Luận văn Xác định các đột biến trên gen KATG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Sigma (Mỹ) Sigma (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 2.2.2. Các máy và thiết bị chính Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất Tủ ấm ổn nhiệt Máy PCR (GenAmp PCR System 9700) Máy PCR (Thermo cycle) Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Máy chụp ảnh Gel-Doc Tủ lạnh -200C, -800C Lò vi sóng Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Bể ổn nhiệt Máy lắc Gyromax 737R Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100- Avant Sanyo (Nhật Bản) Applied BioSciences (Mỹ) Bio-rad (Pháp) Heraeus (Mỹ) Thommas Scientific (Mỹ) Dolphin (Mỹ) Nuaire (Mỹ) Sanyo (Nhật Bản) Nuaire (Mỹ) Memmert (Đức) Amerex Instrument (Đức) Analitika (Đức) Applied BioSciences (Mỹ) 2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng là : - Cặp mồi dùng cho nhân trình tự gen katG: KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3' KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3' - Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG: M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hồng Kông . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.3.1. Thiết kế nghiên cƣ́u Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp : - Dịch tễ học mô tả , điều tra cắt ngang, có đối chứng. - Thực nghiệm labo có đối chứng . Sơ đồ nghiên cƣ́u DNA (Tách từ vi khuẩn lao đã đƣợc xác định tính kháng thuốc) Nhân bản đoạn gen katG sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu Sản phẩm gen KatG Tách dòng gen KatG Sản phẩm vector có đoạn gen KatG Giải trình tự gen KatG Xác định đột biến liên quan đến tính kháng INH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể 2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen KatG Cụ thể: 1. Sau khi đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nha u để khi đưa vào hỗn hợp sản phẩm cùng một thể tích DNA khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng . 2. Tính các giá trị của các thành phần khác . Đo nồng độ DNA của mẫu nghiên cƣ́u Tính toán giá trị các thành phần phản ứng PCR Tạo hỗn hợp phản ứng Nhân gen theo chu trình nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu Sƣ̉ dụng sản phẩm PCR làm DNA chèn vào plasmid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ Nước 10,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM PCR bufer (10X) 2,5 1 X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Mồi KatG F 1 0,5 µM Mồi KatG R 1 0,5 µM Taq Polymerase 0,25 1 unit DNA khuôn 5 Tổng 25 Các thành phần này ở phản ứng của các mẫu bệnh phẩm đều giống nhau. Có đối chứng âm khi tiến hành phản ứng . 3. Chu trình nhiệt như sau : 4. Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả trên máy Gel - Doc. 95 0 C 5 phút 95 0 C 1 phút 56 0 C 45 giây 72 0 C 1 phút 72 0 C 4 phút 4 0 C 60 phút 35 chu kỳ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.3.2.2. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen katG Sơ đồ qui trình tách dòng Sau khi nhân bản thành công đoạn gen katG, chúng tôi tiến hành làm sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trình thao tác trên đèn tím rất có thể bị đứt gẫy các nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A . Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.5. Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT tạo vector tái tổ hợp Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Nuôi cấy tế bào có vector Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng Kiểm tra và tách plasmid Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ Nước 5,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM PCR bufer (10X) 2,5 1 X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Taq Polymerase 0,25 1 unit DNA khuôn 7 Tổng 20 Sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 720C trong 10 phút. Sau đó tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo qui trình của nhà sản xuất. Qui trình : - Thêm 100 µl building buffer và o các Eppendorf chứa mẫu vừa được nối đầu A. Vortex nhẹ. - Hút hết sản phẩm trên sang các Eppendorf có bổ sung cột lọc. - Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc. - Thêm 500 µl Washing buffer vào Eppendorf. Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch, thu cặn bám trên cột lọc. - Lặp lại bước trên. - Làm khô bằng cách ly tâm thêm 1 lần nữa. - Thêm 15 µl nước deion vào . Đợi trong vòng 1 phút. - Thu dịch, loại bỏ cột lọc. Sau đó thực hiện các bước sau: 1. Tạo sản phẩm kết nối Kết nối đoạn gen katG cần nghiên cứ u với vector pBT theo qui trình của nhà sản xuất . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Qui trình : - 2X Papid Ligation Buffer 1 µl - T4 DNA Ligase 1 µl - pBT Vector 1 - PCR product 5 µl - Nước cất khử ion vừa đủ 10 µl. Sau đó sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 220C trong vòng 60 phút. 2. Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt [15]. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong tế bào theo qui trình sau : - Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm , để trong nước đá (40C) trong vòng 10-15 phút. - Hút 5 µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ). - Để ống tế bào khả biến trong nước đá (40C) 30 phút, sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây. - Tiếp tục giữ ở 40C trong vòng 1-2 phút. - Thêm 100 µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ ), cho ngay các ống tế bào khả b iến này vào tủ nuôi cấy lắc , để ở 370C và 220 vòng/phút trong 1 giờ. - Hút 150 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có carbenicillin, X-gal, IPTG. - Giữ sản phẩm ở tủ ổn nhiệt 370C qua đêm (18-24 giờ). - Khi trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế bào xanh trắng , lựa chọn các khuẩn lạc trắng chấm vào 3 ml LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 100 µg/ml. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 - Lấy 1 µl dịch khuẩn làm phản ứng PCR k iểm tra đoạn gen vớ i 2 mồi KatG F và KatG R (chu trình nhiệt như với PCR nhân đoạn gen katG). - Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR , nếu mẫu nào có vạch tương ứng với đoạn gen KatG thì sử dụng mẫu đó để tách plasmid . 3. Tách chiết plasmid (Sử dụng các hóa chất có tại phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH). Sử dụng kit QIAprep spin Miniprep (của hãng QIAGEN ) và quy trình của nhà sản xuất để tách chiết plasmid . Đây là phương pháp tách chiết plasmid lượng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩn lạc E. coli. - Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf 2 ml. - Ly tâm 8000 vòng/2 phút ở 40C thu khuẩn . - Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặn . - Thêm 200 µl sol II, đảo nhẹ Eppendorf. - Thêm 150 µl sol III, đảo nhẹ Eppendorf cho dịch chuyển sang màu trắng. (Đảo ngay khi thêm hóa chất vào Eppendorf, tránh kết tủa cục bộ). - Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Hút 300 µl dịch, bỏ cặn. - Thêm 1 lượng tương đương P CI 24:1 (24 phenol-chloroform - isoamylalchohol). Lắc mạnh, ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu pha trên. - Thêm 1 lượng tương tương isopropanol . Lắc đều. - Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu cặn. - Rửa cồn. Ly tâm 13000 vòng/5 phút/40C. - Đợi khô. - Thêm 50 µl nước deion. 4. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid Sử dụng enzym cắt giới hạn BamHI để cắt plasmid . Theo như sơ đồ vector pBT thì chỉ cần một enzym này là có thể cắt ở cả hai đầu phía trước vị trí của đoạn gen chèn vào. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 hai phần : tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thước khoảng 684 bp và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705 bp. Qui trình dùng BamHI: - 10X BamHI buffer: 2µl - BamHI enzym: 1µl - DNA plasmid: 5µl - Nước deion vừa đủ 20µl Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút. Sau đó điện di trong agarose 1% kiểm tra vạch đặc hiệu . Những mẫu nào có vạch tương ứng với vị trí 684 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự . Sau khi xác định được mẫu plasmid đi đọc trình tự , pha loãng plasmid 50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ xung thêm 5µl RNAase. Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút để khử RNA . 2.3.2.3. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng Plasmid được gửi đọc trình tự tại phòng Công nghệ gen t rọng điểm - Viện Công nghệ Sinh học . * Phân tích kết quả : - Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính ABI 3130. - Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen , thiết lập chủn g chuẩn wild type để so sánh. - Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG có kích thước khoảng 684 bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit . So sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu . Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê , sử dụng chương trình phân tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u Sử dụng cặp mồi katG F và katG R nhân bản đoạn gen katG bằng kỹ thuật PCR. Sau khi có được sản phẩm PCR , chúng tôi tiến hành kiểm tra đoạn gen được nhân lên bằng phương pháp điện di trên agarose 1%. Kết quả được thể hiện như trong ảnh 3.1 và 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Kết quả điện di kiểm tra sau khi PCR nhân gen katG cho thấy cả 14 chủng vi khuẩn lao đều có kết quả dương tính với đoạn gen katG có chiều dài 684bp. Các vạch DNA đặc hiệ u rõ ràng , không có vạch phụ kèm theo . Chứng tỏ đoạn gen katG đã được nhân lên đặc hiệu. Zenteno-cuevas và cộng sự (2009), từ 80 mẫu bệnh phẩm lâm sàng có kết quả PCR chẩn đoán dương tín h với vi khuẩn lao thì có hơn 95% số chủng có đoạn gen katG. Nhiều tá c giả khác khi nhân đoạn gen katG để giải trình tự , thường có kết quả tỷ lệ dương tính với gen katG là 100%. Như vậy kết quả của chúng tôi thống nhất với các công bố khác trong và ngoài nước . Theo nhiều tác giả trên thế giới , cần thiết phải tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối . Chúng tôi tiến hành tinh sạch theo phương pháp thôi gel bằng kit của hãng QIAGEN , song song với các mẫu đó chúng tôi tiến hành các mẫu không tinh sạch . Kết quả qua lựa chọn các dòng tế bào dương tính có chứa đoạn gen katG của 2 nhóm này thấy rằng , chọn 10 dòng thì ở nhóm tinh sạ ch có tới 9 dòng dương tính , còn ở nhóm không tinh sạch đạt từ 6-7 dòng dương tính . Hơn nữa ở nhóm có tinh sạch khi điện di kiểm tra trên agarose 0,8% cho các vạch rõ ràng , sắc nét . Vì vậy các mẫu sau này chúng tôi đều tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối. Kết quả này cũng chứng tỏ sản phẩm PCR đoạn gen katG có chiều dài 684 bp đã tách dòng được. 3.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện ph ản ứng gh ép nối gen katG và vector tách dòng pBT , đây là vector có nhiều ưu điểm như : kích thước nhỏ , có nhiều điểm cắt giới hạn của các enzym hạn chế . Đồng t hời, vector này còn chứa hai gen kháng kháng sinh ampicillin và ca rbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản hơn . Đặc biệt vector này rất thuận lợi cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng được thiết kế dưới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thêm nucleotide T. Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT Đầu 5' của đoạn gen katG có mang nucleotid e loại A . Vì vậy khi thực hiện phản ứng kết nối , gen katG sẽ dễ dàng được gắn vào vector theo nguyên tắc bổ sung . Phản ứng nối được xú c tác bởi T 4 DNA ligase . Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt . Sau đó, sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin , X- gal và IPTG . Sự có mặt của X -gal sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng. Kết quả được trình bày ở hình 3.2. C ác v ị trí cắt củ a en zy m g iớ i h ạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trƣờng LB có bổ sung carbenicillin, X-gal và IPTG. Trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG , phát triển hai loại khuẩn lạc : khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng . Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã đượ c biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin, nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp . Vì những vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase. Enzym này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol , dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh . Nếu đoạn DN A ngoại lai xen vào giữ a gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng , enzym β-galactosidase không được tạo ra , vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị thủy phân , không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng . 3.3. Kết quả tách dòng gen katG Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmi d tái tổ hợp chứa đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật c olony- PCR. Vì số lượng khuẩn lạc sau khi biến nạp là rất nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 28 khuẩn lạc trắng để thực hiện phả n ứng colony -PCR sử dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 cặp mồi katG F và katG R. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen katG thì sản phẩm PCR sẽ xuất h iện một băng có kích thước mong muốn khoảng 684 bp. Đồng thời nuôi những khuẩn lạc này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự . Sau khi nuôi khuẩn lạ c trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của nhà sản xuất . Để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid . Sản phẩm cắt plasmid được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Trên ảnh , các plasmid có mang gen katG có độ dài khoảng 684 bp thì sẽ xuất hiện hai băng vạch . Một vạch có kích thước khoảng 684 bp, là kích thước của đoạn gen katG. Một vạch có kích thước khoảng 2,7 kb, là kích thước của vector pBT. Thực hiện cắt plasmid bằng enzy m giới hạn BamHI xác định đoạn gen katG trên 27 mẫu plasmid có 23 mẫu cho kết quả dương tính , 4 mẫu kết quả âm tính . Các kết quả âm tính này là do những sai sót trong lựa chọn mẫu để tách plasmid . Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu plasmid cho thấy là các dòng tế bào được tăng sinh khá tốt và quá trình tinh sạch là đảm bảo chất lượng. Các tác giả khác khi sử dụng các bộ kit tinh sạch của các hãng như Fermentas, Promega... đều cho các kết quả tương tự . Nồng độ vi khuẩn của các mẫu là tương đương và cùng được sử dụng một phương pháp tách chiết vì vậy n ồng độ của DNA plasmid các mẫu nghiên cứu khá đồng đều , chủ yếu từ 300-500 ng/µl. Như vậy kế t quả tách chiết kiểm tra plasmid của chúng tôi đã khẳng định đoạn gen katG đã được nhân lên với số lượng lớn trong tế bào vi khuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 E.coli DH5α. Các mẫu DNA plasmid thu được có đủ điều kiện về độ tinh sạch và nồng độ phục vụ cho giải trình tự gen . 3.4. Kết quả phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u. Các chủng vi khuẩn lao sau khi đọc trình tự được xử lý kết quả qua phần mềm BioEdit . So sánh trình tự nucleo tide và acid amin từ các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotid e và acid amin của chủng dại H 37Rv chúng tôi thu được kết quả đột biến trên các chủng lao kháng thuốc . Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.9 và 3.10. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Ảnh 3.9: So sánh trình tƣ̣ nucleotide các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Ảnh 3.10: So sánh trình tƣ̣ acid amin các mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv Từ ảnh 3.9 và ảnh 3.10 chúng tôi có bảng thống kê sau : Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Bảng 3.1: Các vị trí xảy ra đột biến trên đoạn gen katG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 612 628 673 708* 723* 742 761 768* 925 944 980 1060 1107* 1123 1129 1163 1203* 1205 1211 1 TGG- CGG GCC- GCT* AGC- ACC GGC- GGT* 2 AGC- ACC CCG- TCG 3 AGC- ACC ACC- GCC TTG- TCG 4 AAC- AAT* ATT- TTT AGC- ACC 5 AGC- ACC 6 ATG- GTG AAA- ATA 7 AGC- ACG ATG- GTG X 8 AGC- ACC 9 CCC- CCG* AGC- ACC GAG- GGG 10 11 CGC- CAC AGC- ACC 12 AGC- ACC CCC- CCA* 13 X GGT- TGT AGC- AAC 14 AGC- AAC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Chú thích: X: Vị trí đột biến mất mucleotide; *: Vị trí đột biến không dẫn đến sự thay đổi acid amin Bảng 3.2: Các vị trí xảy ra đột biến thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 204 210 225 248 254 309 315 327 354 356 375 377 388 402 404 1 W -> R S -> T 2 S -> T P -> S 3 S -> T T -> A L -> S 4 I -> F S -> T 5 S -> T 6 M -> V K -> I 7 S -> T M -> V X 8 S -> T 9 S -> T E -> G 10 11 R -> H S -> T 12 S -> T 13 X G -> C S -> N D -> G 14 S -> T Mẫu ĐB Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chú thích: X: Vị trí codon có đột biến mất nucleotide. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Từ bảng thống kê 3.1 chúng tôi nhận thấy : Đột biến xảy ra ở 13 mẫu trên tổng số 14 mẫu bệnh phẩm . Đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên đoạn gen katG quan tâm. Mỗi acid amin có thể được mã hóa bở i nhiều bộ ba . Vì vậy không phải tất cả các đột biến đều dẫn đến sự hình thành một acid amin mới. Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mã hóa mới , nhưng không dẫn đến sự hình thành acid amin mới thì không làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc . Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 1, tại điểm 768 có đột biến làm biến đổi bộ ba GCC thành GCT , tại điểm 1107 có đột biến làm biến đổi bộ ba GGC thành GGT; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 4, tại điểm 708 có đột biến làm biến đổi bộ ba AAC thành AAT ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 9, tại điểm 723 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCG ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 12, tại điểm 1203 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCA . Khi đối chiếu các điểm đột biến này sang bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy các đột biến này không làm xuất hiện các acid amin mới . Từ đó chúng tôi kết luận các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid . Từ bảng thống kê 3.2 chúng tôi nhận thấy : Sự đột biến xảy ra ít nhất trên 1 codon và nhiều nhất là trên 3 codon như ở các mẫu bệnh phẩm ĐA 3, ĐA7, ĐA13. Trong số 13 mẫu bệnh phẩm có mang đột biến thì có tới 11 mẫu có đột biến tại codon 315, chiếm 84,6%. Đột biến tại codon 315 này là đột biến thay thế 1 nucleotide loại G thành loại C , sự thay thế này làm bộ ba AGC trở thành ACC. Đột biến tại codon 315 cũng có thể là sự thay thế cùng lúc 2 nucleotide, như ở mẫu bệnh phẩm ĐA7. Sự thay đổi bộ ba mã hóa các acid amin kéo theo là sự thay đổi các acid amin do bộ ba đó quy định. Vì vậy acid amin tại codon 315 được biến đổi từ serine thành threonine . Năm 2009, Elis R Dalla Costa và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 cộng sự đã tiến hành xác định các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc trên các gen katG, oxyR-ahpC và inhA . Với nghiên cứu ở gen katG, tác giả tiến hành thu thập 160 mẫu tại 3 nước thuộc Nam Mỹ có số bệnh nhân mắc lao kháng thuốc cao là Brazil , Peru và Argentina . Tại Brazil tác giả thu được 4 dạng đột biến , bao gồm: S315T, S315N, S315I, G258D. Trong 4 dạng độ t biến thì đột biến S315T chiếm tỷ lệ cao nhất , gần 94%. Tại Peru có 2 dạng đột biến là S 315T và S 315N, trong đó S 315T chiếm tỷ lệ lớn , gần 91%. Tại Argentina chỉ gặp dạng đột biến S315T [52]. Năm 2008, Gonul Aslan và cộng sự đã tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm tại nhiề u vùng khác nhau tại C hâu Á để xác định các đột biến liên quan đến tí nh kháng thuốc trên các gen katG, inhA, rpoB. Tác giả đã tiến hành nghiên cứu 30 mẫu. Trong đó các mẫu được chẩn đoán c ó liên quan đến tính kháng i soniazid là 25 mẫu. Tiến hành đọc trình tự tác giả thu đư ợc 4 điểm đột biến trên gen katG. Tại codon 315 có các dạng đột biến : S315T, S315N, S315I, trong đó dạng đột biến S 315T chiếm tỷ lệ lớn, chiếm 72% [53]. Năm 2004, Marttila và cộng sự tiến hành thu thập 27 chủng lao kháng thuốc tại Nga . Sau khi tiến hành đọc trình tự , tác giả nhận thấy trong 27 mẫu bệnh phẩm c