Luận văn Vi khuẩn oxy hóa Fe(II) và khử nitrate ở Việt Nam: tính đa dạng và tiềm năng ứng dụng

màu của môi trường hay sự thay đổi pH tùy thuộc vào các trường hợp khác nhau (USDA, 2008; Downes và Ito, 2001). Môi trường dịch thể kỵ khí hoàn toàn có thành phần khoáng tương ứng với nước ngọt (dùng cho mẫu bùn từ đáy ao và chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (dùng cho mẫu trầm tích ven biển Vân Đồn - Quảng Ninh) (bảng 1). Thí nghiệm MPN được tiến hành với dãy pha loãng đến 10- 8 với thể tích 10% bùn đáy hoặc trầm tích trong môi trường khoáng nước ngọt hay nước lợ, thí nghiệm được tiến hành với 3 dãy pha loãng, mẫu được đảm bảo kỵ khí hoàn toàn và ủ trong tủ ấm tại 28oC trong 8 tuần. Sự phát triển của vi khuẩn trong ống MPN được ghi nhận thông qua sự thay đổi màu môi trường từ trắng đục (màu của Fe(II)) sang vàng nâu (màu của Fe(III)). 2.2.2. Phân lập vi khuẩn kỵ khí oxy hóa Fe(II), khử nitrate ống MPN ở nồng độ pha loãng cao nhất có vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate phát triển được sử dụng để làm nguồn phân lập các khuẩn lạc đơn. Việc phân lập được tiến hành theo phương pháp pha loãng trên dãy ống thạch bán lỏng (1%) với môi trường có thành phần tương tự như môi trường dùng trong phương pháp MPN (Widdel và Bak, 1992). ống thạch bán lỏng sau khi bổ sung nguồn vi sinh vật (10%) từ ống MPN (nguồn phân lập) được sục khí N2 và ủ ở tư thế đảo ngược đầu tại 28oC trong bóng tối. Khuẩn lạc đơn phát triển trong các ống pha loãng được tách bằng pipet Pasteur và chuyển sang môi trường dịch thể thích hợp (nước ngọt hay nước lợ). 2.2.3. Tách DNA tổng số từ mẫu bùn và trầm tích và chủng đơn DNA tổng số của mẫu bùn và trầm tích từ các ống MPN được tách chiết theo phương pháp do Zhou và cs, 1996 mô tả với cải biến về nồng độ đệm phosphate (tăng từ 100 mM lên 120 mM) trong đệm tách (gồm:100 mM Tris (pH 8);100 mM EDTA (pH 8); 120 mM Đệm phosphate (Na2HPO4/NaH2PO4); 1,5 M NaCl; 1% CTAB). Trộn 2 ml mẫu làm giàu từ ống MPN với 5,4 ml đệm tách DNA trong ống falcol (chịu dung môi). Phá tế bào bằng phương pháp sốc nhiệt trong nitơ lỏng và bể ổn nhiệt ở 37oC, lặp lại 5 lần. Bổ sung 40 μl proteinase K (10 mg/ml), lắc ngang với tốc độ 225 vòng/phút trong 30 phút ở 37oC. Thêm 600 μl SDS (20%), ủ ở 65oC trong 2 giờ, 25 phút đảo lộn đầu một lần. Trộn đều kỹ với lượng tương đương PCI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, trộn đều kỹ với lượng tương đương CI về thể tích. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu lấy phần dịch phía trên sang ống mới, bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm thu kết tủa DNA ở 12000 vòng/ phút trong 25 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ phần dịch ở trên, rửa kết tủa với 10 ml ethanol 80%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Đổ ethanol, để khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl nước MQ đã khử trùng, chuyển DNA sang ống eppendorf 1,5 ml và giữ ở -20oC. DNA genome của chủng đơn được tách theo phương pháp của Marmur (1961). 1 ml dịch tế bào được ly tâm 5000 - 10000 vòng/ phút trong 5 phút, sau đó rửa với 1 ml đệm TE (pH 8) rồi hòa tế bào trong 0,5 ml 5 mM EDTA (pH 8). Thêm 50 μl lysozym (40 mg/ml), trộn đều, ủ trong bể ổn nhiệt ở 37oC trong 1 giờ. Thêm 50 μl SDS (20%) và 50 μl proteinase K (4 mg/ml), trộn đều và ủ trong bể ổn nhiệt ở 55oC trong 1 giờ. Thêm 400 μl PCI, trộn đều trong 1- 3 phút, ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 400 μl CI, trộn đều, ly tâm 15000 vòng/phút tại 4oC trong 15 phút. Chuyển lớp dịch trong ở trên sang ống eppendorf mới. Thêm 1/10 thể tích dung dịch 3M Na-acetate (pH 5,2) và 2 lần thể tích dung dịch 2-propanol (đã để lạnh -20oC), trộn đều và giữ ở -20oC trong vòng 15 phút đến 1 giờ. Ly tâm 15000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút, chắt phần dịch phía trên để thu kết tủa DNA. Rửa DNA trong ethanol 70% (đã để lạnh -20oC) trong 1 phút, ly tâm 15000 vòng/ phút, đổ cồn, làm khô DNA ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA trong 50 μl MQ vô trùng (hoặc đệm TE) và bảo quản tại -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo. Sản phẩm DNA được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100V trong thời gian 15 phút. Sau khi điện di, gel agarose được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). 2.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các chủng đơn bằng phương pháp ARDRA ARDRA được sử dụng để nghiên cứu mức độ đa dạng về di truyền của vi sinh vật dựa trên phân tích kết quả xử lý gen 16S rDNA bằng enzyme giới hạn (Ravenschlag và cs, 1999). Gen 16S rDNA (xấp xỉ 1500 bp) của các chủng đơn được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) và 1492R (GGT TAC CTT GTT ACG ACT T) với thành phần và chu trình phản ứng ở bảng 3. Bảng 3. Phản ứng PCR gen 16S rDNA. Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ H2O MQ 13,5 94 3 phút 10x buffer 2,5 94 30 giây 35 BSA (3 mg/ml) 2,5 55 45 giây MgCl2 (20 mM) 2 72 1,5 phut dNTP (2,5 mM) 2 72 7 phút Mồi 27F (50 pmol/μl) 0,5 Mồi 1492R (50 pmol/μl) 0,5 Taq polymerase (5u/μl) 0,5 DNA Khuôn 1 Tổng thể tích phản ứng 25 Gen 16S rDNA sau khi khuếch đại được xử lý bằng hai enzyme giới hạn MspI và HaeIII (Fermentas) (bảng 4). Sản phẩm DNA sau khi đã xử lý enzyme được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2% tại 100 V trong thời gian 30 phút. Các chủng vi khuẩn sẽ được xếp nhóm dựa trên sự tương đồng về phổ các băng điện di. Bảng 4. Phản ứng cắt gen 16S rDNA bằng các enzym giới hạn MspI và HaeIII. Nước cất vô trùng 18 μl 10x đệm R (hoặc đệm Tango) 2 μl Sản phẩm PCR 10 μl (0,1 - 0,5 μg DNA) Enzym HaeIII (hoặc MspI) (Fermentas) 1 μl (10 u/μl) Trộn đều và ly tâm nhanh, sau đó ủ hỗn hợp phản ứng tại 37oC trong 3 giờ 2.2.5. Phương pháp điện di biến tính DGGE Hình 7. Vị trí các mồi trên gen 16S rDNA ở Lactobacillus plantarum. Khuếch đại đoạn gen 16S rDNA (550 bp): Vùng V3 - V5 của gen 16S rDNA với độ dài 550 bp (hình 7) được khuếch đại trong phản ứng PCR sử dụng cặp mồi GM5F (CCT ACG GGA GGC AGC AG) và 907R (CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT) (Muyzer và cs, 1993). “Touch-down” PCR (bảng 5) được sử dụng để tăng độ đặc hiệu và giảm sự hình thành các sản phẩm phụ. Để tạo tính ổn định cho việc phân tách các trình tự DNA trên gel điện di biến tính, kẹp GC gồm 40 bp (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GCC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G) được gắn vào đầu 5’ của mồi GM5F. Bảng 5. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR cho DGGE. Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Chu kỳ nhiệt của “touch-down” PCR H2O MQ 27 Taq polymerase được đưa vào phản ứng sau bước biến tính đầu tiên ở 94○C trong 1 phút khi nhiệt độ đạt 80○C. Nhiệt độ gắn mồi được đặt cao hơn 10○C so với nhiệt độ lý thuyết (tức là 65○C). Sau mỗi chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm đi 0,5○C cho tới khi đạt tới 55○C, ở nhiệt độ này phản ứng tiến hành thêm 15 chu kỳ. Thời gian kéo dài chuỗi của mồi là 3 phút. 10x Taq buffer 5 BSA (3 mg/ml) 5 MgCl2 (20 mM) 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 Mồi GM5F-GC (50 pmol/μl) 1 Mồi 907R (50 pmol/μl) 1 DNA khuôn 2 Taq polymerase (5 u/μl) 1 Tổng thể tích phản ứng 50 DGGE: Điện di được tiến hành trên gel polyacrylamide 6% với dải biến tính urea/formamid từ 30% đến 60%. Quá trình điện di được thực hiện bằng bộ điện di DcodeTM System (BioRad) trong đệm TAE, ở nhiệt độ 60°C, tại 200 V, trong 3,5 giờ. Sau khi điện di, gel polyacrylamide được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (5 mg/ml) trong 30 phút, sau đó rửa nước và chụp ảnh dưới tia UV trên máy GelDoc (BioRad). Thôi gel: Băng điện di được cắt, rửa và thôi trong nước qua đêm tại 4°C. Dịch thôi DNA được dùng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR như chu trình nhiệt của phản ứng PCR cho DGGE (bảng 5) với cặp mồi GM5F (không có kẹp GC) và 907R. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng kít và giải trình tự. 2.2.6. Giải trình tự gen 16S rDNA và dựng cây phân loại Gen 16S rDNA của các chủng đơn (1500 bp) và sản phẩm PCR từ các băng điện di biến tính (550 bp) sau khi tinh sạch bằng kít tinh sạch sản phẩm PCR (Bioneer - Hàn Quốc) được tiến hành phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant Appied Biosystems. Trình tự gen sau đó được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan hiện đã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm BLAST Search. Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985). 2.2.7. Phương pháp FISH FISH (Fluorescence in situ hybridization) là phương pháp lai sử dụng các đầu dò thích hợp bắt cặp với rRNA nhằm xác định phả hệ của vi sinh vật trong quần xã một cách trực tiếp, không qua bước phân lập và nuôi cấy (Amann và cs, 1992). Chuẩn bị hóa chất: Formaldehyde 37% PBS 10´ 5 M NaCl 1 M Tris-HCl 0,5 M EDTA SDS 10% Formamide DAPI (0,02 mg/ml) Đầu dò: là các đoạn oligonucleotide dài 18 - 20 nucleotide gắn chất huỳnh quang sulphoindocyonide (CY3, hấp phụ bước sóng 552 nm). Các đầu dò đã sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong bảng 6 (nồng độ 2 ng/μl). Bảng 6. Các đầu dò sử dụng trong nghiên cứu. Tên đầu dò Đối tượng bắt cặp Trình tự (5’đ 3’) Formamide (%) NaCl (mM) ALF968 a-Proteobacteria GGTAAGGTTCTGCGCGTT 20 225 BET42a b-Proteobacteria GCCTTCCCACTTCGTTT 35 80 GAM42a g-Proteobacteria AAACGATGTGGGAAGGC 35 80 Các bước tiến hành: Cố định mẫu: - Hoà 0,5 g mẫu đất hoặc bùn trong 1,5 ml PBS 1´. - Bổ sung formaldehyde vào mẫu tới nồng độ 2 - 4% và cố định ở 4°C trong thời gian ít nhất là 30 phút nhưng không quá 24 giờ. - Ly tâm, loại phần dịch và rửa lại cặn tế bào bằng PBS 1´. - Ly tâm, loại PBS 1´ và bổ sung 1,5 ml hỗn hợp dung dịch etanol/PBS (1:1). - Bảo quản tế bào đã cố định tại -20°C. Bảng 7. Chuẩn bị đệm lai và đệm rửa. Dung dịch gốc Thể tích Nồng độ cuối 2 ml đệm lai 50 ml đệm rửa 5 M NaCl 360 μl (900 mM) Phụ thuộc vào từng đầu dò 1 M Tris/HCl 40 μl 1 ml 20 mM Formamide % phụ thuộc vào từng đầu dò (bảng 6) 0,5 M EDTA 0,5 ml 5 mM Nước cất vô trùng dẫn tới 2 ml dẫn tới 50 ml SDS 10% (bổ sung cuối cùng để tránh kết tủa) 2 μl 50 ml 0,01% Lai với đầu dò: - Lấy 15 - 20 ml mẫu hoà với 2 ml nước cất vô trùng và đưa tế bào trên màng polycarbonate (0,2 μm). - Để khô mẫu trong không khí và bảo quản trong hộp kín tại -20°C cho đến khi sử dụng. - Chia màng thành các phần nhỏ để tiến hành lai (một màng có đường kính 25 mm có thể chia làm 6 - 10 phần sử dụng cho các đầu dò khác nhau). Dùng bút chì đánh dấu mẫu (bằng số). - Chuẩn bị 2 ml đệm lai trong ống eppendorf (bảng 7). - Chuẩn bị dung dịch đầu dò: trộn 2 ml đầu dò với 18 ml đệm lai trong ống eppendorf 0,5 ml, giữ trong đá, tránh ánh sáng. - Đặt một miếng giấy thấm vào ống falcone 50 ml, đổ phần đệm lai còn lại vào ống. - Đặt mảnh màng polycarbonate lên lam kính, mặt có mẫu lên trên. Các mẫu lai với cùng một đầu dò có thể đặt cùng trên một lam kính. - Nhỏ hỗn hợp đầu dò lên các mẫu và đặt toàn bộ lam kính vào ống falcon có miếng giấy lọc thấm đệm lai đã chuẩn bị trước (ở tư thế nằm ngang) và lai ở 46°C trong thời gian ít nhất là 90 phút (nhưng không quá 3 giờ). - Chuẩn bị 50 ml đệm rửa trong ống falcon 50 ml (bảng 7). - Chuyển nhanh mẫu sau khi lai vào đệm rửa đã được làm nóng trong bể ổn nhiệt tại 48°C trong 15 phút. Gạn bớt đệm và đổ mẫu ra đĩa petri. Dùng kẹp gắp mẫu, nhúng qua nước cất vô trùng trong vài giây và đặt lên giấy thấm cho khô (mặt có mẫu ở trên). Nhuộm đối chứng và quan sát: - Để nhuộm đối chứng, nhỏ 50 ml dung dịch DAPI lên mỗi mẫu, giữ 3 phút trong tối, sau đó rửa nhanh trong nước cất và rửa trong cồn 80% trong vài giây rồi để khô trong không khí (đặt trong hộp tối). Mẫu có thể được bảo quản trong -20°C trong vài ngày mà tín hiệu huỳnh quang không bị thay đổi. - Phủ một lớp Citifluor/Vecta shield (4:1 v/v) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 2.2.8. Định lượng Fe(II), Mn(II) và nitrate Mẫu vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate được nuôi cấy trong môi trường kỵ khí dạng dịch thể chứa Fe(II) (10 mM) và nitrate (5 mM) trong bình serum đậy kín bằng nút cao su. Mẫu dịch nuôi cấy (1 ml) được thu sau mỗi 24 giờ để xác định nồng độ Fe(II) và nitrate. Trong thí nghiệm xác định khả năng oxy hóa Mn(II) của vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate, Mn(II) được sử dụng để thay thế Fe(II) làm chất cho điện tử trong môi trường nuôi cấy. a) Định lượng Fe(II) bằng thuốc thử phenanthrolin (DIN 38406 E1-1, 1983) Nguyên lý: O- phenanthrolin phản ứng với Fe(II) tạo phức có màu tím đỏ trong khoảng pH 3 - 9, đo được ở bước sóng 510 nm. Nồng độ Fe(II) cho phép đo là 0,01 - 5 mg/L. Kết quả của phép đo có thể bị ảnh hưởng bởi ion Mn và Cu. Chuẩn bị: Dung dịch HCl 25% (rửa dụng cụ): Dụng cụ được rửa bằng HCl 25% và tráng bằng nước cất trước khi sử dụng Dung dịch H2SO4 loãng (hạ pH): H2SO4 đặc : nước = 1 : 4 Dung dịch ammonium acetate 5,2 M (đệm): CH3COONH4 40 g CH3COOH 50 ml Nước cất đủ100 ml Dung dịch phenanthrolin 21 mM (Tạo phức): C12H9ClN2.H2O 0,5 g Nước cất đủ 100 ml (Bảo quản trong lọ tối, hạn sử dụng trong 1 tuần) Dung dịch chuẩn: FeSO4.7H2O 2,78 mg HCl 25% 6,25 ml Nước cất đủ 100 ml Tiến hành: - Sau khi thu mẫu, ngay lập tức hạ pH tới 1 bằng dung dịch H2SO4 loãng (1% thể tích). - Thêm vào 50 ml mẫu 5 ml dung dịch ammonium acetate, trộn đều bằng vortex, hỗn hợp phải có pH nằm trong khoảng 3,4 - 5,5 (tối ưu là 4,5). - Thêm 2 ml dung dịch phenanthrolin, trộn đều. - Thêm nước cho tới 100 ml, trộn đều. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. - Đo OD tại bước sóng 510 nm. - Đường chuẩn được tiến hành với nồng độ Fe(II) từ 5 - 50 μM. b) Phương pháp trắc quang với thuốc thử acid disulfofemic, định lượng nitrate (Lê Đức, 2004) Nguyên lý: Ion NO3− tác dụng với acid disulfofemic tạo thành nitrodisulfofemic, chất này phản ứng với ammonia (NH3) đặc tạo thành phức có màu vàng, xác định được ở bước sóng 410 nm. Nồng độ nitrate cho phép đo là 0,5 - 5 mg/L. Chuẩn bị: Dung dịch acid disulfofemic: Phenol tinh khiết không màu 25 g H2SO4 đặc (tinh khiết) 150 ml H2SO4 bốc khói (oleum) 75 ml Trộn đều, đun sôi cách thủy trong bình cầu gắn ống sinh hàn hồi lưu trong 2 giờ Dung dịch chuẩn: KNO3 (đã sấy khô ở 105oC) 0,1631 g Nước cất 500 ml CHCl3 1 ml Nước cất đủ 1000 ml Tiến hành: - Mẫu nước (chứa không quá 5 mg/L nitrate) lấy vào ống nghiệm, trung hòa đến pH 7. - Chuyển mẫu sang chén sứ, cô cạn bằng đun cách thủy. - Thêm 2 ml dung dịch acid disulfofemic, hòa tan phần cặn bằng đũa thủy tinh. - Thêm 20 ml nước cất, 6 ml NH3 đặc hoặc 6 ml KOH 12N. - Thêm nước cất cho đủ 50 ml (trong bình định mức). - Đo OD tại bước sóng 410 nm. - Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn từ 0 - 10 mM c) Phương pháp formaldoxime, định lượng Mn(II) (Brewer và Spencer, 1971) Nguyên lý: Ion mangan phản ứng màu với formaldoxime (formaldehyde oxime) trong môi trường kiềm tạo thành phức có màu cam đỏ đậm, xác định ở bước sóng 450 nm. Để không hình thành các kết tủa hydroxit, pH tối ưu của phương pháp này là 8,8 - 8,9. Chuẩn bị: Formaldoxime: 20 g Hydroxylamine hydrochloride hòa tan trong 450 ml nước cất, thêm 10 ml dung dịch Formaldehyde 37% và thêm nước đến 500 ml. Ammonia (NH3) Hỗn hợp Formaldoxime:Ammonia với tỉ lệ 5:2 Dung dịch chuẩn (100 μg Mn(II)/ml): Hòa tan 0,2876 g permanganate kali (KMnO4) trong 100 ml nước cất, thêm 3 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, dẫn acid sunfurous (SO2 trong nước) cho đến khi dung dịch mất màu. Đun sôi dung dịch để loại bỏ SO2 thừa, sau đó làm lạnh dung dịch. Bổ sung nước cho đủ 1 lít. Tiến hành: - Đưa 35 ml mẫu về pH = 8,8 - 8,9. - Thêm 3 ml hỗn hợp formaldoxime/ammonia vào lắc xoay tròn, đều. - Sau 2 - 30 phút đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 450 nm. - Đường chuẩn được xây dựng trên các nồng độ dung dịch chuẩn từ 0 - 10 mM. Chương 3 - Kết quả và thảo luận 3.1. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại các môi trường sinh thái khác nhau (B) (A) Số lượng tế bào (ì103 ã g -1) Hình 8. Xác định số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate trong các môi trường sinh thái khác nhau. (A) - Nhận biết sự có mặt của vi khuẩn trong các ống MPN thông qua biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (Fe(II)) sang vàng nâu (Fe(III)). (B) - Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate xác định thông qua phương pháp MPN. Ba môi trường đại diện được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu gồm có bùn đáy ao nước ngọt, chân ruộng lúa ngập nước và trầm tích nước lợ ven biển. Đây là những môi trường có sự tham gia hoạt động tích cực của vi khuẩn trong chu trình chuyển hoá sắt và nitơ (Ratering và Schnell, 2001). Số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate trong các mẫu bùn đáy và trầm tích thu thập tại ba môi trường sinh thái khác nhau được xác định thông qua phương pháp MPN (Most Probable Number) sử dụng môi trường dịch thể chứa FeSO4 làm chất cho điện tử và NaNO3 làm chất nhận điện tử cuối cùng. Thành phần khoáng trong môi trường tương ứng với điều kiện nước ngọt (đối với mẫu bùn đáy ao và bùn chân ruộng ngập nước) hoặc nước lợ (đối với trầm tích ven biển). Sự phát triển của vi khuẩn sinh trưởng nhờ oxy hoá Fe(II) đồng thời với khử nitrate trong các ống MPN được nhận biết thông qua sự biến đổi màu sắc của môi trường từ trắng xanh (màu của Fe(II)) sang màu vàng nâu (màu của Fe(III)) (hình 8A). Kết quả thí nghiệm MPN (hình 8B) cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate cao nhất trong mẫu bùn chân ruộng ngập nước (9,3 x 103 tế bào/g bùn), cao hơn hẳn so với mẫu trầm tích nước lợ ven biển (4,3 x 103 tế bào/g trầm tích) và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (1,5 x 103 tế bào/g bùn). Mật độ và mối tương quan giữa số lượng vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate với các điều kiện môi trường tại mỗi vùng sinh thái như trên cũng đã được tìm thấy trong một số nghiên cứu trước đây. Khi nghiên cứu chu trình chuyển hoá sắt trong đất trồng lúa tại ý, Ratering đã phát hiện thấy nồng độ các ion sắt trong môi trường này rất cao và các loài tham gia chu trình chuyển hoá sắt đóng vai trò quan trọng trong chu trình chuyển hoá vật chất tại đây (Ratering, 1999). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy số lượng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate tại nhiều vùng sinh thái khác nhau trên thế giới dao động trong khoảng từ 1 ì 103 đến 5 ì 108 tế bào/g mẫu khô (Straub và cs, 1996; Hauck và cs, 2001; Ratering và Schnell, 2001; Weber và cs, 2006 b, c). 3.2. Phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn bằng điện di biến tính (DGGE) Phương pháp điện di biến tính - DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) được ứng dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng, phân tích cấu trúc di truyền của quần xã vi khuẩn cũng như xác định các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường sinh thái khác nhau (Norris và cs, 2002; Sekiguchi và cs, 2002; Bano và Hollibaugh, 2002; Avrahami, 2002; Nicol và cs, 2003; Crump và cs, 2003). Với mục đích xác định nhóm vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate chiếm ưu thế tại các môi trường nghiên cứu, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc quần xã vi khuẩn trong các ống MPN ở độ pha loãng 10-3 (là nồng độ gần tới hạn của dãy MPN đối với cả 3 mẫu) bằng phương pháp PCR-DGGE đoạn gen 16S rDNA (hình 9). Các băng điện di được cắt từ gel và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sau đó để xác định trình tự và so sánh với các trình tự 16S rDNA đã công bố trong ngân hàng dữ liệu GeneBank. Anaeromyxobacter sp. Pseudomonas sp. A R B Paracoccus sp. Hình 9. Phổ điện di biến tính (DGGE) phân tích đoạn 16S rDNA của quần xã vi khuẩn trong các ống MPN của các mẫu nghiên cứu. A - Bùn đáy ao nước ngọt; R - Bùn chân ruộng ngập nước; B - Trầm tích ven biển. Có thể thấy rằng nhóm vi khuẩn thuộc chi Anaeromyxobacter có mặt trong cả 3 dạng môi trường nghiên cứu. Đây là nhóm vi khuẩn nằm trong phân lớp d-Proteobacteria, hiện mới chỉ có một loài duy nhất được công bố là A. dehalogenans cùng với một số đại diện chưa định danh đến loài. Các chủng Anaeromyxobacter đã công bố đều sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III), chưa có chủng nào được nghiên cứu về khả năng sinh trưởng khử nitrate, sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Treude và cs, 2003; Straub và cs, 1996, 1998). Trong môi trường nuôi cấy sử dụng ở đây (cũng như trong điều kiện tự nhiên), Fe(III) đồng thời tồn tại với Fe(II) do kết quả chuyển hoá Fe(II) bằng con đường hoá học (phản ứng với lượng nhỏ oxy trong môi trường) và con đường sinh học (do các vi sinh vật oxy hoá Fe(II), khử nitrate). Do vậy, sự có mặt của các loài sinh trưởng kỵ khí khử Fe(III) như Anaeromyxobacter trong điều kiện môi trường nghiên cứu ở đây (cũng như trong tự nhiên) là mắt xích khép kín chu trình chuyển hoá sắt tại đây. Hai nhóm vi khuẩn Paracoccus và Pseudomonas tương ứng chiếm ưu thế trong mẫu bùn ao nước ngọt và chân ruộng ngập nước. Đây là hai chi vi khuẩn thuộc lớp Proteobacteria, có nhiều đại diện sinh trưởng kỵ khí khử nitrate, bao gồm cả các loài có khả năng sử dụng Fe(II) làm chất cho điện tử (Weber và cs, 2006b; Ratering và Schnell, 2001; Schafleigh, 2000). Như vậy có thể kết luận rằng trong môi trường nước ngọt tại Việt Nam (đại diện là ao nước ngọt và ruộng ngập nước), Paracoccus và Pseudomonas là các nhóm vi khuẩn đóng vai trò chính trong việc oxy hoá Fe(II) bằng nitrate. Tuy nhiên, trong môi trường nước lợ bằng phương pháp này hiện chưa xác định được nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế. Nguyên nhân có thể do sự kém cạnh tranh của vi khuẩn khử nitrate nói chung so với các nhóm kỵ khí khác, đặc biệt là nhóm vi khuẩn khử sulfate trong môi trường này (Schafleigh, 2000). Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn trong các môi trường nghiên cứu bằng phương pháp FISH FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) là phương pháp xác định trực tiếp (không qua bước phân lập và nuôi cấy) mối liên quan phả hệ của vi khuẩn trong môi trường sống của chúng thông qua các đầu dò đánh dấu huỳnh quang có thể bắt cặp với rRNA (Amann và cs, 1995). BET42a GAM42a ALF968 Hình 10. Hình ảnh hiển vi của tế bào vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bắt cặp với đầu dò huỳnh quang . Theo kết quả nghiên cứu của một số công trình đã công bố, nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate thường thuộc vào phân lớp a-, b- và g-Proteobacteria (Chaudhuri và cs, 2001; Edwards và cs, 2003) vì vậy, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ba đầu dò ALF968, BET42a và GAM42a tương ứng bắt cặp đặc hiệu với rRNA của các vi khuẩn thuộc ba phân lớp trên. Tỷ lệ vi khuẩn mỗi nhóm được tính theo tỷ lệ số tế bào bắt cặp với đầu dò (hình 10) tương ứng trên tổng số tế bào được nhuộm DAPI. Phần không bắt cặp với một trong ba đầu dò được sử dụng ở đây được gọi là phần không xác định (KXĐ) (hình 11). Thí nghiệm lai với các đầu dò chỉ cho kết quả đối với mẫu từ hai môi trường nước ngọt là bùn chân ruộng ngập nước và bùn đáy ao nước ngọt. Riêng đối với mẫu trầm tích ven biển, không cho kết quả dương tính đối với cả 3 đầu dò. ở hai mẫu dương tính đều cho kết quả với đầu dò ALF968, riêng đầu dò GAM42a và BET42a chỉ cho kết quả dương tính tương ứng ở mẫu bùn chân ruộng ngập nước và mẫu bùn đáy ao nước ngọt (hình 11). Như vậy, bằng phương pháp này chúng tôi không xác định được mức độ đa dạng di truyền của mẫu trầm tích ven biển với 3 đầu dò sử dụng. KXĐ 60% ALF968 20% GAM42a 20% KXĐ 50% ALF968 30% BET42a 20% Bùn chân ruộng ngập nước Bùn đáy ao nước ngọt Hình 11. Kết quả phân tích đa dạng di truyền vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp FISH. 3.4. Mức độ oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu Nồng độ Fe(II) và nitrate trong môi trường nuôi cấy được xác định theo thời gian để đánh giá khả năng sinh trưởng bằng oxy hóa Fe(II) và khử nitrate của vi khuẩn trong các mẫu làm giàu (hình 12). Kết quả cho thấy quần xã vi khuẩn được làm giàu qua dãy MPN thể hiện khả năng sinh trưởng với Fe(II) và nitrate khá cao. ở cả 3 mẫu, lượng nitrate trong môi trường bị khử đáng kể sau 4 ngày (hình 12B), tuy nhiên lượng Fe(II) không giảm tương ứng (hình 12A). Hiện tượng này có thể lý giải bằng sự có mặt của nhóm vi khuẩn Anaeromyxobacter trong cả 3 mẫu phân tích (kết quả thí nghiệm điện di biến tính, mục 3.2) cùng với các nhóm vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate làm chuyển hoá liên tục giữa Fe(III) và Fe(II) trong môi trường. (B) (A) Hình 12. Hoạt tính oxy hoá Fe(II) (A) và khử nitrate (B) của quần xã vi khuẩn tại ba môi trường nghiên cứu sau khi đã làm giàu thông qua phương pháp MPN. Ký hiệu: O đối chứng không có VSV; Ă mẫu bùn đáy ao nước ngọt; —mẫu bùn chân ruộng ngập nước;  mẫu trầm tích nước lợ ven biển. 3.5. Phân lập vi khuẩn oxy hoá Fe(II), khử nitrate từ các mẫu nghiên cứu Song song với các phương pháp phân tích đa dạng và cấu trúc di truyền quần xã vi khuẩn không qua bước phân lập và nuôi cấy như phương pháp PCR-DGGE và FISH đã tiến hành ở phần trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn oxy hóa Fe(II), khử nitrate đại diện với mục đích (i) đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần xã vi sinh vật thông qua phân lập và nuôi cấy; (ii) nghiên cứu chi tiết các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng đại diện v