Luận văn Ứng dụng hplc để đánh giá hiệu quả xử lý amoxicillin và norfloxacin bằng vật liệu tio2 / sba - 15 trong nước thải bệnh viện

hất tan không bị lưu giữ trong cột tách, thì thể tích lưu của nó sẽ bằng thể tích của pha động chảy qua cột. Có thể tính được thể tích thực VSP của pha tĩnh ở trong cột sắt ký thông qua công thức: VSP = v0 – F.tR0 27 Trong đó: V0 : Thể tích trống toàn phần của cột sắc ký F: Tốc độ của pha động được bơm qua cột sắc ký (ml/phút) tR0 : Thời gian không lưu giữ 1.4.4.1. Hệ số dung lượng Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng. K’ = Trong đó: K’: Hệ số dung lượng tR: Thời gian lưu tổng cộng của chất tan t0: Thời gian không lưu giữ Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng. Trên thực tế K’ từ 1 – 5 là tối ưu. 1.4.4.2. Tốc độ pha động Tốc độ pha động: Được định nghĩa là số ml dung dịch pha động chảy qua cột tách trong một đơn vị thời gian, tức là số ml/phút của pha động. Tốc dộ thể tích của pha động luôn có liên quan đến tiết diện của cột tách. Tốc độ tuyến tính của pha động: Khái niệm tốc độ này sẽ cho ta biết trong một đơn vị thời gian thì pha động, hay một đĩa sắc ký của chất tan X trong cột tách di chuyển được bao nhiêu cm. Tốc độ này không phụ thuộc vào tiết diện của cột tách và cũng không phụ thuộc vào độ giảm áp trong cột tách theo chiều dài từ đầu cột đến cuối cột. 28 1.4.4.3. Số đĩa lý thuyết của cột sắc ký Số đĩa lý thuyết N trên 1 mét chiều dài cột sắc ký (N/1m) là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định, mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất tan X có chiều cao (bề dày) là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cấu tạo và bản chất của pha tĩnh, độ nhớt và tốc độ của pha độngVì vậy, với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau: Trong đó: tR: Thời gian lưu của chất phân tích W0,5: Độ rộng tại ½ của peak 1.4.4.1. Độ phân giải Để biết hai chất tan A và B được tách ra khỏi nhau đến mức nào, khi nó được rửa giải ra khỏi cột sắc ký thì cần phải xét thêm đại lượng độ phân giải R và nó được xác định theo công thức: K’ =2. Trong đó: - Các giá trị t’RA và t’RB là thời gian lưu thực của hai chất A và B - WA và WB là bề rộng đáy của pic sắc ký của hai chất A và B Theo điều kiện tối thiểu vừa đủ để hai chất A và B có thể tách ra khỏi nhau, theo quy luật phân bố Gauss và theo quy tắc Rayley, thì cực tiểu pic sắc 29 ký của chất A nằm gần nhất là ở vị trí cực đại của chất B (Hình 1.5) và đủ để tách hoàn toàn rõ ràng là cực tiểu phía sau pic của B kề với cực tiểu pic phía trước của A, tức là bề rộng đáy của hai pic A và B là: WAB ≥ (WA + WB) Hình 1.5 Giản đồ vè sự tách của hai pic sắc ký A và B Như vậy, nếu R càng lớn thì pic hai chất A và B càng cách xa nhau, khi này giữa hai pic sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký. Nếu đoạn đường nền này quá dài thì cũng không cần thiết vì như vậy sẽ tốn dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn, độ nhạy sẽ kém. Do đó giá trị R chỉ vừa đủ để tách hoàn toàn hai chất A và B ra khỏi nhau là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai pic vừa tách hẳn ra khỏi nhau dứt khoát là được, tức là WAB = (WA + WB). Trong thực tế, nếu các pic cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. 1.4.4.2. Hệ số bất đối xứng Hệ số bất đối Asys cho biết mức độ không đối xứng của pic sắc ký trên sắc ký đồ thu được. Hệ số này được tính bằng tỷ số độ rộng pic sắc ký ở nửa sau (b) và nửa trước (a) ở vị trí tương ứng với chiều cao bằng 1/10 của chiều cao cực đại (Hmax), công thức tính như sau: Trong đó: - a: nửa chiều rộng phía trước pic 30 - b: nửa chiều rộng phía sau pic - (cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic) Hình 1.6 Sự cân đối của pic HPLC Giá trị Asys càng gần 1, pic càng đối xứng. Khi Asys ≤ 2,5 thì phép định lượng được chấp nhận. Khi Asys > 2,5 thì điểm cuối của pic rất khó xác định, vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho pic cân đối hơn. 1.5. TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU TiO2/SBA-15 1.5.1. Giới thiệu chung về vật liệu TiO2/SBA-15 Ngày nay, xã hội phát triển cùng với sự bùng đổ dân số và tốc độ tăng trưởng đô thị hóa, công nghiệp hóa đã và đang tạo ra một sức ép lớn tới môi trường sống ở Việt Nam. Nền công nghiệp và dân số phát triển đòi hỏi một nguồn cung cấp nước phong phú và vững bền. Đi kèm với vấn đề đó là sự ảnh hưởng tới môi trường sống của con người, đặc biệt là môi trường nước. Trong đó, nhiễm bẩn hữu cơ đang là vấn đề được quan tâm hàng đầu của các nhà nghiên cứu. Chất thải hữu cơ chứa hàm lượng các chất hữu cơ khó phân hủy như các hợp chất vòng benzene, những chất có nguồn gốc từ các chất tẩy rửa, thuốc trừ sâu, thuốc kích thích sinh trưởng, thuốc diệt cỏ, hóa chất công nghiệp..., các chất có độc tính cao đối với sinh vật (gồm các loài sinh vật có khả năng lây nhiễm được đưa vào trong môi trường nước. Ví dụ như nước 31 thải của các bệnh viện khi chưa được xử lý hoặc xử lý không triệt để các mầm bệnh). Hiện nay, để xử lý chúng không thể sử dụng chất oxi hóa thông thường, mà cần phải có một vật liệu mới có khả năng oxi cực mạnh. Gần đây, việc sử dụng phản ứng xúc tác quang của các chất bán dẫn như TiO2, ZnO, CdS và Fe2O3.. cấu trúc nano để tạo ra các gốc có tính oxy hóa mạnh đang thu hút sự quan tâm trong lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. So với các chất xúc tác quang khác, TiO2 thể hiện các ưu điểm vượt trội do giá thành thấp, hiệu năng xúc tác quang cao, bền hóa học và thân thiện với môi trường. Tuy nhiên, nhược điểm của vật liệu TiO2 được điều chế theo phương pháp thông thường có diện tích bề mặt không lớn, hoạt tính xúc tác quang chỉ thể hiện trong vùng ánh sáng tử ngoại và độ phân tán của xúc tác trong hệ phản ứng dị thể không tốt. Nếu sử dụng TiO2 dưới dạng các hạt nano để làm chất xúc tác sẽ khó thu hồi sau phản ứng. Trong lúc đó, như một chất xúc tác lý tưởng, các vật liệu oxit silic mao quản trung bình , đặc biệt là SBA- 15 đã thực hiện tốt nhiệm vụ bởi chúng có diện tích bề mặt lớn, kích thước mao quản có thể điều chỉnh được, khung mao quản có độ trật tự cao và đặc biệt là trong suốt đối với tia UV. Các vật liệu xúc tác TiO2 thường được tổng hợp theo hai phương pháp là: tổng hợp trực tiếp từ các tiền chất Si, Ti trong sự có mặt của chất định hướng cấu trúc P123, môi trường axit và một số tác nhân khác hoặc tổng hợp gián tiếp bằng cách phân tán TiO2 trên chất nền SBA-15 [27]. Vì vậy, tổ hợp vật liệu TiO2/SBA-15 đã được rất nhiều nhà nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước chế tạo và ứng dụng vào các công trình nghiên cứu bởi nó có những ưu điểm như cải thiện được độ bền, độ đồng đều của cỡ hạt, khả năng điều khiển hình dạng và kích cỡ nano mét của hạt, khả năng độ hấp phụ, độ phân tán tâm xúc tác, khả năng tách, hoàn nguyên xúc tác. Chính vì những lí do trên nên TiO2/SBA-15 đang được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực xử lý môi trường, nó rất có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn. Tuy vậy, việc ứng dụng vật liệu này trong xử lý kháng sinh của 32 nước thải bệnh viện còn đang là vấn đề mới mẻ và cẩn thiết phải được nghiên cứu. 1.5.2. Ứng dụng của TiO2/SBA-15 trong xử lý môi trường Th.S Bùi Thị Mai Lâm đã nghiên cứu tổng hợp TiO2/SBA-15 theo phương pháp trực tiếp và ứng dụng trong xử lý các hợp chất hữu cơ ô nhiễm trong nước thải của vật liệu xúc tác quang TiO2/SBA-15. Kết quả ứng dụng cho thấy hàm lượng COD của mẫu chưa xử lý là 2272 mg/l trong mẫu nước thải của nhà máy dệt nhuộm thuộc loại rất ô nhiễm, không thể thải trực tiếp ra môi trường được. Chỉ số COD của mẫu sau khi xử lý là 368 mg/l, giảm đáng kể so với mẫu ban đầu. Điều này đã mở ra triển vọng đối với việc ứng dụng vật liệu nano tổ hợp trong việc xử lý môi trường dưới các điều kiện và nguồn sáng tự nhiên [27]. Xiaoling Ren cùng các cộng sự [28] đã nghiên cứu quá trình khử lưu huỳnh xúc tác (CADS) của mô hình nhiên liệu diesel bằng cách sử dụng TiO2/SBA-15 trong điều kiện nhẹ. Sự hấp thụ khử lưu huỳnh nồng độ cao từ 12,7 mg/g đã được giảm xuống nồng độ thấp ở 15 ppmw-S bởi TiO2/SBA-15. Kết quả động học cho thấy trạng thái cân bằng xúc tác CADS với TiO2/SBA- 15 đã đạt được nhanh chóng trong 0,5 giờ. Sự hấp thụ khử lưu huỳnh vượt trội ở dải nồng độ thấp, hoạt động ở điều kiện ôn hòa và chi phí tổng hợp chất hấp phụ thấp cho hệ thống CADS. TiO2/SBA-15 đã trở thành phương pháp khử lưu huỳnh hiệu quả và kinh tế để sản xuất nhiên liệu sạch. Ge Li cùng cộng sự [29] đã ứng dụng TiO2/SBA-15 trong quá trình khử quang xúc tác của Dimethoate dưới ánh sáng mặt trời mô phỏng. Kết quả cho thấy 26% TiO2/SBA-15 hoạt động xúc tác quang hóa cao nhất và dimethoate bị phân hủy hoàn toàn trong vòng 7 giờ. Hoạt tính xúc tác của TiO2/SBA-15 cao hơn 62% so với TiO2 tinh khiết. Các đặc tính hấp phụ và khử điện tử của SBA-15 là những lý do chính cho sự tăng cường quan sát được tốc độ phân hủy thuốc trừ sâu. TiO2/SBA-15 duy trì hoạt động xúc tác quang cao và ổn định tốt trong bốn chu kì với tỷ lệ phân hủy Dimethoate lớn hơn 94 %. Các sản phẩm phụ được tạo ra trong quá trình quang xúc tác được xác định bằng phương pháp sắc ký khối phổ. 33 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Thiết lập phương pháp phân tích kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin trong nước thải bệnh viện bằng HPLC. Đánh giá hiệu quả xử lý Norfloxacin và Amoxicillin có trong nước thải bệnh viện khi sử dụng vật liệu TiO2/SBA-15. 2.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu tập trung vào việc ứng dụng phương pháp sắc ký long hiệu năng cao – HPLC để đánh giá hiệu quả xử lý kháng sinh Amoxicilin và Norfloxacin bằng vật liệu xúc tác TiO2/SBA-15 trong nước thải bệnh viện sau xử lý. 2.2.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm: - Tối ưu hóa các điều kiện xác định kháng sinh Norfloxacin và Amoxicillin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Detector UV - Xây dựng quy trình phân tích mẫu nước thải bệnh viện - Đánh giá phương pháp phân tích 2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 2.3.1. Thiết bị STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số 1 Các bình chứa pha động (thể tích 1000ml) Chai thủy tinh đựng hóa chất Duran (Đức) 2 Cột sắc kí Nova-Pak C18 Water Kích thước 34 STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số (pha tĩnh) Column (4 µm; 150 × 3,9 mm) 3 Bộ phận khử khí Degasser DGU – 14A Shimadzu (Nhật Bản) C20924208780 4 Bơm cao áp Liquid pump LC – 10AD SP Shimadzu (Nhật Bản) 228-36501-38 5 Bộ phận tiêm mẫu tự động Auto injector Shimadzu (Nhật Bản) SIL-10AF 6 Hệ thống điểu khiển System controler SCL – 10A SP Shimadzu (Nhật Bản) C21014215064 7 Đầu dò Detector UV-Vis SPD-M20A Shimadzu (Nhật Bản) L20154908054 8 Bộ gia nhiệt và ổn nhiệt độ cho cột sắc kí Oven HIC – 10A Shimadzu (Nhật Bản) C21354100131 9 Thiết bị nhận tín hiệu và phần mềm điều khiển hệ thống Bộ PC cài đặt phần mềm Phần mềm do hãng Shimadzu (Nhật Bản) cung cấp L50184100123UT 10 Máy đo pH SevenCompact pH/Ion S220 Mettler – Toledo Group (Thụy Sỹ) 123215500 11 Máy siêu âm Ultrasonic Đức 901008129 35 STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số LC 60H 12 Giấy lọc thô Filter papers Whatman (Mỹ) 13 Giấy lọc PTFE 0,45µm Membrane Filter Startech (Đài Loan) 14 Đầu lọc PTFE 0,45µm PTFE Syring filter Finetech (Đài Loan) 15 Bơm hút chân không Neuburger Đức 02872831 16 Tủ sấy JSOF-150 Hàn Quốc 080314-02 17 Cân phân tích, độ chính xác 0,0001g. Balances and Precious Metal scales Sartorius (Đức) 18 Máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) Lambda 35 UV/Vis spectrometor Perkin Elmer 502508090202 19 Máy lắc Vortex mixer Labnet (Mỹ) Z1091318 20 Máy khuấy (2 máy) Hotplate Stirrer JSHS-18D JSR (Hàn Quốc) 1210101187U099 21 Máy li tâm Centrifuge Combi 514R Hàn Quốc NCBLC2211006 2.3.2. Dụng cụ - Micropipet 1-10µl; 10-100µl và 100-1000µl; - Pipet 1,00ml; 2,00ml; 5,00ml và 10,00ml; 36 - Bình định mức: 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml; - Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml; - Ống nhỏ giọt, bình tia nước cất, giấy bạc, con từ, lọ thủy tinh tối màu; - Xilanh 12ml/CC, 50ml/CC. 2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn 2.3.3.1. Chất chuẩn STT Tên chất chuẩn Số lô hiện hành Hãng Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Norfloxacin SLBF7610V Sigma- Aldrich ≥ 98 % 2 Amoxicillin SLBF8233V Sigma- Aldrich ≥ 98 %  Dung dịch đơn chuẩn Để có thể định lượng được Norfloxacin và Amoxicillin, việc chuẩn bị dung dịch gốc là rất cần thiết. Tiến hành cân chính xác 0,0100 ± 0,0001g từng chất chuẩn NOR và AMOX vào hai bình định định mức 100 ml tương ứng và ghi nhãn đánh dấu. Định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần và khuấy từ 24 giờ, thu được hai dung dịch gốc: NOR 100 mg/L và AMOX 100 mg/L . Dung dịch được đựng trong lọ thủy tinh tối màu 100 mL, đậy nắp kín và bảo quản lạnh sau mỗi lần sử dụng .  Dung dịch hỗn hợp chuẩn Dung dịch gốc hỗn hợp là dung dịch bao gồm NOR và AMOX đều có nồng độ là 100 mg/L. Dung dịch hỗn hợp chuẩn chuẩn bị như sau: Lấy lần lượt 50ml của từng dung dịch đơn chuẩn NOR (100 mg/L) và AMOX (100 mg/L) vào trong bình định mức 100 mL rồi đem lắc lên để hòa trộn đều. Dung dịch sau khi pha được đựng trong lọ thủy tinh tối màu 100 mL, vặn nắp kín và bảo quản lạnh mỗi lần sử dụng. 37 2.3.3.2. Dung môi pha động Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài liệu tham khảo để khảo sát lựa chọn ra dung môi thích hợp. Các dung môi sử dụng cho sắc ký luôn là những loại tinh khiết dành cho HPLC. Tiến hành pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ, để ổn định, lọc dung môi qua màng lọc PTFE 0,45 μm kết hợp bộ hút chân không và rung siêu âm trước khi sử dụng để loại bỏ bọt khí. STT Tên dung môi Tiêu chuẩn Hãng Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Acetonitrile Dùng cho HPLC Avantor (Mỹ) ≥ 99,9 % 2 Methanol Dùng cho HPLC Merk KGaA (Đức) ≥ 99,9 % 2.3.3.3. Hóa chất khác STT Tên hóa chất Hãng Nơi sản xuất Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 TiO2-SBA/15 2 Ortho-Phosphoric acid 85% Merk KGaA Đức ≥ 98 % 3 Triethylamine Merk KGaA Đức ≥ 99 % 4 Potassium dihydrogen phosphate Merk KGaA Đức 99,5 % 5 Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate Merk KGaA Đức ≥ 99 % 38 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Chuẩn bị mẫu Mẫu nước thải bệnh viện được lấy tại bể đầu ra sau hệ thống xử lý nước thải của bệnh viện. Mẫu lấy tại hiện trường được chứa trong bình thủy tinh tối màu và bảo quản lạnh. Mẫu sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm được lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ các chất rắn, cặn lơ lửng chứa trong mẫu. Sau khi lọc, mẫu được chuyển vào các lọ thủy tinh tối màu và bảo quản lạnh để phục vụ cho việc phân tích. 2.4.2. Khảo sát bước sóng phát hiện chất Xác định phổ UV của kháng sinh Norfloxacin và Amoxicilin bằng máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS). Tiến hành pha loãng 10 lần dung dịch gốc đơn NOR (100 mg/L), AMOX (100 mg/L) và dung dịch hỗn hợp chuẩn (100 mg/L) để có được dung dịch NOR (10 mg/L), dung dịch AMOX (10 mg/L) và dung dịch hỗn hợp chuẩn (10 mg/L). Đo lần lượt các dung dịch vừa pha loãng để xác định đỉnh cực đại hấp thụ (λ) của hai chất. Mỗi dung dịch đo lặp 3 lần và lấy giá trị trung bình. Lựa chọn bước sóng tại vị trí cực đại hấp thụ của AMOX và NOR để phục vụ cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo. 2.4.3. Qui trình vận hành hệ thống HPLC Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Đối với hệ thống HPLC đang sử dụng để phục vụ nghiên cứu tại phòng thí nghiệm, trước khi bật cần kiểm tra các chai đựng pha động, bổ sung pha động và nước cất nếu cần. Pha động luôn phải được siêu âm kết hợp bơm hút chân không để loại bỏ hoàn toàn bọt khí trước khi chạy máy. Kiểm tra và lắp cột chính xác đúng chiều chạy pha động, vặn chặt các đầu van để tránh sự rò rỉ của pha động. Bật nguồn điện cung cấp cho hệ thống máy HPLC-Shimadzu. Bật nút “Start” theo thứ tự: - Bơm cao áp (Pump) - Bộ khử khí (Degasser) 39 - Bơm mẫu tự động (Auto-injector) - Buồng ổn nhiệt cho cột phân tích (Oven) - Detector độ dẫn (Conductivity detector) - Bộ điều khiển (System controller) - Máy tính kết nối ghi nhận tín hiệu (PC) - Phần mềm ghi nhận và phân tích tín hiệu (LC solution) Trước khi chạy máy luôn phải loại bỏ bọt khí còn sót trong ống dẫn và bình chứa pha động bằng chế độ Purge bơm. Sau khi Purge xong, tạo Method và cài đặt chương trình chạy. Sau khi lưu Method, bật chương trình chạy để ổn định trước khi tiến hành phân tích tối thiểu 30 phút. Sau khi chạy phân tích mẫu xong, rửa hệ thống ít nhất 30 phút – 1 giờ và tắt lần lượt theo thứ tự ngược lại của thứ tự bật máy. 2.4.1. Khảo sát điều kiện tối ưu hóa hệ thống sắc ký 2.4.1.1. Lựa chọn pha tĩnh Qua các nghiên cứu trước đây, các tác giả chủ yếu lựa chọn cột pha đảo như: Agilent Zorbax SB-C18 (5 µm; 4,6 × 250 mm), cột C18 (Waters, Milford, USA, 25cm × 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm), cột Restek C18 (5 µm; 0,46 cm × 25 cm) và cột pha thuận như Lichrosorb C8 (10 µm; 20 cm × 4,6 mm),.. cho việc xác định Norfloxacin. Một số cột pha đảo để tiến hành định lượng Amoxicilin như Whatman ODS-3 (5 µm; 100 × 4,6 mmđược ), cột Agilent Zorbax SB-C18 (5 µm; 4,6 × 250 mm), cột RP-18e (100 × 4,6 mm), cột C18 (5 µm; 250 × 4,6 mm) Với điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, cột Nova-Pak C18 pha đảo (4 µm; 150 × 3,9 mm), dựa trên Silica của hãng Waters đã được lựa chọn để phân tích thành phần kháng sinh Norfloxacin và Amoxicilin trong nước thải bệnh viện. Loại cột này được kỹ thuật viên thường xuyên kiểm tra, vệ sinh và đánh giá tình trạng hoạt động. 40 2.4.1.2. Lựa chọn thể tích vòng mẫu Độ chính xác, độ đúng, lượng mẫu cần thiết nạp vào cột sắc ký không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng làm chân pic sắc ký doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu quá lớn thì hiện tượng doãng pic xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn pic trong quá trình tách. Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của peak sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà vẫn tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao pic sắc ký sẽ không tăng nữa và lúc đó pic sắc ký sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích cũng rất quan trọng. Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên pic có độ sắc nét cao và tránh doãng pic. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 40, 50, 100 μl trong đó vòng mẫu 20 μl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài này, để định lượng AMOX và NOR, thể tích vòng mẫu là 20 μl phù hợp với thiết bị nạp mẫu (injector) 20 μl đã được lựa chọn để phục vụ cho các công đoạn thí nghiệm. 2.4.1.3. Khảo sát chương trình pha động Một trong các yếu tố quan trọng nhất khi chạy HPLC chính là thành phần pha động. Nó quyết định dạng tồn tại và hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu chất phân tích. Dựa vào đặc tính lý hóa của các chất phân tích và các tài liệu tham khảo nghiên cứu trong và ngoài nước, tiến hành khảo sát 41 chương trình rửa giải gradient với các hệ pha động, bao gồm các dung môi (Acetonitrile, Methanol, nước) và các hệ đệm (sử dụng KH2PO4, Na2HPO4, H3PO4, Triethylamine để điều chỉnh đệm sao cho phù hợp với yêu cầu mong muốn) với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn hệ pha động cho ra tín hiệu kết quả tốt nhất. 2.4.1.4. Khảo sát tốc độ dòng Khi pha động đã có một thành phần phù hợp nhưng nếu tốc độ rửa giải của pha động không phù hợp thì cũng chưa có được kết quả tách sắc ký hoàn toàn tốt. Tốc độ pha động cũng là yếu tố quan trọng vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng pic, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo pic lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Tiến hành khảo sát tốc độ dòng: 0,8 ml/p; 0,9 ml/phút; 1,0 ml/phút; 1,1 ml/phút và 1,2 ml/phút với các thông số cài đặt chương trình. 2.4.2. Thẩm định phương pháp Sau khi khảo sát quá trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng Norfloxacin và Amoxicilin bằng HPLC- UV theo hướng dẫn của ICH và có tham chiếu theo quy định của AOAC. 2.4.2.1. Tính chọn lọc Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng, pic của chất phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn. 42 Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp NOR và AMOX ( nồng độ 0,1 mg/L ) với chương trình sắc ký đã lựa chọn trên nền mẫu chuẩn. Sắc ký đồ phân tích trên máy HPLC đối với mẫu trắng phải không cho tín hiệu tại thời gian lưu tương ứng với chất phân tích. 2.4.2.2. Tính thích hợp của hệ thống Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố máy móc thiết bị. Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu và diện tích pic có RSD ≤ 2 %. 2.4.2.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3. Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nến, thông thường lấy S/N = 10. Trong đó: S: chiều cao tín hiệu của chất phân tích N: nhiễu đường nền. Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất xác định được bằng sắc ký. Xác định tỷ lệ S/N. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng (chứa pha động), pha loãng mẫu chuẩn chứa hỗn hợp NOR và AMOX nồng độ 1,5 mg/L đến khi nào sắc ký đồ thể hiện chiều cao pic 43 khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị. Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOQ 2.4.2.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích dưới dạng: Y = aX + b Trong đó: Y là tín hiệu chất phân tích X là nồng độ chất phân tích Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau. Tiến hành pha một dãy các dung dịch chuẩn và thực hiện sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Thu thập kết quả về chiều cao pic, sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2016 để xây dựng phương trình hồi quy thể hiện mối quan hệ