Luận văn Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải theo thời gian nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng

. Nếu cả hai nguyên tử đều ở trạng thái cơ bản, lực London luôn là lực hút, hơn nữa, nếu các nguyên tử tương tác không phải là hình cầu đối xứng có phân cực đẳng hướng, định hướng tương đối của chúng sẽ ảnh hưởng đến sự tương tác (giống như sự phụ thuộc định hướng của FRET). Tương tác van der Waals đơn giản (không tính đến thế năng liên quan đến hiệu ứng Casmir theo lý thuyết của London giảm theo R6, trong đó R là khoảng cách giữa các nguyên tử; điều này cũng giống nhau khoảng cách phụ thuộc như FRET giữa hai phân tử huỳnh quang. Lý thuyết của J. Perrin và F. Perrin Mô hình J. Perrin (1925): Ông giả thuyết rằng việc truyền năng lượng kích thích có thể nhảy từ một phân tử tới một phân tử khác thông qua tương tác giữa các dao động lưỡng cực của các phân tử gần nhau. Theo lý thuyết cổ điển một phân tử kích thích sẽ dao động ở tần số  tương ứng với cường độ của năng lượng kích thích 9 Eexit= h, là sự sai khác giữa hai mức năng lượng. Các phân tử tương tác như trường dipole điện Hertzian (1888); Dipole Hertzian dao động như là một dipole tĩnh. Perrin giả định rằng nếu các phân tử được phân cách bởi khoảng cách đủ nhỏ, năng lượng có thể được chuyển cho phân tử acceptor không phát xạ. Ông gọi đây là ''transfert d'activation''. Mô hình F. Perrin F. Perrin (con trai của J. Perrin) là một trong những người tiên phong về huỳnh quang (1929), Ông mở rộng J. Perrin lý thuyết truyền giao năng lượng bằng cách phát triển một mô hình cơ học lượng tử (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Tuy nhiên, ông kết luận, cũng như J. Perrin, rằng tốc độ truyền tỷ lệ thuận với 1/R3; điều này dẫn đến việc truyền năng lượng ở khoảng cách dài hơn đã được tìm thấy bằng thực nghiệm. F. Perrin cũng xem xét tới va chạm giữa các phân tử huỳnh quang và các phân tử dung môi, cũng như hiệu ứng Doppler (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Những va chạm này mở rộng phổ sự hấp thụ và phát xạ của các phân tử, vốn J. Perrin giả thiết là hẹp để đảm bảo hiệu suất tương tác. Các hiệu ứng va chạm và Doppler như vậy là chủ đề của nhiều nghiên cứu quang phổ trong hai thập kỷ đầu của thế kỷ 19 và cũng đã được Kallmann và London nghiên cứu ở pha hơi. Các mở rộng quang phổ là quan trọng vì lý do sau đây. Năng lượng bị mất bởi donor chính xác bằng năng lượng thu được của acceptor. Mỗi phân tử chỉ có một xác suất va chạm nhất định. Điều này làm giảm khả năng cộng hưởng, bởi vì phải có hai lưỡng cực tương tác để có quá trình truyền năng lượng. F. Perrin đã sử dụng lý thuyết phổ va chạm mở rộng cho truyền năng lượng ở khoảng cách mới giảm xuống còn khoảng [(/ 2) (t/)]1/6 trong đó t là thời gian giữ hai lần va chạm;  là thời gian sống huỳnh quang Lý thuyết của Förster's. Trên cở sở các công trình của các nhà khoa học tiền bối Theodor Förster đã phát triển lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xuất bản và công bố qua hàng loạt công bố từ 1946-1951. 1.2.3. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET.[9,12] Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác sang một trạng thái cơ bản là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khi chúng được định xứ gần nhau. Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của quá 10 trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom. Sơ đồ của quá trình truyền năng lượnđg cộng hưởng mô tả như hình dưới: Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET Trong quá trình truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, phân tử huỳnh quang donor hấp thụ năng lượng tưng ánh sáng tới chuyển lên trạng thái kích thích.[9] Năng lượng kích thích này truyền cho phân tử huỳnh quang acceptor lân cận. Quá trình truyền năng lượng này tự nó sẽ làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) và tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang donor D + h → D*+ D* + A → D +A* A* →A + h’ D: donor; A: acceptor; dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là: (i) Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổ chồng lên nhau tích hợp (J). (ii) Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh. (iii) Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau (thường 1 đến 10 nanomet). 11 (iv) Các lượng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần như song song với nhau. (v) Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử các donor phải có khoảng thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra. Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor Hình 1.3. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor. Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ gữa quang phổ huỳnh quang của các donor và phổ hấp thụ của acceptor.[9] Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng cách donor-acceptor (1.1) Trong đó R0 là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng truyền được 50%. Bước sóng (nanomet) C ư ờ n g đ ộ 12 Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donor-acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50% (1.2) Bán kính Förster R0 phụ thuộc vào hiệu suất lượng tử huỳnh quang của donor (D) khi không có mặt acceptor (fd), chiết suất của dung môi (η), góc định hướng lưỡng cực của phân tử (K2 ) và sự chồng chập phổ của donor-acceptor (J) (1.3) Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua cường độ huỳnh quang theo biểu thức: (1.4) Trong đó FD là cường độ huỳnh quang của donor; FDA cường độ huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua thời gian sống huỳnh quang theo biểu thức (1.5) H iệ u s u ấ t tr u y ền n ă n g Khoảng cách (Angstorm) 13 Trong đó DA là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor; D là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt acceptor Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp cho – acceptor (hình 1.3), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ các donor tới acceptor. Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các cặp chất cho- acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET. Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET): Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫu vật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor với ánh sáng phát ra ở các bước sóng trung tâm gần với phát xạ. Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm cường độ huỳnh quang của các phân tử donor cũng như tăng cường độ huỳnh quang của acceptor, nên khi xác định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra hay không [12]. Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả các gốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, những tương tác mà kết quả trong một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất mát tín hiệu. Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và acceptor Khoảng cách (Angstorm) C ư ờ n g đ ộ 14 Trong Hình 1.5, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện của chất cho. Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnh quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang của donorvà nhận. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl-2[3-octadecyl- 2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor). 1.2.4. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor Nanosensor là cảm biến được xây dựng ở cấp độ nano, với mục đích chủ yếu là để thu thập số liệu về quy mô nguyên tử và chuyển nó thành dữ liệu có thể dễ dàng phân tích. Các cảm biến này cũng có thể được định nghĩa là “Một cảm biến hóa học, cảm biến vật lý, cảm biến sinh học sử dụng các thành phần có kích thước nano, thông thường là từ kích thước micromet tới nanomet”. Những cảm biến này có độ nhạy cực kỳ cao và có thể phát hiện các hạt đơn lẻ hoặc thậm chí nồng độ cực thấp dư lượng một chất nguy hiểm tiềm tàng còn sót lại. Vì hiện nay công nghệ này đã và đang được nghiên cứu ở rất nhiều hướng khác nhau nên rất khó để có thể cho một định nghĩa duy nhất về những gì chính xác là một nanosensor.[12] • Nanosensor xác định DNA Cũng như nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai đoạn tạo ra loại sensor DNA nano bằng việc sử dụng Qds để xác định các DNA. Trong kỹ thuật này, các phát minh đã sử dụng QDs là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ thuật lõi-vỏ làm donor. Trên bề mặt của chấm lượng tử được biến tính hoạt hóa bằng chất Streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và Biotin tác dụng với chất Oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hóa với vai trò khác nhau: tác nhân thông tin (Reporter probe) và tác nhân liên kết (Capture probe). Hai nhóm phân tử chức năng này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích DNA). Cụm phân tử hai chức năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với QDs đã biến tính (Steptavidin Conjugated QDs), tạo thành biosensor DNA nano. Biosenssor DNA nano này có nhóm biotin kết hợp với chất Steptavidin trên bề mặt QDs. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được 15 phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính xác cao[12,13,14]. Hình 1.6 là mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano. Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b) và hiệu ứng kiểm tra (c). Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang QDs có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy nhiều loại biosensor để xác định ảnh invivo được nghiên cứu chế tạo. • Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự taị đại học Hanyang Hàn Quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Protease bằng nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET. Nghiên cứu này cho thấy việc phát triển hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các chấm lượng tử. Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng QDs có cấu trúc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (BRET), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi trong hiệu suất truyền năng lượng. Đặc biệt là do đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể 16 được xem như là một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán rằng QDs dựa trên FRET/BRET như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việc phân tích vai trò cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease như thuốc điều trị sinh học dạng nano [12,13,14]. FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến sinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng phục hồi trạng thái tốt, và khả năng quan sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện để phát hiện hoạt động protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptide hữu cơ. Ví dụ cho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên các photon hiệu ứng FRET, như mô tả hình 1.7. Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việc phân tích tổ hợp donor và acceptor. Như đã nói trên, những vấn đề trong các nghiên cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt được sử dụng thích hợp với chấm lượng tử (QDs).(hình 1.7). Từ QDs có dải hấp thụ rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việc theo dõi lâu dại và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như các donor trong khi các phân tử nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptide được biến tính thích hợp [12-13-14]. Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động (A) Quá trình FRET thông thường (B) FRET sử dụng QDs. D và A là chất cho và nhận tương ứng 17 Chương 2 KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1. Kỹ thuật đo hấp thụ Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vật liệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số trạng thái cơ bản ni đến một số trạng thái kích thích nj, từ đó có thể xác định được bước sóng kích thích hiệu quả cho quá trình quang huỳnh quang (j–i) quan tâm. Môi trường vật chất hấp thụ ánh sáng tuân theo định luật Beer–Lambert: I (ν) = I0(ν)e – α (ν )d (2.1) trong đó: I0(ν) và I(ν) là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua mẫu vật chất, d là độ dày của mẫu và α(ν) là hệ số hấp thụ vật liệu đối với photon có năng lượng hν (hay hc/λ, với c là vận tốc ánh sáng). Muốn xác định hệ số hấp thụ α(ν), người ta lấy in hai vế (2.1), được: Ln [I0(ν) /(I (ν)] = α(ν)d𝛼(𝜈)𝑑 (2.2) Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ α (hay độ hấp thụ A) theo bước sóng hay năng lượng của photon đi qua vật chất. Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bước sóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phần ánh sáng truyền qua có cường độ yếu. Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánh sáng truyền qua một môi trường có độ dày 1 cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7) lần. Hai đại lượng I0(ν) và I (ν) đo được bằng thực nghiệm. Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liên tục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số, thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc. Nguồn sáng thường được sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc (volfram+halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng hồng ngoại gần. Trong thí nghiệm đo phổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy. Bằng cách ghi phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học. 18 Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS, được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ, để được tách ra thành các bước sóng đơn sắc. Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành hai tia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần. Một trong hai tia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần nghiên cứu, cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là I. Tia sáng còn lại là tia sáng so sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là Io. Cường độ của các tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo. Hình 2.8: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600 Hình 2.9: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR 19 Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì I = Io. Tuy nhiên nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì I < Io. Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền qua : T(ν) = I(ν)/Io(ν) (2.3) hoặc phổ hấp thụ: A(ν) = log10[Io(ν)/I(ν)]. (2.4) 2.2. Kỹ thuật đo huỳnh quang Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc hoạt động của phổ kế Cary Eclipse được cho trên hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích. Ánh sáng đơn sắc này được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo. Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu được hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu quang điện. Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu. Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên Cary Eclipse còn có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thời gian sống dài (lân quang). 20 Với cấu hình này Cary Eclipse cho phép đo phổ huỳnh quang, phổ kích thích huỳnh quang, thời gian sống huỳnh quang và phổ thời gian sống huỳnh quang (với mẫu có thời gian sống huỳnh quang lớn). Toàn bộ hệ thống được điều khiển bằng phần mềm chuyên dụng. 2.3. Kỹ thuật đo huỳnh quang phân giải thời gian 2.3.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang Trong khi phép đo huỳnh quang trạng thái dừng là đơn giản, phép đo phân giải thời gian thông thường yêu cầu thiết bị đo đạc phức tạp và tốn kém. Tuy nhiên phép đo phân giải thời gian cung cấp nhiều thông tin hơn là từ dữ liệu huỳnh quang trạng thái dừng. Một ví dụ điển hình của phép đo phân giải thời gian cung cấp những thông tin mà phép đo huỳnh quang trạng thái dừng không thể thực hiện được đó là thống kê Nguồn sáng đèn Xê-non Máy đơn sắc kích thích hai cách tử Cửa sập Kính lọc Tấm chia chùmc Tấm phân cực R ef - Cell Môđun quang học Máy đơn sắc phát xạ Buồng đựng mẫu Điều khiển máy đơn sắc Máy tính Hiển thị Hình 2. 10: Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse 21 phân biệt và quá trình dập tắt động học trạng thái kích thích sử dụng phép đo thời gian sống. [7] Thời gian sống hay thời gian suy giảm phát quang là một thông số động học có ý nghĩa quan trọng. Giả sử một mẫu phát quang được kích thích bằng một xung ánh sáng, kết quả là có một độ tích lũy ban đầu ( )0n trên trạng thái kích thích. Độ tích lũy trên trạng thái kích thích sẽ giảm dần với tốc độ suy giảm nrk + : [22] ( ) ( ) ( )nr dn t k n t dt =  + (2.5) Với ( )n t là độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích tại thời điểm t,  là tốc độ phát xạ nrk là tốc độ suy giảm không phát xạ. Sự phát xạ là ngẫu nhiên và mỗi trạng thái kích thích cho cùng xác suất phát xạ trong cùng thời gian. Độ tích lũy trạng thái trên trạng thái kích thích do đó giảm dần theo hàm exponential: ( ) ( )0 exp t n t n    = −    (2.6) Với ( ) 1 nrk − =  + là thời gian sống tổng cộng trên trạng thái kích thích. Trong thực nghiệm, chúng ta không thể quan sát được độ tích lũy trên trạng thái kích thích nhưng chúng ta có thể quan sát thông qua cường độ phát xạ tương ứng tỷ lệ với ( )n t . Bởi vậy phương trình trên có thể viết lại dưới dạng sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ phát xạ ( )I t : ( ) ( )0 exp t I t I    = −    (2.7) Trong đó ( )0I là cường độ phát quang tại thời điểm ban đầu, chúng ta thường biểu diễn thang cường độ theo thang logarithm cơ số 10, ( )log I t : 22 ( ) ( ) 0 1 log log logI t e t I  = − + (2.8) (a) (b) Hình 2.11: (a) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền thời gian; (b) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền tần số Theo đó ta có thể tính được thời gian sống phát quang  . Thời gian sống phát quang  được tính tại thời điểm cường độ phát quang cực đại giảm đi e lần ( 0I e ) hoặc từ độ dốc của đường thực nghiệm (hình 2.3) theo thang logarithm cơ số 10 (phương trình 2.8). Tuy nhiên thời gian sống phát quang đo được không phải khi nào cũng có dạng đơn hàm e mũ (single exponential) như phương trình 2.7, nó có thể có dạng đa hàm e mũ (multi exponential function) hay dưới dạng không phải đơn hàm e mũ (non-single exponential). Do đó từ giá trị thực nghiệm chúng ta phải đưa ra các giả thuyết phù hợp và khớp dữ liệu thực nghiệm theo nó.[7] Thời gian sống là tổng số thời gian trung bình trên trạng thái kích thích sau khi mẫu được kích thích. Điều này có thể được thấy được bằng cách tính thời gian trung bình t trong trạng thái kích thích. Giá trị này được tính bằng cách lấy trung bình thời gian qua sự suy giảm cường độ của mẫu: ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 0 0 0 0 0 0 0 0 exp exp exp exp tI t dt tI t dt t t dt t I t dt I t dt t dt           − − = = = − −       (2.9) Phương trình 2.9 cho thấy đối với dạng suy giảm đơn hàm e mũ thì thời gian trung bình trên trạng thái kích thích bằng thời gian sống: 23 t = (2.10) Điều quan trọng cần lưu ý là phương trình 2.10 là không thật sự đúng đối với các định luật suy giảm phức tạp, chẳng hạn như suy giảm dạng đa hàm e mũ hoặc không phải dạng đơn hàm e mũ. Sử dụng một định luật được giả định, thời gian sống trung bình luôn luôn có thể được tính bằng cách sử dụng phương trình 2.9. Tuy nhiên, thời gian sống này có thể là một hàm phức tạp của các tham số mô tả cường độ suy giảm thực tế. Một khái niệm quan trọng đó là thời gian sống được hiểu một như một thống kê trung bình, và sự phát quang ngẫu nhiên thông qua suy giảm độ tích lũy. Đối với một độ tích lũy lớn trên trạng thái kích thích, không phải tất cả đều có cùng thời gian sống, một số sẽ phát xạ nhanh hơn và một số sẽ phát xạ chậm hơn thời gian sống trung bình. Sự phân bố thời gian của photon phát xạ chính là đường suy giảm cường độ phát quang. Có hai phương pháp đo huỳnh quang phân giải thời gian đó là phương pháp miền tần số và phương pháp miền thời gian [7, 17]. Phép đo phân giải thời gian có độ phân giải cao đang được sử dụng hiện nay tại các phòng thí nghiệm quang phổ hiện đại đó là kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPS). Đây cũng chính là kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu quang phổ phân giải thời gian của vật liệu cấu trúc nano. 2.3.2. Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC ❖ Cấu tạo và nguyên lý kỹ thuật TCSPC Trong phép đo huỳnh quang phân giải thời gian, yêu cầu ghi lại sự phụ thuộc vào thời gian của dạng đường bao (profile) cường độ tín hiệu huỳnh quang khi đối tượng nghiên cứu được kích thích bởi một xung ngắn của ánh sáng, thường là một xung laser. Trong khi về nguyên tắc, người ta có thể cố gắng để ghi lại profile đường cong suy giảm theo thời gian của cường độ tín hiệu bằng các photodiode nhanh hay các đầu thu nhanh khác (phương pháp lấy mẫu tương tự) cùng với một bộ lấy mẫu tín hiệu và chuyển đổi tương tự số có tốc độ cao[7, 19]. Tuy nhiên, sự suy giảm để được ghi lại là rất nhanh, huỳnh quang đặc trưng có thể kéo dài chỉ vài trăm pico giây đến vài chục nano giây, đây là khó khăn và giới hạn của hệ điện tử thu tín hiệu. Mặt khác, tín hiệu huỳnh quang có thể rất yếu và không cho phép ghi nhận trực tiếp bằng phương pháp 24 lấy mẫu tương tự. Giải pháp cho những vấn đề này đó là sử dụng kỹ thuật đếm đơn photon tương quan thời gian (time-correlated single photon counting - TCSPC). Hình 2.12: Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín hiệu được ghi nhận tại mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [17] Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC được mô tả trên hình 2.4. Nguyên lý này dựa trên sự phát xạ của từng photon là phân bố ngẫu nhiên ứng với sự hồi phục phát xạ của độ tích lũy trên trạng thái kích thích. Trên cơ sở đó, xác định thời gian tới của một photon tín hiệu trên mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), và xây dựng lại biểu đồ cường độ tín hiệu theo thời gian ta sẽ thu được profile đường cong suy giảm theo thời gian của cường độ.[7, 19] Sơ đồ tổng quát hệ TCSPC cho trên hình 2.5, bao gồm một số khối chính: − Nguồn kích thích: thường sử dụng laser bán dẫn pico độ rộng xung ~ 50 ps; tần số lặp lại 4 MHz; công suất trung bình 80 W − Khối đầu thu: Sử dụng nhân quang tấm vi kênh (microchannel plate photonmultiplier tube MCP - PMT) MCP 3890R-50 của Hamamatsu (Nhật bản) có thể đo trong vùng bước sonhs 185-900 nm, đáp ứng thời gian ~ 25 ps. − Khối đếm đơn photon tương quan thời gian: PicoHarp 300 (Picoquant - Đức) có phân giải thời gian tới 4 ps tích hợp sẵn 2 lối vào CFD START và STOP. 25 Modul nay nhận tín hiệu từ đầu thu MCP, xử lý và đưa vào máy tính thông qua giao tiếp USB. − Phần mền thu nhận điều khiển và xủa lý số liệu có thể điều khiển, đặt thông số đo của của hệ đo như bước sóng, thời gian tích phân Hình 2.13: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC Hệ TCSPC hoạt động như sau: Xung laser được qua gương chia, một phần đ