Luận văn Tổng hợp, cấu trúc và hoạt tính độc tế bào của một số hợp chất benzothiazepine và 2 - Pyrazoline xuất phát từ 3-acetyl-4-hydroxy-n-methyl - 2(1h) - quinolone

len và cacbonyl. O+ O+ H+ R-C-H OH OH R-C-H O = = R-C-H H3C-C-Ar= O H+ H-H2C-C-Ar OH H2C=C-Ar OH -H+ R-C-H OH H2C=C-Ar OH + R-CH-CH2-C-Ar OHOH -H+ R-CH-CH2-C-Ar OH O Giai đoạn đề hiđrat hóa anđol: phản ứng có thể tạo thành enol hay cơ chế tạo thành cacbonyl tùy theo bản chất nhóm thế trong anđol.  Nếu ở nhóm OH là nhóm thế hút e thì proton sẽ ưu tiên tấn công vào C=O ở xa để tạo ra enol rồi chuyển hóa thành xeton α,β-không no.  Nếu ở gần nhóm OH là nhóm đẩy e thì proton sẽ ưu tiên tấn công vào nhóm OH và tách loại H3O+.  Với xúc tác bazơ: Giai đoạn anđol hóa: bazơ có vai trò hoạt hóa hợp phần metylen bằng cách chuyển thành cacbocation liên hợp, cacbocation này sẽ cộng hợp vào nguyên tử cacbon-cacbonyl của phân tử anđehit để tạo ra anion anđolat sau đó mới proton hóa thành anđol. Phản ứng anđol hóa axetanđêhit trong môi trường bazơ thì tốc độ của giai đoạn thuận (2) lớn hơn tốc độ của giai đoạn nghịch (1), điều đó được chứng minh khi tiến hành trong môi trường D2O thì không thấy đơtơri đi vào nhóm metyl. Trong khi đó phản ứng anđol hóa axeton trong D2O thì lại thấy đơtơri đi vào nhóm metyl. Nguyên nhân là do hiệu ứng điện từ và hiệu ứng không gian gây ra bởi nhóm metyl làm cho cacbanion khó tương tác với nguyên tử cacbon-cacbonyl. 14 Giai đoạn đề hiđrat hóa anđol: giai đoạn này xảy ra ngay tiếp theo giai đoạn cộng anđol nhờ tác dụng của xúc tác hay nhiệt độ khi đun nóng. Phản ứng xảy ra theo cơ chế E1 qua một cacbanion trung gian: R-CH-CH2-C-Ar= O R-CH-CH--C-Ar OH R-CH=CH-C-Ar +OH- -H2O -OH- OH O = = O Sản phẩm này thường kèm theo đồng phân cis- và trans- Tốc độ, khả năng phản ứng phụ thuộc vào xúc tác và bản chất của nhóm thế. Ảnh hưởng của nhóm thế diễn ra khá phức tạp vì hiệu ứng cấu trúc của hai giai đoạn nucleophin và tách là không giống nhau. Phản ứng ngưng tụ của anđêhit và xeton dị vòng thường diễn ra êm dịu hơn và cho hiệu suất cao hơn. Bằng cách này người ta cũng đã tổng hợp các xeton chứa nhân thơm khác có công thức chung như: OH OCH 3 CO-CH=CH-Ar OH OCH 3 CO-CH=CH-Ar Như vậy các xeton α,β-không no chứa vòng thơm hay dị vòng được tổng hợp khá nhiều và thuận lợi bằng phương pháp ngưng tụ giữa anđêhit và dẫn xuất axetyl với xúc tác axit hoặc bazơ, nhưng với xúc tác bazơ thì được dùng phổ biến hơn (thường dùng là piperiđin). 1.3. MỘT SỐ HỢP CHẤT DỊ VÒNG CHỨA NITƠ 1.3.1. Pirazolin 1.3.1.1. Tổng hợp các hợp chất 2-pirazolin sử dụng tác nhân phản ứng điazometan Phản ứng giữa este của axit cacboxylic ,-không no với điazometan tạo ra sản phẩm cuối cùng là các hợp chất 2-pirazolin. Phản ứng này đầu tiên tạo sản phẩm chính là các hợp chất 1-pirazolin, sau đó chúng tự tautomer hóa tạo sản phẩm bền hơn là 2-pirazolin theo sơ đồ: [51] 15 H COOMe HMeOOC CH2N2 N N MeOOC COOMe 1 2 3 4 5 N H N MeOOC COOMe 1 2 3 4 5 Bằng phản ứng giữa xeton α,β-không no với điazometan các tác giả [24, 56] cũng thu được sản phẩm chính ban đầu là các hợp chất 1-pirazolin, sau đó chúng xảy ra sự đồng phân hóa dưới tác dụng của nhiệt độ để tạo thành sản phẩm bền hơn về mặt nhiệt động là các hợp chất 2-pirazolin: CH2N2 O N N Ph O Ph N N H Ph O Ph Phản ứng của 2-aryliđen-3-phenyl-1-indanon với điazometan thực hiện bởi Mustafa và Hilmy [47] cũng tạo sản phẩm cuối cùng là các hợp chất 2- pirazolin: C H Ph O R CH2N2 Ph O N N R Ph O N N R H 1.3.1.2. Tổng hợp các hợp chất 2-pirazolin đi từ xeton ,-không no và dẫn xuất của hiđrazin Theo tài liệu [6]: Ar - COCH = CH -A r' H2N - NH -R N NAr Ar' R -H2O Phương pháp này thuận lợi để tổng hợp các dẫn chất kiểu 1,3,5-triaryl-2- pirazolin. Phản ứng thường được thực hiện trong dung môi etanol, metanol khan và xúc tác thường dùng là axit axetic [45, 48], hay trong axit axetic có mặt natri axetat hoặc chiếu xạ siêu âm, hiệu suất phản ứng tăng lên rõ rệt từ 76%-96% khi tăng nồng độ CH3COONa [31, 36, 41, 42, 57]. 16 Tùy thuộc vào gốc Ar, Ar’ và R tốc độ phản ứng sẽ đạt giá trị cực đại ở một giá trị pH xác định. Nếu pH quá thấp sẽ làm giảm khả năng phản ứng của các dẫn xuất hiđrazin do tạo muối, nếu pH quá lớn thì khả năng hoạt hóa nhóm cacbonyl trong xeton lại giảm. Tốc độ phản ứng còn phụ thuộc vào hiệu ứng không gian và bản chất nhóm thế liên kết với gốc R trong dẫn xuất hiđrazin [31, 42, 43]. Ngoài xúc tác thông dụng là axit hữu cơ ở trên, nhóm nghiên cứu [33] còn sử dụng xúc tác Amberlyst-15 trong phản ứng của xeton ,-không no với dẫn xuất hiđrazin tạo 1,3,5-triarylpirazolin với hiệu suất tốt (56-65%). Phản ứng thường được thực hiện trong dung môi toluen khan. Cơ chế phản ứng được các tác giả đưa ra như sau: Ar O Ar' RNHNH2 Ar N Ar' HN R + H O S O O polymer Ar N Ar' HN R H + O S O O polymer OS O O polymer Ar N Ar' N R H + H N N Ar' H R Ar N N Ar' R Ar H O S O O polymer+ Ưu điểm của xúc tác Amberlyst-15 là có tính chọn lọc lập thể cao, rẻ tiền, không độc hại và dễ xử lý, có thể tái sử dụng lại xúc tác này 4-5 lần sau khi rửa với toluen. 1.3.2. Benzothiazepin 1.3.2.1. Tổng hợp benzothiazepin đi từ xeton ,-không no Bằng phản ứng của các xeton ,-không no với o-aminothiophenol với xúc tác gallium(III)triflat, tác giả [50] đã tổng hợp được các hợp chất benzothiazepin: SH NH2 R2 R1 O + N S R1 R2 Ga(OTf)3 17 Bằng phương pháp sử dụng lò vi sóng, các tác giả [28] đã tổng hợp được các hợp chất 2-cacboxy-2,3-đihiđro-1,5-benzothiazepin theo sơ đồ: R1 R2 R3 NH2 SH R4 R5 R6 C O CH HC COOH + N S COOH HX HA R4 R5 R6 R1 R2 R3 HB Mont, KSF MW Một phương pháp rất cơ bản để tổng hợp 1,5-benzothiazepin đó là đi từ xeton ,-không no cho phản ứng với o-aminothiophenol khi sử dụng xúc tác axit [52]: SH NH2 Ar Het O H H+ N S Het Ar 1.3.2.2. Tổng hợp benzothiazepin đi từ β-đixeton Bằng phản ứng đóng vòng của β-đixeton với o-aminothiophenol trong dung môi DMSO, tác giả [23] đã tổng hợp được các dẫn xuất của benzofuroannelat-2-phenyl-1,5-benzothiazepin: X O OOH + SH NH2 DMSO O SN X X = H, Cl, F, OCH3 1.3.2.3. Tổng hợp benzothiazepin đi từ β,β-đimetylacrylic axit và este tương ứng Thực hiện phản ứng của β,β-đimetylacrylic axit và este tương ứng với o- aminothiophenol các tác giả [26] đã tổng hợp được các dẫn xuất của 1,5- benzothiazepin theo sơ đồ: R2 R1 COOR3 H + SH NH2 N H S R1R2 H H O N H S H O R2 R1H+ 18 1.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT DỊ VÒNG 1.4.1. Hoạt tính sinh học của 2-pirazolin Hoạt tính sinh học đáng chú ý của pirazolin: Ức chế sự phát triển của khối u [58], thuốc làm giảm hoạt động hệ miễn dịch của cơ thể [37], kháng nhiều loại vi khuẩn, nấm [11], chống co giật [49], chống viêm [19], chống ung thư [2, 27, 32, 44], chống đái tháo đường, chống trầm cảm [40], hạ huyết áp [59], chất chống oxi hóa [24], hoạt động ức chế cholesterol [35]... 1.4.2. Hoạt tính sinh học của dẫn xuất benzothiazepin Benzothiazepin và dẫn xuất của nó tạo thành một lớp quan trọng của các hợp chất dị vòng bởi nó có một loạt các tính chất trị liệu và dược lý [53]. Các dẫn xuất của benzothiazepin được sử dụng rộng rãi như thuốc giãn mạch [39], thuốc an thần [38], thuốc chống trầm cảm [30], hạ huyết áp [34], chống ung thư [55]. 19 Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG Các hợp chất được tổng hợp thông qua sơ đồ dưới đây: diphenylete 1/ NaOH 2/ HCl ArCHO, piperidine (1) (2) (3) (4) Etanol Reflux (5) Etanol Reflux NH CH3 COOEt COOEt N CH3 O CH3 OOH N CH3 O O O OH N OH CH3 O N S Ar SH NH2CH3COOH N CH3 O OOH Ar N CH3 O OH NN Ar NO2 CH3COOH p-NO2C6H4NHNH 2 Sơ đồ 1: Sơ đồ tổng hợp các hợp chất xuất phát từ N-metylanilin 2.2. TỔNG HỢP 4-HIĐROXI-6-METYLPIRANOQUINOLIN-2,5-ĐION (giai đoạn 1) NH CH3 + 2CH2(COOC2H5)2 to -C2H5OH N O CH3 O OH O 20 Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn 250 ml, cột vigrơ, sinh hàn thẳng, bếp điện, phễu lọc chân không. Hóa chất: N-metylanilin, đietylmalonat, điphenylete, đioxan. Cách tiến hành: Cho vào bình cầu đáy tròn cỡ 250 ml: 10,7 ml N- metylanilin, 32 ml đietylmalonat và 50 ml điphenylete. Lắp cột Vigrơ 20 cm và sinh hàn thẳng đun sôi hỗn hợp phản ứng khoảng 5h, đồng thời cất loại etanol ra khỏi hỗn hợp phản ứng cho tới khi không còn etanol sinh ra nữa. Để nguội hỗn hợp phản ứng đến khi có kết tủa tạo thành, rồi thêm vào hỗn hợp 50 ml đioxan và ete để loại hết điphenylete. Sản phẩm thu được là tinh thể hình kim, màu vàng và có tonc= 220 0C. Theo tài liệu [10], hợp chất này có nhiệt độ nóng chảy 220 - 2210C. 2.3. TỔNG HỢP 3-ACETYL-4-HYDROXY-N-METHYL-2(1H) QUINOLON (giai đoạn 2) N O CH3 O O OH N CH3 O OH COCH 3 + NaOH H2C HC H2C OH OH OH Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn, sinh hàn hồi lưu, bếp điện, phễu lọc chân không. Hóa chất: piranoquinolin, glixerol, NaOH, HClđặc, etanol. Cách tiến hành: Cho vào bình cầu huyền phù của 25g piranoquinolin tổng hợp được ở trên (0,103 mol) trong 321 ml grixerol và 32,1 ml dung dịch NaOH 40% (0,515 mol). Đun sôi hỗn hợp phản ứng trong vòng 1h. Để nguội rồi rót vào 642 ml nước lạnh. Trung hòa dung dịch bằng 51 ml HCl đặc cho đến khi kết tủa tách ra hoàn toàn (đến môi trường axit). Lọc hút và rửa sạch kết tủa bằng nước. Làm khô ở nhiệt độ 80oC và sau đó kết tinh lại bằng dung môi etanol. 21 2.4. TỔNG HỢP CÁC XETON α,β-KHÔNG NO (giai đoạn 3) Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn, sinh hàn hồi lưu, bếp điện, phễu lọc chân không,sắc kí bản mỏng. Hóa chất: 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on, piperiđin, etanol, anđehit thơm, N,N-đimetylfomamit (DMF). N O OH COCH 3 CH3 N O OH COCH=CH-Ar CH3 + + H2O PiperidinAr-CHO Cách tiến hành: Đun sôi hồi lưu suốt 40-60 giờ (tùy thuộc vào bản chất của anđêhit) hỗn hợp của 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on với anđehit thơm theo tỉ lệ mol 1:1 trong dung môi etanol và 4 giọt piperiđin làm xúc tác. Lúc đầu khi đun phản ứng tan hết, sau đó sản phẩm phản ứng được tạo thành và tách ra ở dạng kết tủa khi đang nóng. Lọc hút ngay khi còn nóng, kết tủa tách ra có thể kết tinh lại từ hỗn hợp dung môi N,N-đimetylfomamit:etanol (1:1) đến khi trên sắc kí bản mỏng silicagel cho một vết tròn gọn. 2.4.1. Tổng hợp 3-(4’’-hiđroxi-3’’-metoxyphenyl)-1-(4’-hidroxy-N-methyl- 2(1H)-quinolon-3’-yl)prop-2-enon Từ 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on (1,6275g; 7,5.10-3mol), 4- hydroxy-3-metoxybenzaldehyde (1,14 ml; 7,5.10-3mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu vàng với hiệu suất (52%), điểm nóng chảy 171-172oC. Xeton α,β-không no thu được: N CH3 O COCH=CH OH OH OCH 3 22 2.4.2. Tổng hợp 3-(4’’-hiđroxiphenyl)-1-(4’-hidroxy-N-methyl-2(1H)- quinolon-3’-yl)prop-2-enon Từ 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on (1,6275g; 7,5.10-3mol), m- hiđroxibenzađehit (0,915g; 7,5.10-3mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu vàng với hiệu suất 57% , điểm nóng chảy 164-165OC. Xeton α,β-không no thu được: N CH3 O COCH=CH OH OH 2.4.3. Tổng hợp 3-(4’’-metoxiphenyl)-1-(4’-hidroxy-N-methyl-2(1H)- quinolon-3’-yl)prop-2-enon Từ 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on (1,6275g; 7,5.10-3mol), p- metoxi benzanđehit (1,020g; 7,5.10-3mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu vàng với hiệu suất (70%). Xeton α,β-không no thu được: N OH CH3 O COCH=CH OCH3 2.4.4. Tổng hợp 3-(4’’-bromphenyl)-1-(4’-hidroxy-N-methyl-2(1H)- quinolon-3’-yl)prop-2-enon Từ 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on (1,6275g; 7,5.10-3mol), p- brombenzađehit (1,3875g; 7,5.10-3mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu vàng với hiệu suất 55% , điểm nóng chảy 165-166OC. Xeton α,β-không no thu được: 23 N CH3 O COCH=CH OH Br 2.5. CHUYỂN HÓA XETON α,β-KHÔNG NO ĐƯỢC TỔNG HỢP TỪ 3- ACETYL-4-HYDROXY-N-METHYL-2(1H)-QUINOLON THÀNH CÁC DẪN XUẤT BENZOTHIAZEPIN, 2-PYRAZOLIN 2.5.1. Chuyển hóa xeton α,β-không no tổng hợp từ 3-acetyl-4-hydroxy-N- methyl-2(1H)-quinolon thành một số dị vòng benzothiazepin CH3COOH + NH2 SH N O OH CH3 COCH=CH-Ar N O OH CH3 S N Ar (B1-B3) Dụng cụ: bình cầu đáy tròn, sinh hàn hồi lưu, bếp điện, phễu lọc chân không. Hóa chất: xeton α,β- không no, C2H5OH, CH3COOH,o-phenylenđiamin. Cách tiến hành: Đun hồi lưu 30-40 giờ hỗn hợp gồm 10-3 mol xeton ,- không no với 10-3 mol o-aminothiophenol trong dung môi etanol tuyệt đối và xúc tác là 5 - 7 giọt axit axetic băng. Sản phẩm tách ra được lọc hút và kết tinh lại trong dung môi thích hợp đến khi trên bản mỏng silicagel chỉ cho một vết gọn và tròn. 2.5.1.1. Tổng hợp 2-(4’’-bromphenyl)-4-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)-1,5-benzothiazepin (B1) Từ 3-(4’’-bromphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’-yl) prop-2-enon (0,384g; 0,001 mol), o-aminothiophenol (0,125g; 0,001mol), 30 ml rượu etylic, 5 giọt axit axetic, sản phẩm thu được là tinh thể màu trắng, hiệu suất (65%). 24 Benzothiazepin thu được: S N N OH CH3 O Br 2.5.1.2. Tổng hợp 2-(4’’-metoxiphenyl)-4-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)-1,5-benzothiazepin (B2) Từ 3-(4’’-metoxiphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl) prop-2-enon (0,319g; 0,001 mol), o-aminothiophenol (0,125g; 0,001mol), 30 ml rượu etylic, 5 giọt axit axetic, sản phẩm thu được là tinh thể màu trắng, hiệu suất (62%). Benzothiazepin thu được: S N N OH CH3 O OCH 3 2.5.1.3. Tổng hợp 2-(4’’-hydroxy-3’’-metoxiphenyl)-4-(4’-hydroxy-N-methyl- 2’(1H)-quinolon-3’-yl)-1,5-benzothiazepin (B3) Từ 3-(4’’-hydroxy-3’’-metoxiphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl) prop-2-enon (0,335g; 0,001 mol), o-aminothiophenol (0,125g; 0,001mol), 30 ml rượu etylic, 5 giọt axit axetic, sản phẩm thu được là tinh thể màu trắng, hiệu suất (62%). 25 Benzothiazepin thu được: S N N OH CH3 O OH H3CO 2.5.2. Chuyển hóa xeton α,β-không no được tổng hợp từ 3-acetyl-4- hydroxy-N-methyl-2(1H)-quinolon thành dị vòng 2-pyrazolin N CH3 O OOH Ar N CH3 O OH NN Ar NO2 p-NO2C6H4NHNH2 Etanol Reflux CH3COOH Dụng cụ: bình cầu đáy tròn, sinh hàn hồi lưu, bếp điện, phễu lọc chân không, sắc kí bản mỏng. Hóa chất: xeton α,β-không no, p-nitrophenylhidrazin, etanol,axit axetic. Cách tiến hành: Đun sôi hồi lưu hỗn hợp của 0,0005 mol xeton α,β-không no tương ứng với 0,0005 mol p-nitrophenylhidrazin trong 50ml etanol và có vài giọt axit axetic trong suốt 20 - 30 giờ. Sản phẩm tách ra ở dạng kết tủa ngay khi đun sôi hỗn hợp phản ứng. Lọc hút kết tủa và rửa bằng etanol lạnh. 2.5.2.1. Tổng hợp 5-(4’’-hydroxy-3’’-metoxiphenyl)-3-(4’-hydroxy-N-methyl- 2’(1H)-quinolon-3’-yl)-1-(4’-nitrophenyl)-2-pyrazolin (P1). Từ 3-(4’’-hydroxy-3’’-metoxiphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl) prop-2-enon (0,335g; 0,001 mol), p-nitrophenylhidrazin (0,0765gam; 5.10-4 mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu nâu nhạt, hiệu suất 45%. 26 2-Pyrazolin thu được: NO2 N O CH3 OH N N OH OCH3 2.5.2.2. Tổng hợp 5-(4’’-hydroxyphenyl)-3-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)-1-(4’-nitrophenyl)-2-pyrazolin (P2). Từ 3-(4’’-hydroxyphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl) prop-2-enon (0,305g; 0,001 mol), p-nitrophenylhidrazin (0,0765gam; 5.10-4 mol). Sản phẩm thu được là tinh thể màu nâu nhạt, hiệu suất 42%. 2-Pyrazolin thu được: NO2 N O CH3 OH N N OH 2.6. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA CÁC HỢP CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 2.6.1. Sắc kí bản mỏng Sắc ký bản mỏng được thực hiện với các bản mỏng làm từ silicagel 60 F254 tráng trên lá nhôm của hãng Merck (Đức). 2.6.2. Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất được đo theo phương pháp mao quản với máy xác định nhiệt độ nóng chảy STUART SMP3. 27 2.6.3. Phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại của các chất đo ở dạng ép viên với KBr trên máy Impact 410-Nicolet – Mỹ, hoặc được đo trên máy GX-Perkin Elmer-Mỹ tại các đơn vị: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam. 2.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC) được đo trên máy Bruker Avance – Đức 500 MHz tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội là TMS. 2.6.5. Phổ khối lượng (MS) Phổ MS của các hợp chất được đo trên máy phân giải cao AutoSpec Premier Instrument (WATERS, Mỹ) và máy sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS) 1100 LC-MSD Trap – SL (Agilent Technologies, Mỹ) trong dung môi metanol tại Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, máy Agilent 6310 ion trap tại Viện hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Quốc Gia Việt Nam. 2.7. THĂM DÒ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO [29, 54] Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha lỏng sẽ được sử dụng để thử độc tính. 28 Thử độc tế bào: 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3.104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI cho các dòng tế bào HepG2, KB. Mẫu thử được xử lý với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 2 µg/ml; 0,5 µg/ml. Ủ 370C, 5% CO2 trong thời gian 3 ngày. Giếng điều khiển gồm 200 µl dung dịch tế bào nồng độ 3.104 tế bào/ml, ủ tại 370C, 5% CO2 trong thời gian 3 ngày; thêm 50 µl MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp 370C/4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotomettet Genios TECAN. Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau: % Ức chế = 100% − OD mẫu thử − OD control (−) OD control (+) − OD control (−) .100 Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve. 29 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TỔNG HỢP CÁC CHẤT ĐẦU 3-ACETYL-4-HYDROXY-N- METHYL-2(1H)-QUINOLON Các hợp chất trung gian (I) và (II) đều là các chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy phù hợp với tài liệu tham khảo [46]. Các chất này thu được qua sơ đồ phản ứng: HN CH3 COOEt COOEt N CH3 O CH3 OOH N CH3 O O O OH diphenylete 1/ NaOH 2/ HCl (I) (II) 3.2. TỔNG HỢP CÁC XETON α,β-KHÔNG NO TỪ 3-ACETYL-4- HYDROXY-N-METHYL-2(1H)-QUINOLON Từ hợp chất 3-axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on (II) cho ngưng tụ với các anđehit thơm trong điều kiện của phản ứng Claisen-Schmidt (trong môi trường kiềm yếu) đã tổng hợp được một số xeton α,β-không no: N O OH COCH3 CH3 N O OH COCH=CH-Ar CH3 + + H2O PiperidinAr-CHO Với Ar: p-OHC6H4, p-CH3OC6H4, p-BrC6H4, 4-OH-3-CH3OC6H4. Phản ứng được thực hiện trong dung môi etanol và xúc tác là piperiđin. Vai trò của piperiđin là làm xúc tác cho phản ứng ngưng tụ mà thực chất là để kéo proton tách khỏi nhóm –COCH3 và chuyển nó thành cacbanion, từ đó tạo liên kết với C-electrophin của nhóm cacbonyl anđehit. Về cơ chế, phản ứng có bản chất là sự ngưng tụ andol-croton giữa một anđehit và một metyl xeton, xúc tác có thể là axit hoặc bazơ, sau khi loại một phân tử nước nhận được xeton ,-không no. 30 Phản ứng giữa dẫn xuất chứa nhóm metyl xeton và anđehit được biểu diễn theo sơ đồ: RCOCH3 + R'CHO RCOCH = CHR' + H2ORCOCH2 H C OH R' Xúc tác cho phản ứng là axit hoặc bazơ (cho cả hai giai đoạn tấn công nucleophin và tách nước tạo xeton ,-không no), nhưng nhìn chung xúc tác bazơ thông dụng hơn cả vì điều kiện phản ứng đơn giản và phù hợp với nhiều phản ứng kể cả với metyl xeton chưa no, thơm hay dị vòng. Tốc độ phản ứng phụ thuộc vào bản chất nhóm thế và hiệu ứng không gian. Khi dùng xúc tác axit, cơ chế phản ứng diễn ra như sau: R'CHO H R'CH = OH R'CH - OH C O CH3 H C CH3 OH C CH2 OH R R R -H R'CH = OH C CH2 OH R' C O CH2 - CH - R OH2 -H2O, -H RCOCH = CHR'R Khi dùng xúc tác bazơ, cơ chế phản ứng diễn ra như sau: RCOCH3 HO RCOCH2 -H2O RCOCH2 O CH R' RCOCH2 H C O R' H2O -HO RCOCH2 H C OH R' RCOCH C H R' -H2O Tỷ lệ mol các hợp chất metyl xeton và anđehit được sử dụng là 1:1. Thời gian phản ứng tùy thuộc vào cấu tạo các metyl xeton và anđehit, có thể từ 30-40 giờ đến 80-100 giờ. Lúc đầu khi đun hồi lưu, hỗn hợp phản ứng tan hết nhưng sau đó sản phẩm được tạo thành thường tách ra ở dạng kết tủa ngay khi đang sôi. Ở đề tài này chúng tôi dùng xúc tác bazơ yếu là piperiđin, đã thu được 4 xeton α,β-không no lần lượt là: 31 1/ 3-(4’’-hydroxyphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl) prop-2-enon N CH3 O COCH=CH OH OH 2/ 3-(4’’-metoxiphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl)prop-2-enon N OH CH3 O COCH=CH OCH3 3/ 3-(4’’-bromphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl)prop-2-enon N CH3 O COCH=CH OH Br 4/ 3-(4’’-hydroxy-3’’-metoxyphenyl)-1-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)prop-2-enon N CH3 O COCH=CH OH OCH 3 OH Các dữ kiện vật lý của các xeton α,β-không no tổng hợp được từ 3- axetyl-4-hiđroxi-N-metylquinolin-2-on được thể hiện ở Bảng 3.1. 32 Bảng 3.1: Dữ kiện vật lý của các xeton α,β-không no tổng hợp được từ 3- acetyl-4-hydroxy-N-methyl-2(1H)-quinolon Hợp chất tonc (oC) Rf* H% N CH3 O COCH=CH OH OH 164-165 0,6 57 N OH CH3 O COCH=CH OCH3 167-168 0,7 70 N CH3 O COCH=CH OH Br 165-166 0,64 55 N CH3 O COCH=CH OH OCH 3 OH 175-176 0,72 63 3.3. CHUYỂN HÓA XETON α,β-KHÔNG NO THÀNH CÁC DẪN XUẤT DỊ VÒNG CHỨA NITƠ 3.3.1. Tổng hợp các hợp chất 2-aryl-4-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)-1,5-benzothiazepin 3.3.1.1. Về phản ứng tổng hợp Phản ứng được thực hiện bằng cách đun hồi lưu hỗn hợp đồng phân tử gam của xeton α,β-không no với o-aminothiophenol trong dung môi etanol tuyệt đối, với sự có mặt của axit axetic băng làm xúc tác. Cơ chế phản ứng xảy ra như sau [22]: 33 N S R R' SH NH2 R O+ .. R' + S NH2 C R' H CH O R .. + - H (+) (-) S NH2 C R' H CH2 O R.. S N C R' H CH2 O R (-) H H (+) S N C R' H CH2 OH R H .. H+ - H2O S N C R' H CH2 R H -H+ (+) 3.3.1.2. Phổ IR của các hợp chất 2-aryl-4-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)- quinolon-3’-yl)-1,5-benzothiazepin Trên phổ IR của các 2-aryl-4-(4’-hydroxy-N-methyl-2’(1H)-quinolon-3’- yl)-1,5-benzothiazepin chúng tôi tổng hợp được có các băng sóng hấp thụ ở 1628-1640 cm-1, đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O trong vòng quinolon. Điểm khác biệt dễ nhận thấy nhất giữa phổ IR của các benzothiazepin với xeton ,-không no ban đầu đó là sự mất đi băng sóng hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C=O xeton liên hợp với C=C ở tần số 1635-1685 cm-1 và các băng sóng ở tần số 990-960 cm-1, là tín hiệu đặc trưng cho dao động biến dạng của nhóm trans vinyl khi tham gia liên hợp với nhóm C=O. Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất 2-(4’’-metoxiphenyl)-4-(4’-hydroxy-N- methyl-2’(1H)-quinolon-3’-yl)-1,5-benzođiazepin (B2) 34 3.3.1.3. Phổ 1H NMR của các hợp chất 2-aryl-4-(4’-hydroxy-N-methyl- 2’(1H)-quinolon-3’-yl)-1,5-benzođiazepin Trên phổ 1H NMR của các benzothiazepin tổng hợp được đều thấy mất đi tín hiệu doublet dưới dạng hiệu ứng mái nhà đặc trưng cho chuyển dịch hóa học của nhóm trans vinyl trong các xeton ,-không no ban đầu, trong khi đó xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho 3 proton no trong vòng benzothiazepin, proton Ha cộng hưởng ở vùng δ=2,71-2,75 ppm, Hb cộng hưởng ở δ = 3,32-3,42 ppm, Hc ở δ = 5,25-5,34 ppm. Hình 3.2: Phổ 1H NMR của hợp chất 2-(4’’-metoxiphenyl)-4-(4’-hydroxy-N- methyl-2’(1H)-quinolon-3’-yl)-1,5-benzođiazepin (B2) Từ phổ 1H NMR của các hợp chất benzothiazepin ta thấy tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm OH trong các hợp chất có độ chuyển dịch hóa học tương đối lớn (14,76-14,77 ppm), điều này có thể giải thích như sau: proton của NCH3 N S O O H H3CO 35 nhóm C4-OH tạo liên kết hiđro nội phân tử với nguyên tử N của nhóm C=N trên vòng thiazepin, do vậy tín hiệu cộng hưởng của proton này dịch chuyển về phía trường yếu. 3.3.1.4. Phổ 13C của các hợp chất benzothiazepin Với mục đích quy kết chính xác các tín hiệu trên phổ 1H NMR của các chất trong dãy benzothiazepin và khẳng định lại cấu trúc xác định được trên phổ 1H NMR là đúng với công thức cấu tạo dự kiến, chúng