Luận văn Xác định các kiểu gen thụ thể Prolactin trên một số giống heo công nghiệp bằng kỹ thuật PCR-RFLP

elting temperature, Tm) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trƣờng. Tm cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA. DNA chứa càng nhiều G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết hidro tƣơng đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lƣợng hơn để phá hủy liên kết này.  Hồi tính là hiện tƣợng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với nhau theo nguyên tắc bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép. Đặc điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction). Hình 2.3 Cấu trúc bốn loại nucleic và liên kết giữa chúng 2.5.4 Cơ chế tự nhân đôi của DNA DNA đƣợc xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi. Đặc điểm cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semiconservative replication). Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời của chuổi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn. Mỗi mạch đơn đƣợc dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân tử DNA con đƣợc hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ. Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuổi DNA mẹ nhờ enzyme topoisomerase và protein DNA A. Trong quá trình sao chép các chuổi tách rời nhau dƣới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide. 10 Nhiều loại helicase cùng họat động đồng thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’. Các mạch tách rời sẽ đƣợc ổn định dƣới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn lại với nhau. Sự tái bản đƣợc khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ các DNA polymerase. Sự thêm các nucleotide luôn theo hƣớng 5’– 3’. Tức là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch. Trên mạch khuôn 3’- 5’ sự tái bản theo chiều 5’- 3’ cùng hƣớng với chiều tháo xoắn sự tái bản trên mạch này diễn ra một cách liên tục và đƣợc gọi là sợi tiến nhanh. Trên mạch còn lại sự tái bản diễn ra ngƣợc với chiều tháo xoắn. Sự tổng hợp mạch mới ở đây không diễn ra liên tục mà dƣới dạng những đoạn ngắn gọi là những đoạn Okazaki. Sự tái bản bán bảo toàn có vai trò rất quan trọng vì qua đó khi tế bào phân chia có thể truyền sang tế bào con bản sao nguyên vẹn toàn bộ cơ cấu di truyền của nó. Trong sự phân bào bình thƣờng thì DNA đƣợc nhân đôi khi các nhiễm sắc thể tách rời nhau. Hình 2.4 Sự tái bản DNA mang tính bán bảo toàn 2.5.5 Sự biến tính và hồi tính của DNA Sự liên kết cầu nối hydro giữa các nucleotide trong DNA liên quan đến tính bền vững của đoạn DNA đó. Đoạn DNA sẽ dễ bị tách ra nếu trong đoạn DNA đó có nhiều cặp A-T hơn là cặp G-C, đơn giản là sự kết hợp G-C có tới ba sự liên kết hydro trong khi đó A-T chí có hai liên kết hydro. Do đó, nhiệt độ gây biến tính để cho DNA tách ra cũng thay đổi tùy theo đặc tính của đoạn DNA đó. Trái lại, DNA có thể bắt cặp trở lại nếu điều kiện nhiệt độ thích hợp, đoạn DNA có thể không bắt cặp trở lại nếu nhiệt độ gây biến tính quá dài. 11 2.5.6 Phƣơng pháp tách chiết DNA DNA đƣợc tách chiết từ mô và các cơ quan của động thực vật. Ở động vật, DNA đƣợc tách chiết từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu. Qui trình này cơ bản gồm 3 bƣớc. + Bƣớc 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. + Bƣớc 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hỗn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phƣơng pháp ly tâm. + Bƣớc 3: tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol. 2.5 Kỹ thuật PCR 2.5.1 Nguyên tắc Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase. Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuổi đơn ở nhiệt độ 90 – 950C Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thƣờng khoảng 40 – 600C. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 720C Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. 12 Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR 2.6.2 Các yếu tố ảnh hƣởng 2.6.2.1 DNA mẫu Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng < 250 ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. 2.6.2.2 Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2+. Nó rất cần thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1,5 mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2+. Những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm những sản phẩm đƣợc phát triển một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq. Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kích thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. 2.6.2.3 Taq DNA polymerase Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện 13 cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không đủ lƣợng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2.6.2.4 Các nucleotide (dNTP) Deoxyribonucleotide-5-triphosphate-dNTP là hỗn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. 2.6.2.5 Số chu kì phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qua 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự giảm hoạt tính của các enzyme dùng trong phản ứng. 2.6.2.6 Nhiệt độ và pH Những enzyme đƣợc sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 950C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng 720C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 560C. Hầu hết các enzyme, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng acid các bazơ purin rất dễ bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. 14 2.6.2.7 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Ta có bảng sau: Bảng 2.3 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Có nhiều sản phẩm chuổi ngắn không đặc trƣng Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp; gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuổi Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuổi lên đến 74 – 78o C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM. Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP; giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn; giảm lƣợng Taq polymerase Có nhiều sản phẩm chuổi dài không đặc trƣng Giảm thời gian ủ bắt cặp; gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi; giảm lƣợng DNA khuôn; giảm lƣợng Taq polymerase Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông. Gia tăng hàm lƣợng mồi.Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể; gia tăng lƣợng mồi; hoặc gia tăng lƣợng DNA khuôn Gia tăng lƣợng Taq polymerase ( Nguồn: Luận văn tốt nghiệp của Nguyễn Tuấn Kiệt-CNSH khóa 2001- 2005, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh) 15 2.6.2.8 Các enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn đƣợc khám phá váo cuối năm 1960, có khả năng cắt DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích gen. Ngƣời ta phân ra làm 3 loại enzyme: Loại 1: Khi enzyme nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển một đoạn khoảng 100-5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Loại 2 là nhóm duy nhất đƣợc sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử. Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide. Có hai kiểu cắt chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng:  Kiểu cắt đầu bằng:  Kiểu cắt đầu dính: 16 2.6.2.9 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực: Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus, xác định gen gây bệnh hay gen di truyền có thể gây ảnh hƣởng tính cách, giới tính, sức khỏe,… Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin... Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn vius có trong mẫu thực phẩm. Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen… 2.7 Kỹ thuật PCR-RFLP 2.7.1 Nguyên tắc Nhằm khắc phục hiện tƣợng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP ngƣời ta đƣa ra kỹ thuật PCR – RFLP. PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trƣớc. Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết đƣợc sự đa hình của đoạn DNA. Nhƣ vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau: Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình. Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp. Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đƣa ra kết luận. 2.7.2 Ứng dụng Trong chọn giống thực vật có thể sử dụng kỹ thuật RFLP để chọn lọc trực tiếp các gen lặn mong muốn, không cần phân tích qua nhiều thế hệ. Mặt khác đối với các đặc điểm do nhiều gen kiểm soát, hoặc có sự liên kết giữa các gen, sử dụng kỹ thuật RFLP để xác định quan hệ giữa các gen đó. Đây là một kỹ thụât có thể xác định sự 17 phân li di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel. Ví dụ nhƣ kiểm tra gen xác định màu hoa,… Trong chọn giống động vật, đây là một kỹ thuật hữu hiệu để xác định những con giống có đặc điểm di truyền tốt nhƣ những gen liên quan đến sinh sản, liên quan đến ngoại hình, liên quan đến phẩm chất thịt, sữa,… 2.8 Gen prolactin 2.8.1 Nguồn gốc và cấu tạo Prolactin còn gọi là LTH (Luteotropic hormone). Ở ngƣời và các loài động vật hữu nhũ prolactin đƣợc tổng hợp và phân tiết ở tế bào ƣa acid của tuyến não thùy. Nó là một polypeptide gồm mƣời chín cấu tử amino acid và trọng lƣợng phân tử khoảng 23000 Da. 2.8.2 Chức năng của prolactin Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của ngƣời và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con. Trên một số loài động hữu nhũ, prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone. Prolactin đƣợc phân tiết từ các tế bào ƣa acid của tuyến não thùy theo máu di chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin. Sự tiếp nhận này đƣợc quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích. Bình thƣờng bất cứ heo mẹ, heo bố hay heo con nào cũng phân tiết đƣợc prolactin, nhƣng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hƣởng của hormone này. Sự xuất hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin receptor gene). 2.8.3 Cơ chế tác động của prolactin Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor) tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP. c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, nhƣ tác động vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng. 18 2.8.4 Gen thụ thể prolactin Cùng với sự phát hiện ra gen thụ thể estrogen, gen halothan...Ngƣời ta cũng đã phát hiện ra gen thụ thể prolactin. Gen này đƣợc nghiên cứu nhƣ gen dự tuyển trong công tác chọn giống ở các dòng heo: Large White, Landrace, Duroc...Theo các nghiên cứu của Linville, Drogemuler (2001), Võ Thị Tuyết (2005) nếu trên các cá thể heo có sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỷ lệ sống sót của các heo con cao. Đặc biệt, trọng lƣợng heo con sinh ra vẫn duy trì ở mức bình thƣờng không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng thấy sự tăng khối lƣợng trên ngày của các cá thể heo con có sự hiện diện của gen thụ thể prolactin cao hơn các cá thể không có sự hiện diện của gen này. Các nghiên cứu về gen thụ thể prolactin chỉ dừng lại ở mức xác định mối tƣơng quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất sinh sản hay tăng trọng cơ thể. Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo (Vincent, 1998). Ở heo gen PRLR đƣợc định vị trên nhiễm sắc thể 16. Gen này liên kết khá chặt chẽ với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23). Để xác định đƣợc tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism). Trƣớc đó, ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này. Với cách này thì ông đã xác định đƣợc kích thƣớc của các băng cắt DNA nhƣ sau: 124, 110, 90, 79 và 77, 67, 20 bp. Trong đó, băng 110 và 90 bp đƣợc xác định là đa hình. Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp đƣợc xác định là alen A, băng 110 bp đƣợc xác định là alen B. Gen PRLR có tính đa hình rất cao. Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn cắt cũng có nhiều kích thƣớc khác nhau. Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA, AB, BB. Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, trọng lƣợng heo con sinh ra đồng đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB. Theo kết quả nghiên cứu của Võ Thị Tuyết cùng cộng sự (2005) thì ở giống heo Yorkshire kiểu gen AA có tiềm năng về số con đẻ ra cao hơn kiểu gen AB, BB. Tất cả những kết quả trên chỉ là 19 những kết quả ban đầu, những kết quả đó chƣa thật sự khẳng định và đem áp dụng thực tế, nó còn phụ thuộc vào giống heo và kiểu gen PRLR quy định năng suất sinh sản của giống heo đó. 2.8.5 Tính đa hình của gen prolactin 2.8.5.1 Tính đa hình của gen Do allen quyết định, gen có nhiều allen thì tính đa hình càng cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen nhƣ sau: “Allen là các dạng khác nhau của một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tƣợng đƣợc ông khảo sát ở đây là đậu Hà Lan. Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền và locus đƣợc hình thành thì allen đƣợc định nghĩa lại nhƣ sau: “ Allen là các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”. Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen. Gen có càng nhiều allen thì tính đa hình càng cao. Mỗi allen đƣợc hình thành từ sự đột biến đoạn mã di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trƣờng sống, các tác nhân vật lý, hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép. Các đột biến này nếu tạo thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ đƣợc duy trì và lan truyền trong quần thể. Nhƣ vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang cùng một gen chƣa hẳn là có đoạn trình tự chuổi mã di truyền của gen giống nhau, giữa những cá thể khác nhau thì luôn xuất hiện đột biến khác nhau nhƣng hiếm khi biểu hiện thành các đặc điểm hình thái. Tính đa hình của gen trong trƣờng hợp này chỉ đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phân tích ở mức phân tử. 2.8.2.2 Tính đa hình của gen thụ thể prolactin Gen thụ thể prolactin là một gen đa hình, nó đƣợc biểu hiện ở các băng có kích thƣớc khác nhau khi ta thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn. 20 Bảng 2.4 Các kích thƣớc tìm đƣợc trên gen PRLR Tác giả Kích thƣớc các băng tìm thấy (base pair-bp) A.L. Vincent và công sự (1998) 90, 110 C. Drogemuller và cộng sự (2001) 19, 59, 85, 104 Roslin Institute (2000, 2001) 76, 79, 90, 110, 124 Birgette van Rens và cộng sự (2001) 19, 31, 60 21 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1 Thời gian và địa điểm  Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 6 tháng 2 năm 2006 đến ngày 3 tháng 7 năm 2006.  Địa điểm: Lấy mẫu da tai, thu thập các dữ liệu liên quan đến năng suất sinh sản tại xí nghiệp heo giống Đồng Hiệp. Các mẫu sau khi thu thập sẽ đƣợc tiến hành phân tích tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM để phát hiên gen thụ thể prolactin (PRLR). 3.2 Đối tƣợng khảo sát Khảo sát năng suất sinh sản, tầng số xuất hiện gen thụ thể prolactin trên heo nái thuần Yorkshire, Landrace, và Duroc. 3.3 Nội dung thực hiện  Xác định sự hiện diện của gen thụ thể prolactin trên heo giống.  Xác định tần số xuất hiện các kiểu gen của prolactin receptor.  Từ đó phân tích mối liên quan giữa năng suất sinh sản và các kiểu gen PRLR. 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm + Vật liệu Vật liệu dùng trong thí nghiệm là mẫu da tai đƣợc lấy từ các heo nái thuần tại trại heo Đồng Hiệp. + Dụng cụ Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm: ống nghiệm, eppendorf các loại, pipet, đầu tip các loại, lọ thủy tinh đựng hóa chất, đầu lọc hóa chất, thùng đựng nƣớc đá, bình tam giác. + Các thiết bị, máy móc - Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) - Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) - Tủ lạnh 4oC và -20oC - Máy Vortex (IKA - Đức) 22 - Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) - Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) - Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) - Lò Viba (Electrolux) - Tủ sấy (Jencons-Anh) - Máy điện di (Biorad) - Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) - Đầu típ các loại (Đức) - Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản) - Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) - Máy PCR (BioRad – Thụy Điển) - Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) - Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) 3.4.2 Thu thập mẫu Lấy mẫu da tai của heo nái thuần Landrace, Yorkshire, và Duroc. Cách thu thập và bảo quản: Lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng. Mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh bảo quản. Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70o C. Khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích. 3.4.3 Ly trích DNA 3.4.3.1 Ly trích DNA từ mẫu da tai 1. Cho khoảng 5 mm3 da vào eppendorf 1,5 ml. Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. 2. Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS, pH = 8) và 3.5 l proteinase K (20 mg/ml). Ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1 giờ. 3. Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây. 4. Cho vào 300 l hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o C. 5. Lấy phần nƣớc nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20oC trong 2 giờ. 6. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn, làm ráo. 7. Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55oC trong 15 phút. 23 8. Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20o C trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn. 9. Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn. 10. Làm khô cặn trong tủ ấm 55o C 11. Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn. Sản phẩm sau khi ly trích đƣợc trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay. 3.4.3.2 Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Tiến hành đo sản phẩm DNA ly trích bằng quang phổ kế ở bƣớc sóng 260 – 280 nm. Nồng độ DNA đƣợc tính bằng công thức: Nồng độ (ng/μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36 DNA đƣợc xem là tinh sạch khi tỷ số mật độ quang ở bƣớc sóng 260 – 280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2. 3.4.3.3 Khuyếch đại mẫu và cắt bằng enzyme giới hạn + Phản ứng PCR Bảng 3.1 Nhiệt độ và thời gian của qui trình phản ứng PCR Bƣớc Qui trình phản ứng Nhiệt độ (o C) Thời gian (giây) 1 2 3 4 5 93 93 62 72 72 180 30 60 60 180 Từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại 35 lần 24 Ghi chú:  Đây là qui trình thí nghiệm với các điều kiện máy móc thiết bị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh trƣờng đại học Nông Lâm TP. HCM và đƣợc đánh giá là có tỷ lệ thành công cao (Bùi thị Trà Mi, LVTN Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Khóa 2001-2005) Phản ứng PCR đƣợc thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version 2.11.32) trên mẫu da sau khi ly trích với cặp primer: Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’ Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’ Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng 40C. Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí nghiệm của nƣớc ta nên chúng tôi tiến hành qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp nhƣ bảng 3.1. + Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là tỷ lệ tối hảo giữa primer và DNA mẫu. Nếu tỷ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện, tƣơng tự nhƣ trƣờng hợp DNA mẫu quá ít. Do đó việc xác định tỷ lệ giữa nồng độ primer và DNA mẫu trong phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Để xác định nồng độ thích hợp của primer trong phản ứng PCR phát hiện gen PRLR chúng tôi tiến hành thực hiện qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer nhƣ ở bảng 3.2. Bảng 3.2 Nồng độ cuối của các thành phần thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ PCR bufer 10X MgCl2 (25 mM) dNTPs ( 2,5 mM/µl) Mồi xuôi (10 pmol/µl) Mồi ngƣợc (10 pmol/µl) Taq polymerase (5UI/µl) DNA khuôn 1 X 1 mM 1 mM 8 pmol 8 pmol 2 UI < 250 ng Thể tích ( l) Nƣớc cất vừa đủ 20 µl 25 + Phản ứng cắt enzyme giới hạn  Xác nồng độ các hoá chất cắt enzyme giới hạn AluI Thể tích của các chất tham gia trong việc xử lý enzyme giới hạn đƣợc trình bày nhƣ bảng