinh khối chủng Serratia marcescens Chủng S. marcescens VTCC 910027lƣu giữ trong glycerol 25% ở - 80 oC đƣợc lấy ra đặt trong khay lạnh -20oC và chuyển vào buồng cấy. Dùng tăm vô khuẩn lấy một ít tế bào từ ống giống cấy ria 3 pha trên đĩa môi trƣờng NA thạch. Ủ đĩa ở 28oC trong 24 giờ sẽ xuất hiện khuẩn lạc màu đỏ. Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ nuôi trong 3ml môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu vừng, lắc 200 vòng/ phút ở 28oC trong 24 giờ. Nhân giống cấp 1 23 Dịchnuôi giống (3%) đƣợc chuyển vào các bình tam giác có mấu chứa 500ml môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi lắc ở 200 vòng/ phút ở 28 o C trong 24 giờ. Giống sau khi đƣợc nuôi cấy trong bình tam giác đƣợc kiểm tra mức độ đồng đều của tế bào bằng cách soi dƣới kính hiển vivà khẳng định mẫu là thuần khiết để chuyển sang nhân giống cấp 2. Nhân giống cấp 2 Chuyển 3% giống cấp 1 vào thiết bị lên men dung tích 3 lít chứa 2 lít môi trƣờng NB có bổ sung 2% dầu vừng, nuôi cấy lắc 300 vòng/phút ở 28oC trong 72 giờ, sau đó thu sinh khối để tách chiết Pg thô. 2.2.2. Hoạt hóa chủng nấm menKMY 1516 Chủng nấm men KMY 1516đƣợc hoạt hóa trên đĩa thạch môi trƣờng SD ở 28oC từ 3 đến5 ngày. Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào lọ chứa 3ml môi trƣờng SD có bổ sung 1% uracil, nuôi lắc ở 28oC trong 24 giờ. Tiếp 5% giống vào bình tam giác chứa 150ml môi trƣờng SD có bổ sung 1% uracil, tiếp tục nuôi ở 28oC trong 16 –18giờ. 2.2.3. Lựa chọn hệ dung môi tách chiết Prodigiosin Tách chiết prodigiosin từ chủng S. marcescens VTCC 910027 Chiết lần 1 Dựa theo phƣơng pháp của Shahitha và cộng sự 2012 [2]có cải biến. Sinh khối tế bào đƣợc cho vào lắc chiết trong acetone với tỉ lệ tế bào : acetone là 1 : 1 (w/v). Mẫu đƣợc chiết bằng cách lắc 150 vòng/ phút ở nhiệt độ 28oC trong 3 giờ, sau đó chuyển sang bình chiết để 15 phút cho lắng xuống. Bình chiết đƣợc phân thành 2 lớp: lớp dịch nổi phía trên là dung môi chứa Pg, lớp cặn phía dƣới là cặn tế bào còn lẫn Pg. Thu dịch nổi phía trên, phần bên dƣới còn lại mang đi ly tâm 4000 vòng/ phút/ 5 phút, thu dịch nổi, cặn đỏ còn lại mang đi chiết bằng acetone, lặp lại nhƣ ban đầu. Mẫu dịch chiết lần 1 và lần 2 đƣợc kiểm tra bằng TLC. Tra mỗi mẫu 3 l, chạy với hệ dung môi toluen : ethyl acetate tỉ lệ 1:1. Bản TLC cho thấy 24 với cùng thể tích tra mẫu, mẫu dịch chiết lần 1 các băng trong đó có băng đỏ ngang chuẩn Pg, đậm đặc hơn nhiều so với mẫu chiết lần sau. Chiết lần 2 Dịch Pg chiết trong acetone sau đó đƣợc rửa lại trong ethyl acetatetheo tỉ lệ thể tích 1:1, lắc đều trong phễu chiết, sau đó thêm 5 - 10 lần thể tích nƣớc so với mẫu để loại bỏ acetone tan trong lớp nƣớc phía dƣới. Nếu lớp dịch phía dƣới vẫn còn đỏ thì chiết lại trong 200ml ethyl acetate cho đến khi hết đỏ. Lớp dịch đỏ phía trên đƣợc ly tâm 4000 vòng/ phút/ 5 phút để thu lớp Pg tan trong ethyl acetate ở pha trên. Dịch chiết thu đƣợc đem đo OD535 để định lƣợng Pg. Dịch chiết Pg trƣớc và sau khi rửa, dịch loại acetone trong nƣớc cũng đƣợc giữ lại để TLC kiểm tra với hệ dung môi ethyl acetate : toluen tỉ lệ 1:1. 2.2.4 Xây dựng đƣờng chuẩn prodigiosin dựa trên mật độ quang Nguyên lý phƣơng pháp dựa trên kết quả đo OD (giá trị mật độ quang) ở bƣớc sóng 535 nm, đây là bƣớc song mà Pg hấp thụ tối đa. Đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa trên hàm lƣợng prodigiosin chuẩn (100 g/ml) đƣợc pha loãng ở các nồng độ khác nhau vfa đo ở bƣớc sóng 535 nm.. Đƣờng chuẩn prodigiosin đƣợc dựng dựa vào hàm lƣợng prodigiosin pha loãng và giá trị OD ở các nồng độ pha loãng đó. Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn prodigiosin y = 0.0562x - 0.0005 R² = 0.9923 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 1 2 3 4 O D 5 3 5 Nồng độ Pg (mg/L) 25 Pha ống Pg gốc 1 mg/ml: Cân 1 mg Pg hòa với 1 ml methanol. Từ ống gốc pha loãng với methanol ở các nồng độ khác nhau: 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 g/ml. Sử dụng máy quang phổ để đo hấp thụ ở bƣớc sóng 535 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang theo nồng độ Pg chuẩn và xác định đƣờng chuẩn. Từ đƣờng chuẩn tính toán hàm lƣợng Pg theo phƣơng trình y= 0,0562x- 0,0005 (Hình 2.1). 2.2.5 Tinh chế prodigiosin bằng phƣơng pháp sắc ký 2.2.5.1 Phương pháp sắc ký cột Cột silica gel với kích thƣớc 4x20cm đƣợc sử dụng để tinh sạch mẫu chứa Pg. Hạt silica gel(60g) đƣợc hòa tan trong methnol để tạo cột. Sau đó, cột đƣợc cân bằng với hệ dung môi toluen và n – hexan. Mẫu chiết ban đầu đƣợc đƣa lên cột silica gel. Mỗi phân đoạn thu 20ml. Ban đầu, mẫu đƣợc đƣợc đẩy bằng hệ dung môi toluen và n – hexan tỉ lệ thể tích 1:1 để loại các băng khác. Sau đó mẫu đƣợc thôi bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỉ lệ thể tích 9:1 và tiếp tục thôi với tỉ lệ 6:4. Cuối cùng, mẫu đƣợc thôi hoàn toàn bằng methanol. Mẫu thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra độ tinh sạch bằng chạy trên bản TLC. Các phân đoạn tƣơng đối sạch, không còn băng trên sẽ đƣợc gom lại để lên cột tinh sạch lần 2. Mẫu gom lần 1 đƣợc sử dụng để tinh sạch lần 2 cũng bằng cột silica gel 60F254. Mẫu đƣợc thôi bằng hệ dung môi toluen và ethyl acetate tỉ lệ thể tích 9:1. Sau đó đƣợc thôi tiếp bằng toluen và ethyl acetate tỉ lệ thể tích 1:1 và đƣợc thôi hoàn toàn bằng methanol. Từ đó các phân đoạn đƣợc kiểm tra, đánh giá độ sạch trên bản TLC. 2.2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng Nguyên lý: Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) dùng để tách các chất trong hỗn hợp, đƣợc tiến hành để cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là một lớp mỏng có các chất hấp phụ, thƣờng là silca gel, aluminium oxide, hoặc cellulose đƣợc phủ trên mặt phẳng một chất trơ. Pha động là một hệ dung môi đơn thuần hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ quy định. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển 26 trên lớp mỏng theo hƣớng pha động với tốc độ khác nhau. Kết quảthu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự phân tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. Cách tiến hành: Pg đƣợc đánh giá độ tinh sạch trên bản mỏng silica gel 60F254 dày 0,25mm với pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ silica gel. Dung môi sử dụng làm pha động là hỗn hợp dung môi ethyl acetate : toluen tỉ lệ thể tích 1:1. Sắc ký đồ đƣợc hiện màu bằng phƣơng pháp nhuộm iodine trong 5 – 10 phút. 2.2.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp Pg sau khi tinh sạch qua cột sắc ký silica gel đƣợc xác định độ tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Cơ sở lý thuyết: Phƣơng pháp HPLC dựa trên hiện tƣợng trong cùng một điều kiện, mỗi cấu tử trong hỗn hợp tƣơng tác với môi trƣờng xung quanh khác với tất cả các cấu tử khác. Sự phân tách đƣợc thực hiện ở cả hai pha, pha động là dung môi và pha tĩnh chứa trong cột chất rắn. Các bƣớc tiến hành: Dựa theo phƣơng pháp của Wang và cộng sự(2013). Pg tinh sạch đƣợc hòa tan trong methanol với nồng độ 0,3mg/ml. Sau đó 10 l của dịch này đƣợc đƣa vào bộ phận tiêm mẫu và hỗn hợp đƣợc đƣa lên cột bởi một dòng chảy liên tục của cùng một dung môi (pha động). Sự tách diễn ra trong cột có chứa những hạt sắc ký có diện tích bề mặt lớn. Các cấu tử trong mẫu liên tục tƣơng tác với pha tĩnh và di chuyển dọc trên cột với các tốc độ khác nhau. Khi những cấu tử lần lƣợt thoát ra khỏi cột và đi vào detector 535nm, ở đây tín hiệu đƣợc ghi lại, xử lý và chuyển ra ngoài một sắc ký đồ cho biết sự hiện diện của mỗi cấu tử dƣới dạng một peak. Khi đó lƣợng cấu tử có trong mẫu đƣợc tính toán dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak của nó. Hàm lƣợng Pg đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC. HPLC là quá trình tách một hỗn hợp chất trong cột sắc ký ở trạng thái lỏng. Các chất mẫu 27 phân tích phải đƣợc hòa tan trong một chất lỏng phù hợp, thƣờng chính làpha động chạy sắc ký. Các mẫu Pg đƣợc phân tích bằng HPLC với hệ dung môi pha động là MeOH : H2O gradient lần