Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase

ôi trƣờng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4; KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10; tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợng 0,1% (v/v) bao gồm các muối: FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0 [36], [60]. Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợc bổ sung 100 g/ml ampicillin. 3.1.5 Dung dịch và đệm Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm Dung dịch Thành phần, nồng độ Dung dịch Bradford gốc 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml 88% phosphoric acid Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88% phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc Đệm điện di protein (biến tính) 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4 Đệm KP (K2HPO4) 0,1 M K2HPO4, pH 6,5 Đệm tra mẫu protein (biến tính) 5x 10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol Dung dịch I Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl Dung dịch II Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl Dung dịch III Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5 Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Dung dịch APS 10% ammonium persulfate Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide Dung dịch D 10% SDS; 25 mM EDTA Dung dịch nhuộm gel polyacrylamide 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch rửa PAGE 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid Dung dịch protease K 20 g/ml protease K Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Dung dịch RNase 10 g/ml RNase Dung dịch ampicillin gốc 100 mg/ml ampicillin Dung dịch nhuộm gel agarose 0,1 g/ml ethidium bromide Đệm TE 100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0 Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 Đệm cell lysis 10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0 3.2 PHƢƠNG PHÁP 3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6,5, lắc 200 vòng/phút trong 72 giờ. Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau 96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch enzyme thô. 3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase Định tính hoạt tính endoglucanase Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 đƣờng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng dung dich 1% lugol và đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thƣớc đƣờng kính vòng phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đƣờng kính vòng ngoài và d là đƣờng kính lỗ) [7]. Xác định hoạt độ endoglucanase Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợng đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ theo Miller (1959) [47]. Tiến hành Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút. Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy ra và đun sôi cách thủy 5 phút. Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng 540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn nồng độ glucose để suy ra lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc giải phóng ra. Dựng đƣờng chuẩn: Glucose đƣợc pha trong nƣớc cất với nồng độ chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml. 2 ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm nhƣ trên. Sau đó, mối tƣơng quan giữa độ hấp phụ và nồng độ glucose đƣợc xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1). Đƣờng chuẩn có phƣơng trình: y = 2,6411x - 0,0799. Trong đó: y - độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml) Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đƣờng khử tƣơng đƣơng 1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm. 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase 3.2.3.1 Thời gian nuôi cấy Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, dịch canh trƣờng đƣợc thu sau những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định hoạt tính endoglucanase. R² = 0.997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 O D 5 40 n m Glucose (mg/ml) y = 2,6411x - 0,0799 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 3.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, lắc 200 vòng/phút ở 25C, 28C; 30C, 32C và 37C; pH 7,0. Dịch canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính endoglucanase. 3.2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng cho quá trình sinh tổng hợp loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản pH 7,0, lắc 200 vòng/phút ở 30C, CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0,2-4%. Sau 96 giờ nuôi cấy, thu dịch nổi và xác định hoạt tính endoglucanase. 3.2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và nguồn cao nấm men đƣợc thay thế bằng các nguồn carbon khác (vỏ cà phê, glucose, vỏ lạc, vỏ quýt, lõi ngô, bã mía, saccharose, lactose, vỏ cám trấu, mùn cƣa, xơ dừa) với cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. Sau khi chọn đƣợc lõi ngô là nguồn carbon thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, lõi ngô đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0-5% (w/v) để xác định nồng độ tối ƣu. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 3.2.3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm nguồn carbon, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và các nguồn nitrogen (ammonium sulphate, urea, peptone) đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen khác với cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. 3.2.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 bổ sung 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm nguồn carbon và 0,3% ammonium acetate làm nguồn nitrogen, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH ban đầu thay đổi từ 3,0-8,0. Dịch nổi môi trƣờng đƣợc thu ở 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào. 3.2.4 Tinh sạch enzyme Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc đƣa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate, pH 7,5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn. Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn những phân đoạn có hoạt tính endoglucanase cao đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM NaCl, thôi mẫu bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình tinh sạch endoglucanase có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sơ đồ hình 2.2. Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột Sephadex G100 ↓ Cột DEAE ↓ Enzyme tinh sạch Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 3.2.5 Điện di SDS-PAGE Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của các dịch enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide theo Laemmli [44]. Thành phần gel điện di đƣợc thể hiện nhƣ bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein Thành phần Gel tách (l) Gel co (l) H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 Dung dịch D 60 20 APS 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel co và 25-28 mA cho gel tách. 3.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase 3.2.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp dùng xác định hoạt tính endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện với các nồng độ cơ chất từ 0,2-2% CMC pha trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hoạt tính enzyme đƣợc xác định sau 20 phút phản ứng ở 50C. 3.2.6.2 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt Hỗn hợp phản ứng của dịch enzyme (0,002 mg protein) với cơ chất 1,2% (w/v) CMC pha trong đệm potassium phosphate pH 6,5 đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-70C, trong 20 phút để tìm nhiệt độ phản ứng tối ƣu. Để xác định độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme đã tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30C đến 70C, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 24; 36; 48; 60 và 72 giờ. Hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp nêu trên với thời gian phản ứng là 20 phút ở nhiệt độ phản ứng tối ƣu. 3.2.6.3 Xác định pH phản ứng tối ưu và độ bền pH Để xác định pH phản ứng tối ƣu cho phản ứng xúc tác của enzyme nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ với cơ chất CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3,5-5,5 và 100 mM potassium phosphate, pH từ 6,0-8,0, hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 50C trong 20 phút. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trƣớc hết endoglucanase (0,002 mg protein) đƣợc ủ trong các đệm có pH thay đổi trong khoảng 3,5-8,0, trong 2 giờ ủ ở 37C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ. 3.2.6.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với 10-30% các loại dung môi hữu cơ: acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. 3.2.6.5 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa Dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ với 0,5-2% chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính endoglucanase. 3.2.6.6 Ảnh hưởng của ion kim loại Để đánh giá tính chất và mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ cùng với muối của các ion kim loại: Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+, Ni2+, Zn2+ và EDTA ở các nồng độ từ 5-15 mM ở 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định. 3.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.3). R² = 0.993 0.0 0.2 0.4 0.6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 O D 5 95 n m Hàm lượng protein (mg/ml) y = 2,5x - 0,0169 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 3.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 3.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của nấm sợi Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 72 giờ dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhanh, nhẹ trong cối sứ chứa nitrogen lỏng, sau đó đƣợc bổ sung 600 l đệm cell lysis và lắc nhẹ. Bổ sung 65 l lysozyme, ủ ở 37C trong 45 phút, cho 25 l protease K ủ ở 55C trong 2-3 giờ. Bổ sung tiếp hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với thể tích tƣơng đƣơng, trộn đều trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút. Hút 500 l dịch nổi chứa DNA sang ống eppendorf mới và bổ sung 500 l isopropanol. Hỗn hợp đƣợc đảo nhẹ và tủa DNA ở -20C Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 trong 2-3 giờ. Tủa sau khi ly tâm đƣợc làm khô bằng giấy thấm và bổ sung 500 l 70% ethanol để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô, hòa trong 40 l đệm TE và bảo quản ở -20C [54]. 3.2.8.2 Khuếch đại gene bằng PCR Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi NL1 (5-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3  ); NL4 (5 ’ -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3  ). Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 1 l DNA khuôn; 0,5 l mồi mỗi loại; 1,2 l 25 mM MgCl2; 1 l Taq polymerase; 1,6 l 2,5 mM dNTP; 2 l đệm PCR, bổ sung nƣớc cất lên tổng thể tích 20 l. Phản ứng thực hiện theo chu trình nhiệt: 95C/5 phút; 35 chu kỳ: 95C/1 phút, 50C/1 phút, 72C/1 phút; 72C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose. 3.2.8.3 Gắn dính DNA Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET 1.2/blunt đƣợc thực hiện theo protocol của hãng Fermentas. Hỗn hợp bao gồm: 2 l H2O; 5 l đệm gắn dính 2x; 0,5 l DNA blunting enzyme; 1,5 l sản phẩm PCR. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 70C trong 15 phút. Sau đó, lấy ra bổ sung tiếp 0,5 l vector pJET 1.2/blunt và 0,5 l T4-DNA ligase. Phản ứng gắn dính đƣợc thực hiện ở 22C trong 2-3 giờ để tạo plasmid tái tổ hợp. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 3.2.8.4 Biến nạp plasmid hóa học Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli DH5 đƣợc cấy chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37C qua đêm. 100 ml môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào đã nuôi qua đêm, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C. Khi OD600 nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc thu lại và đặt vào trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên. Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợc hòa vào 500 l dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ 40 l vào các ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -80C. Năm l plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 l dịch tế bào khả biến, ủ 20-30 phút ở 4C. Hỗn hợp đƣợc gây sốc nhiệt 45 giây ở 42C. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh, để 5 phút rồi bổ sung 250 l môi trƣờng LB đã khử trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp 200 vòng/phút trong khoảng 45-60 phút ở 37C với 50-200 l dịch tế bào đã biến nạp đƣợc cấy chải trên môi trƣờng LB đặc có chứa chất kháng sinh ampicillin, ủ qua đêm ở 37C. 3.2.8.5 Tách chiết DNA plasmid Mỗi khuẩn lạc biến nạp phát triển trên đĩa thạch đƣợc cấy vào ống nghiệm chứa 1,5 ml LB lỏng đã bổ sung 0,1% (v/v) ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37C, 200 vòng/phút. Tủa tế bào từ 1,5 ml dịch nuôi cấy (ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút) đƣợc lắc rung khoảng 30 giây trong 150 l Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 dung dịch I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm 150 l dung dịch II vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 l dung dịch III vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 450 l dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc rung và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. 450 l pha trên đƣợc hút sang ống mới, bổ sung 320 l isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid (ly tâm 15 phút với 13.000 vòng/phút) đƣợc rửa với 500 l 70% ethanol ở 4C để loại muối và isopropanol và đƣợc làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng tủa DNA plasmid đƣợc hòa trong đệm TE pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng, phân tích điện di, cắt bằng enzyme cắt hạn chế để kiểm tra phân đoạn chèn hoặc bảo quản ở -20C [54]. Sau đó, plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene cần tách dòng đƣợc biến nạp lại vào tế bào E. coli DH5, tách chiết và đƣợc tinh sạch theo protocol: bổ sung 0,25 l RNase vào dịch chứa plasmid, ủ ở 37ºC trong 1-2 giờ, lấy ra bổ sung 450 l H2O khử ion và đảo đều hỗn hợp. Tiếp đó, bổ sung 450 l chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 5 phút. Sau khi ly tâm 13.000/phút trong 15-20 phút, dịch nổi đƣợc hút sang ống eppendorf mới và bổ sung 500 l isopropanol cùng với 30 l dung dịch 3 M CH3COONa. Hỗn hợp đƣợc ủ ở -20ºC trong 15-20 phút, sau đó lấy ra ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Tủa đƣợc rửa lại 2 lần bằng 70% ethanol. Sau khi tủa đƣợc rửa sạch và làm khô sẽ đƣợc hòa trong 40 l H2O. Mẫu plasmid tinh sạch đƣợc sử dụng để giải trình tự nucleotide [54]. 3.2.8.6 Cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và XhoI trong 2 giờ ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm: 3 l DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 l enzyme cắt hạn chế mỗi loại; 2 l Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 đệm Tango Y+; bổ sung nƣớc khử ion đến tổng thể tích 10 l. Sau phản ứng, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra. 3.2.8.7 Điện di gel agarose Nguyên lí của phƣơng pháp này là dựa vào đặc tính của DNA là đại phân tử tích điện âm, dó đó trong môi trƣờng có điện trƣờng, các phân tử DNA có kích thƣớc khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng với tốc độ khác nhau. Bản gel agarose thích hợp cho việc làm giá đỡ phân tách các phân tử DNA. Điện di DNA hoặc plasmid đƣợc thực hiện trên gel 0,8% (w/v) agarose. Agarose đƣợc pha trong đệm 1x TBE, vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội xuống khoảng 60C và đổ vào khay điện di đã cài lƣợc sẵn. Khi gel đã đông ổn định thì gỡ lƣợc ra, đặt vào buồng điện di và tra mẫu. Sau khi chạy điện di xong, bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và nhuộm trong EtBr khoảng 3-5 phút, EtBr có thể cài xen vào trong DNA và phát sáng dƣới ánh sáng tia cực tím, do đó có thể phát hiện ra sự hiện diện của DNA. 3.2.8.8 Giải trình tự nucleotide Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3‘-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị dừng lại. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 3.2.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu Phần mềm Microsoft Excel đƣợc sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợc trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê. Chƣơng trình DNAstar đƣợc sử dụng để phân tích trình tự nucleotide, so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phân loại chủng nấm nghiên cứu. Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 4 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 4.1.1 Tuyển chọn Hai mƣơi sáu chủng A. awamori đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ thu dịch enzyme thô. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch để định tính hoạt tính endoglucanase và phƣơng pháp đo hoạt độ endoglucanase đã chọn đƣợc chủng A. awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori nghiên cứu (Hình 3.1, Bảng 3.1). Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc chọn để tối ƣu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất lý hóa của endoglucanase. Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori Chủng Hoạt tính Chủng Hoạt tính IU/ml Dhalo (mm) IU/ml Dhalo (mm) A. awamori VTCC-F-014 0,42 12,5 A. awamori VTCC-F-261 0,33 27,0 A. awamori VTCC-F-020 0,38 12,5 A. awamori VTCC-F-262 0,33 19,0 A. awamori VTCC-F-061 0,45 15,0 A. awamori VTCC-F-269 0,23 15,5 A. awamori VTCC-F-062 0,46 13,5 A. awamori VTCC-F-270 0,38 9,5 A. awamori VTCC-F-063 0,38 15,0 A. awamori VTCC-F-296 0,34 4,0 A. awamori VTCC-F-064 0,42 18,0 A. awamori VTCC-F-311 0,40 13,0 A. awamori VTCC-F-099 0,51 29,0 A. awamori VTCC-F-312 0,39 14,0 A. awamori VTCC-F-100 0,45 17,5 A. awamori VTCC-F-347 0,41 15,5 A. awamori VTCC-F-135 0,43 15,5 A. awamori VTCC-F-350 0,48 26,0 A. awamori VTCC-F-207 0,33 15,0 A. awamori VTCC-F-353 0,36 19,0 A. awamori VTCC-F-229 0,47 18,5 A. awamori VTCC-F-356 0,39 15,0 A. awamori VTCC-F-245 0,49 28,0 A. awamori VTCC-F-401 0,46 16,0 A. awamori VTCC-F-259 0,44 14,0 A. awamori VTCC-F-406 0,46 14,5 4.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA Sản phẩm tách chiết DNA tổng số của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả hình 3.2A cho thấy DNA tƣơng đối sạch, không bị gãy và đủ lƣợng đảm bảo cho các nghiên cứu nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và NL4, sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm thu đƣợc có kích thƣớc khoảng hơn 600 bp (Hình 3.2B). Sản phẩm PCR sau khi đƣợc gắn vào vector pJET 1.2 và biến nạp vào tế bào E. coli DH5 đã đƣợc tách plasmid và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và XhoI. Kết quả đã nhận đƣợc một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng hơn 600 bp (Hình 3.2C). Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). M: Marker. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách với số lƣợng lớn và làm sạch theo protocol của Sambrook và Russell (2001) để đọc trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi nghiên cứu đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 có chiều dài 614 bp (Bảng 3.2). So sánh trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng nấm nghiên cứu với một số trình tự gene