Luận văn Xác định cấu trúc của polysaccharide dạng agar chiết từ một số loài rong đỏ

hững thông tin về độ dịch chuyển hóa học là khác nhau ở hai chiều cho nên phổ HSQC là không đối xứng qua đường chéo. Phổ HSQC cho biết thông tin về những proton 1H đính trực tiếp với nguyên tử 13C. Ở các phổ HSQC, chỉ những tín hiệu của các nhóm CHn với n≥ 1 mới thấy được. Điều đó có nghĩa là không có các thông tin về những carbon bậc 4. Phổ HMBC Phổ HMBC là phổ hai chiều dị nhân 1H – 13C HMBC, thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác ở cách nó 2, 3 liên kết do đó có tên là tương tác xa. Phổ HMBC thể hiện mối tương tác của 1H với nguyên tử 13C bậc 2 và bậc 3, có thể dự đoán vị trí các liên kết glycoside giữa các đơn vị đường trong polymer [36]. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. Từ đây, cho phép dự đoán liên kết glycoside tại carbon anomer là liên kết kiểu α hay β. Phổ 1H-1H COSY Phổ COSY là phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY, biểu diễn các tương tác của H-H, chủ yếu là các proton đính với carbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau. 30 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AGAR TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.4.1. Tình hình nghiên cứu agar trên thế giới Những nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc Người đầu tiên nghiên cứu về agar là Payen từ năm 1859, từ loài rong Đỏ Gelidium amansii. Những công trình nghiên cứu sau này xác định sự có mặt của các đơn vị β-D-galactose, 3,6-α-anhydro-L-galactose, α-L-galactose trong agar. Cấu trúc khác nhau giữa các agar được tìm thấy chủ yếu là do các nhóm thế như sulfate, pyruvic acid ketal, methoxy hoặc xylose [13], [17]. Các nghiên cứu về cấu trúc agar dựa trên việc thủy phân agar thành các phân đoạn bằng phương pháp hóa học hoặc enzyme, sau đó các phân đoạn được phân tích cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân ... [13]. Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm cấu trúc, thành phần hóa học của các dạng agar, các nhà nghiên cứu thường quan tâm đến đặc điểm và vị trí các nhóm thế đã tạo ra sự khác biệt trong cấu trúc giữa các phân đoạn agar. Một số nhà nghiên cứu đã đưa ra kết luận rằng mức độ methyl hóa agar ở từng vị trí khác nhau thì khác nhau và tùy thuộc vào các loài rong, chi rong cũng như vị trí địa lý mà nó sinh sống. Năm 2006, Praiboon J. và cộng sự khi nghiên cứu về agar trong một số loài rong Gracilaria ở Thái Lan và Nhật Bản đã nhận thấy rằng agar chiết từ chi rong Gracilaria có mức độ methyl hóa ở vị trí C6 của monomer DG lớn hơn vị trí C2 của monomer LA [31]. Trong công trình nghiên cứu về cấu trúc hóa học và tính chất của agar chiết từ các loài rong chi Gracilaria năm 1995, Murano E. đã tổng kết rằng agar chiết từ các loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng methyl lớn hơn agar chiết từ chi rong Gelidium và Pterocladia [29]. Khi nghiên cứu về nhóm sulfate trong các phân đoạn agar, các tác giả đã cho rằng agar thường chứa hàm lượng sulfate nhất định, hàm lượng này ít nhiều phụ thuộc vào chi rong, loài rong mà agar được tách chiết ra. Agar chiết từ các loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng sulfate lớn hơn agar chiết từ chi rong Gelidium và Pterocladia [29]. Nhóm sulfate của L-galactose-6- sulfate có thể bị thủy phân trong kiềm tạo cầu nối 3,6-anhydro, làm tăng hàm 31 lượng agarobiose, dẫn đến tăng khả năng tạo gel của sản phẩm agar thu được [13]. Trong khi đó, nhóm thế pyruvic acid ketal trong agar tương ứng là 4.1% và 2.92%. Với Gelidiella acerosa (Barbados) làm lượng agar khô là 8,5%, hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 4,6% và 0,12%. Còn hàm lượng agar khô trong Gelidium sesquipedale (Tây Ban Nha) là 28,5%, hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 3,2% và 0,04% [13]. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học như Karamanos và cộng sự [32] cũng như nhóm của Craigie [9] đã tìm thấy gốc 4-O-methyl-L-galactose tạo mạch nhánh qua liên kết O-C6 của β-D-galactose trong mạch chính của agar, trong các loài rong Gracilaria verrucosa và Gracilaria tikvahiae. Đặc điểm agar trong rong Đỏ mang tính địa phương rõ rệt. Chúng phụ thuộc vào các yếu tố của môi trường sinh thái mà rong sinh sống như mực nước có ổn định không, nồng độ muối như thế nào, giàu hay nghèo chất dinh dưỡng ... để rong phát triển với kích thước lớn, mật độ cao, quang hợp mạnh, tạo nhiều sản phẩm hữu cơ... Những nghiên cứu về quy trình tách Quy trình chiết – tách: Agar được sản xuất trong công nghiệp đầu tiên tại Nhật Bản vào năm 1886. Đến năm 1910, công nghệ lan sang Nam Phi, Đan Mạch, Chi Lê, Tây Ban Nha, Pháp, Mỹ, Hàn Quốc ... Ngày nay, khoảng 53% nguyên liệu cho chế biến agar là các loài rong thuộc chi Gracilaria, chi Gelidium khoảng 44% và 3% cho những loài rong Đỏ khác [13]. Trên thế giới, Gelidium là nguồn nguyên liệu có chất lượng agar tốt nhất, trong khi đó nguồn rong Gracilaria có hàm lượng agar cao nhưng sức đông lại thấp hơn, do có đặc điểm là chứa hàm lượng sulfate cao và hàm lượng agarose thấp. Để cải thiện sức đông của agar sản xuất từ rong chi Gracilaria người ta đã xử lý kiềm để loại bỏ bớt gốc sulfate, tăng hàm lượng agarose từ đó nâng cao sức đông của agar [13], [17]. Để thu được nhiều agar từ cây rong thường phải xử lý rong trước khi nấu chiết. Nhưng agar lại dễ bị thủy phân cắt mạch khi tiếp xúc với các điều kiện như acid, kiềm, enzymn nên phải lưu ý điều kiện thích hợp khi xử lý và nấu chiết rong. Bảng 1.3. Điều kiện xử lý kiềm của rong Gracilaria ở một số quốc gia [33] 32 Quốc gia Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ xử lý (toC) Thời gian xử lý (giờ) Argentina 6,0 50-60 1,0 Chile 6,0 – 7,0 88 – 90 2,0 Mexico 6,0 90 0,5-1,0 Nam Phi 6,0 70 1,0-1,5 Ấn Độ 20,0 70 1,0 Đài Loan 10,0 85 – 90 1,0 Bồ Đào Nha 4,0 – 5,0 60 1,0 Mặc dù công nghệ sản xuất agar đã có lịch sử hơn 100 năm nhưng cho đến ngày nay vẫn còn một số tác giả quan tâm nghiên cứu đưa ra các giải pháp công nghệ cho từng giai đoạn công nghệ nhằm giảm chi phí sản xuất hoặc thu được sản phẩm agar đạt chất lượng cao. Vào năm 2015, nhóm tác giả Yarnpakdee Suthasinee và các cộng sự [45] đã tiến hành công trình nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý kiềm trước khi nấu chiết (sử dụng NaOH và KOH ở các nồng độ khác nhau) đến hiệu suất thu hồi agar, tính chất hóa lý và tính chất gel của agar chiết từ loài rong Gracilaria tenuistipitata tại Songkhla, Thái Lan. Quy trình được thực hiện như sau: 30g rong khô được ngâm trong 1.500 mL dung dịch NaOH hoặc KOH ở các nồng độ khác nhau (3%, 5% và 7%) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng (27-30oC). Các hỗn hợp này sau đó được gia nhiệt ở 90oC trong bể ổn nhiệt (Memmert, Schwabach, Đức) trong 3 giờ khuấy liên tục. Sau khi tiền xử lý kiềm, rong được rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ các chất kiềm trong 2 giờ. Sau đó, các mẫu qua xử lý sơ bộ đã được trung hòa bởi dung dịch H2SO4 0,025% với tỷ lệ rong:dung dịch là 1:50, trong 1 giờ. Các mẫu rong sau đó được rửa bằng nước cho đến khi đạt môi trường trung tính (pH = 6,8-7,0), tiếp đó mẫu rong được nấu chiết tương tự như chiết agar không có xử lý kiềm (chiết tự nhiên (xử lý cồn)). Các mẫu rong được trộn lẫn với 1.500 mL nước 33 cất ở 95oC, chiết trong 1,5 giờ khuấy liên tục. Hỗn hợp sau khi nấu sẽ được lọc nóng, rồi tạo gel ở nhiệt độ phòng, đông lạnh trong 24 giờ và rã đông ở nhiệt độ phòng trong khoảng 4 giờ. Sau đó, các bản gel tăng được sấy khô ở 55oC cho đến khi trọng lượng thu được không đổi. Các thỏi agar khô được nghiền thành bột. Hàm lượng của agar được tính toán dựa trên trọng lượng khô của rong ban đầu. Kết quả cho thấy các tính chất hóa lý và tính chất gel của agar được chiết xuất từ Gracilaria tenuistipitata bị ảnh hưởng bởi các phương pháp xử lý bằng kiềm NaOH và KOH ở các mức độ khác nhau (3- 7oC). Hàm lượng thu được của agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) là 17,1%, trong khi các loại agar được xử lý trước với NaOH và KOH dao động từ 23,6% đến 26,1%. Agar với tiền xử lý bằng dung dịch kiềm nói chung cho thấy tính gel tốt hơn, minh chứng bởi sức đông gel, nhiệt độ nóng chảy và độ nhớt cao hơn so với agar thương mại, với hàm lượng LA khá cao. Ngoài ra, agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) có hàm lượng sulfate cao hơn so với các chế phẩm tiền xử lý kiềm. Bất kể nồng độ kiềm nào thì NaOH dùng cho tiền xử cũng làm cho agar có chất lượng cao hơn so với KOH có nồng độ tương ứng. Agar được xử lý với NaOH 5% có độ bền gel cao (482 g/cm2) với hiệu suất thu hồi cao (25,3%). Sự giảm tổng lượng sulfate và sự gia tăng hàm lượng LA đã được phát hiện ở agar có xử lý bằng dung dịch 5% NaOH so với không xử lý NaOH được xác định bởi quang phổ FTIR. Các tác giả đã chứng minh mạng lưới gel agar chiết có xử lý kiềm NaOH 5% có vòng xoắn nhỏ gọn hơn các trường hợp còn lại. Do đó, tiền xử lý thích hợp bằng cách sử dụng NaOH 5% có thể làm tăng hàm lượng và cải thiện tính chất gel của agar từ Gracilaria tenuistipitata thu được từ hồ Songkhla, Thái Lan. Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần có khả năng tạo gel của agar là agarose và agaropectin thì thành phần không tạo gel agaran sulfate cũng đã được quan tâm nghiên cứu trong công trình của các nhà khoa học Knudsen và cộng sự [26]. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định agaran là polymer dạng agar mà trong phân tử của chúng không có sự thay thế gốc α-L-galactose bằng 3,6- anhydro-α-L-galactose. Trong agaran này các nhóm OH ở các vị trí C4, C6 của gốc D-galactose và vị trí C2, C3 của gốc L-galactose có thể bị thế bởi nhóm sulfate thì gọi là agaran sulfate. 34 Agaran sulfate là thành phần có hoạt tính sinh học cũng đã được phát hiện trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số công trình được công bố không nhiều và đối tượng nghiên cứu tập trung là sulfate agaran chiết từ các loài rong như Acanthophora spicifera [22], Gracilaria corticata [23], Schizymenia binderi [16] và Bostrychia montagnei [21]. Các tác giả đã dùng phương pháp chiết lạnh để thu được agaran sulfate. Mẫu rong được xay ra dưới dạng bột, ngâm trong cồn để loại màu, chất béo, carbohydrat có trọng lượng phân tử thấp. Sau đó mẫu rong tiếp tục được chiết trong nước cất ở 25oC, trong vòng từ 15-18 giờ và khuấy liên tục. Polysaccharide được thu hồi bằng cách kết tủa trong cồn, ly tâm thu lấy kết tủa và rửa cồn bằng cồn 3 lần. Sản phẩm được tái hòa tan trong nước cất, lọc bỏ cặn và sấy khô. Các hợp chất agaran sulfate đã được dùng để khảo sát một số hoạt tính sinh học. Nổi bật là nghiên cứu vào năm 2001 của nhóm Duarte và cộng sự [21] phát hiện galactan sulfate được chiết xuất từ rong Đỏ Bostrychia montagnei Brasil có hoạt tính chống lại virus herpes simplex 1 và 2. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của cấu trúc lên hoạt tính chống virus của polysaccharide dạng agaran, các nhà khoa học [22] đã đưa ra kết luận là chỉ có agaran nào có hàm lượng nhóm thế lớn hơn một giá trị xác định và ở vị trí nhất định mới có hoạt tính chống virus. Quy trình chiết tách agar thường phải qua các giai đoạn cơ bản sau đây [13]: - Giai đoạn 1: Xử lý rong trước khi nấu chiết Để thu được agar với hiệu suất chiết cao và chất lượng tốt, cần phải xử lý rong trước khi nấu chiết. Công đoạn này nhằm tách và loại bỏ các chất màu, tạp chất phi agar có trong cây rong, bào mòn lớp màng bao bên ngoài cây rong để dễ chiết tách agar. Xử lý rong trong môi trường acid: Môi trường acid có tác dụng thủy phân bào mòn màng cellulose của cây rong đồng thời loại sắc tố ra khỏi cây rong. Mặt khác, acid còn có tác dụng khử khoáng, do đó nâng cao hiệu suất và giảm thời gian nấu chiết. Xử lý rong trong môi trường kiềm NaOH, đun nóng: nhằm làm trương nở tế bào, thủy phân và phá vỡ nhiều lớp tế bào sắc tố, loại lipid và một số protein tan trong kiềm. Ngoài ra, xử lý kiềm thích hợp cho quá trình chiết 35 agar còn nhằm loại bỏ gốc sulfate trong phân tử agar thông qua phản ứng đóng vòng từ porphyran (tiền thân của agarobiose) thành 3,6-anhydro-α-L- galactose, làm tăng độ bền gel [17] theo sơ đồ chuyển hóa được biểu diễn trong hình 3.7. Thông thường người sản xuất kết hợp phương pháp xử lý kiềm với xử lý acid để hạn chế việc làm thất thoát agar và làm giảm sức đông [13]. - Giai đoạn 2: Quá trình nấu chiết Agar không tan trong nước lạnh và tan được trong nước nóng. Nhưng nếu phân tử quá dài, việc hòa tan sẽ lâu. Do đó, cần phải thủy phân một phần để có các phân tử ngắn hơn để dễ tan trong dung dịch chiết. Tuy nhiên, nếu phản ứng thủy phân xảy ra mạnh thì các phân tử agar mạch quá ngắn sẽ có khả năng hòa tan trong nước lạnh khó thu hồi được [17]. Nhiệt độ nấu chiết là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và sức đông của agar. Nấu ở nhiệt độ thích hợp có thể phá vỡ được màng tế bào cây rong, tăng khả năng hòa tan của agar, độ nhớt dịch lọc thấp để dễ lọc, tăng hiệu suất chiết. Nếu nhiệt độ quá cao, thời gian nấu chiết giảm nhưng agar bị thủy phân cắt mạch, sức đông giảm. Đồng thời, nhiều tạp chất do cellulose bị nhiệt phân tạo thành hòa tan vào dịch chiết làm giảm chất lượng của agar. Nếu nhiệt độ quá thấp thì thời gian nấu chiết kéo dài agar cũng bị thủy phân cắt mạch, sức đông giảm. Mặt khác, mức độ hòa tan của agar giảm đi, hiệu suất chiết tách kém. Có thể sử dụng môi trường trung tính, môi trường kiềm loãng hoặc môi trường acid loãng để nấu chiết. Khi chiết trong môi trường trung tính, tại nhiệt độ cao các hợp phần polymer bị cắt mạch, agar sẽ được hòa tan vào nước nóng tạo dung dịch keo nhớt. Nếu nấu trong môi trường acid loãng thì màng cellulose bị cắt mạch, bị phân hủy trong môi trường acid nhanh nên giảm được thời gian nấu và nhiệt độ nấu. Mặt khác, trong môi trường acid mức độ phân tán các phân tử cao, độ nhớt thấp nên dễ lọc hơn. Môi trường acid có thể khử khoáng nên khả năng hòa tan của agar cao, do đó hiệu suất cao và dịch lọc trong hơn. Tuy nhiên, khi nấu trong môi trường acid loãng thì làm cho agar càng bị cắt mạch mạnh, do đó sức đông giảm đi. Nếu chọn môi trường kiềm loãng: Với những loài rong chứa nhiều gốc α-L-galactose-6-sulfate thì 36 môi trường kiềm thúc đẩy phản ứng tạo cầu nối 3,6-anhydro-α-L-galactose nên sức đông gel cao. Tuy nhiên, trước khi nấu chiết đã xử lý rong với kiềm, nếu tiếp tục nấu chiết trong môi trường kiềm ở nhiệt độ cao thì agar sẽ bị cắt mạch làm giảm hiệu suất chiết [13]. Thời gian nấu chiết là yếu tố phụ thuộc vào loài rong, phương pháp xử lý rong trước khi nấu chiết, môi trường nấu chiết và nhiệt độ nấu chiết. Lúc đầu khi mới nấu thì nồng độ agar thấp, độ chắc của thạch đông thấp. Sau đó khi tăng thời gian nấu thì nồng độ agar tăng dần lên và độ chắc của thạch tăng dần. Nếu thời gian nấu kéo dài thì agar dễ bị cắt mạch, do đó độ chắc của thạch giảm [17]. Tỷ lệ nước nấu (module thủy áp) ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi và độ chắc của thạch. Module thủy áp quá cao sẽ tạo dung dịch keo có nồng độ thấp, độ chắc thạch yếu, khó thao tác được các công đoạn sau, nhất là khi cắt sợi, cắt thỏi, ép, ... Thể tích chứa đựng lớn, cồng kềnh, gây tốn kém cho thao tác tách nước sau này. Song nó có ưu điểm là dễ lọc, hiệu suất chiết cao. Còn module thủy áp quá nhỏ thì thạch chắc nhưng nồng độ keo cao, độ nhớt rất lớn nên rất khó lọc. Tốc độ hòa tan của agar từ nguyên liệu do độ nhớt cao [13]. - Giai đoạn 3: Tách bã rong và các tạp chất cơ học Sau khi nấu chiết, ta thu được một dịch nhớt bao gồm agar hòa tan và một số thành phần phi agar như muối khoáng, sắc tố, cellulose và nhiều tạp chất khác lẫn theo rong. Do đó, cần phải lọc để loại bỏ những tạp chất không tan. Cần phải lọc nóng vì khi đó độ nhớ nhỏ và dễ lọc hơn. - Giai đoạn 4: Tách nước và các tạp chất hòa tan Agar hòa tan với nồng độ nhỏ trong dịch chiết, cần phải dùng một lượng lớn nước để nấu chiết. Đây cũng chính là điều khó khăn cho công đoạn tách nước sau này. Ngoài mục đích tách nước, các tạp chất hòa tan trong nước cũng được loại ra khỏi agar. Có các phương pháp có thể dùng để tách nước: bốc hơi, kết tủa, làm đông – tan và ép. Từ việc phân tích một số quy trình chiết xuất agar trong nước và trên thế giới cho thấy, để chiết xuất agar từ rong Đỏ có thể sử dụng hai phương pháp chiết agar không qua giai đoạn xử lý kiềm (chiết tự nhiên (xử lý cồn)) và 37 chiết agar có xử lý kiềm. Tuy nhiên, trong quá trình chiết xuất agar, các nhà sản xuất thường chỉ quan tâm đến việc xử lý nguyên liệu Agarophite để chiết thành phần agar có khả năng tạo gel cao, các dung dịch lọc khi xử lý rong ban đầu thường bị loại bỏ. Trong khi đó, các dung dịch này có thể chứa các hợp chất agaran sulfate [34] có hoạt tính sinh học. Vì vậy, cần thiết phải kết hợp phương pháp chiết agar [35] và phương pháp thu hồi các polysaccharide không tạo gel này trong quá trình xử lý rong [22] để tận dụng được nhiều thành phần trong nguyên liệu. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu agar trong nước Ở Việt Nam, agar được sản xuất bắt đầu từ năm 1960. Sản xuất công nghiệp agar bắt đầu tại miền Bắc Việt Nam (Hải Phòng). Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất agar ở Việt Nam là rong Gracilaria asiatica (rong câu chỉ vàng), Gracilaria tenuistipitata (rong câu mảnh) và Gelidiella acerosa (rong rễ tre). Gần đây, nhóm nghiên cứu của Phân Viện Vật liệu Nha Trang đã nghiên cứu sử dụng Gracilaria Heteroclada làm nguyên liệu sản xuất agar [7]. Nhưng nhìn chung sản lượng không cao và chất lượng agar chỉ đạt tiêu chuẩn thực phẩm, không dùng trong lĩnh vực đòi hỏi chất lượng cao và chưa đủ khả năng để cạnh tranh với agar nước ngoài. Vào năm 1997, nhóm tác giả Masao Ohno, Huỳnh Quang Năng và Susumu Hirase [35] đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học và chất lượng agar trong một số loài rong câu Gracilaria tenuistipitata và Gracilaria Heteroclada của Việt Nam, thu thập tại các vùng biển Hải Phòng, Sầm Sơn, Huế, Đồng Xuân, Ninh Hải. Các tác giả đã thực hiện quy trình như sau: cân 40g rong khô, xử lý bằng 2 Lít dung dịch NaOH 6% ở nhiệt độ 70oC và 80oC trong 3 giờ và rửa dưới vòi nước trong 30 phút. Sau đó rong được xử lý tiếp bằng 2 lít dung dịch H2SO4 0,1 lít – 0,18% trong 1 giờ và rửa lại dưới vòi nước trong 2 giờ. Mẫu rong sau khi xử lý đem chiết với 1,5 lít nước cất (pH = 7-8) ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ để thu được dung dịch agar, lọc và lấy dung dịch, loại nước khỏi dung dịch này bằng cách làm lạnh, xả đá, sấy khô thu được agar thành phẩm. Trong quy trình trên, các tác giả đã tiến hành thực hiện so sánh hàm lượng agar chiết được và chất lượng gel, trong đó có khảo sát sức đông gel agar để tìm điều kiện thích hợp khi tách chiết agar từ các loài 38 rong này. Yếu tố được thay đổi để khảo sát quy trình chiết đó là nhiệt độ xử lý kiềm NaOH. Kết quả thu được là điều kiện thích hợp để chiết agar từ rong câu mảnh Gracilaria Tenuistipitata ở Hải Phòng, Sầm Sơn, Huế là xử lý rong trong kiềm NaOH 6% đun nóng đến 80oC và acid H2SO4 dùng để xử lý thích hợp ở pH = 2,5. Trong khi đó, điều kiện thích hợp để chiết agar từ rong câu cước Gracilaria Heteroclada ở Đồng Xuân, Ninh Hải là xử lý rong trong kiềm NaOH 6% đun nóng đến 70oC, và acid H2SO4 dùng để xử lý thích hợp ở pH = 2,5. Như vậy, nguồn nguyên liệu Agarophite (chi Gracilaria) ở nước ta nói chung có hàm lượng agar và chất lượng agar (sức đông) dao động tùy theo chiết tự nhiên (xử lý cồn) hay có xử lý kiềm. Điều này được giải thích là do đặc điểm của rong Gracilaria có hàm lượng agarose thấp, trong khi hàm lượng sulfate lại cao. Công nghệ sản xuất agar tại Việt Nam về cơ bản không khác với quy trình sản xuất agar của thế giới. Tuy nhiên do đặc tính nguyên nguyên liệu rong đầu vào có chất lượng thấp nên trong quy trình sản xuất agar từ rong câu Việt Nam buộc phải có công đoạn xử lý kiềm nhằm tăng sức đông của agar. Nhưng biện pháp đó cũng có bất lợi bởi vì khi dùng kiềm mặc dù hàm lượng LA có tăng lên nhiều nhưng hiệu suất thu hồi agar bị giảm, do các phân tử polysaccharide mạch dài có thể bị bẽ gãy và tan vào dung dịch. 39 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về agar có trong 02 mẫu rong, là Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia. Trong đó: - Gracilaria Heteroclada xuất xứ tại đầm Ô Loan - huyện Tuy An và đầm Cù Mông, vịnh Xuân Đài, tỉnh Phú Yên Hình 2.1. Đầm Cù Mông – Xuân Đài – Phú Yên - Gracilaria Salicornia xuất xứ tại biển Hòn Chồng – Vĩnh Phước, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Hình 2.2. Hình ảnh bản đồ Hòn Chồng – Nha Trang – Khánh Hòa 40 Các mẫu rong này được thu hái vào khoảng tháng 3 đến tháng 5 năm 2018, được giám định bởi TS. Võ Thành Trung (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Mẫu được lưu trữ tại phòng Hóa phân tích – Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Sau khi thu thập, rong được phơi trên cát ở bờ biển cho khô bớt, chính vì vậy, rong còn chứa hàm lượng muối và cát lớn nên có thể bảo quản được rất lâu. Sau đó, rong được rửa lại bằng nước ngọt nhiều lần để sạch hết cát, ốc và muối còn lại, đem phơi âm can cho khô bớt rồi đem sấy khô. Cuối cùng, rong được bảo quản nơi khô ráo và ít ánh sáng, trong túi bóng kín. Hình 2.3. Sơ đồ sơ chế rong và lưu giữ mẫu 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide dạng agar Nguyên liệu: Rong phơi khô, bảo quản nơi khô ráo Hóa chất: Nước cất, dung dịch NaOH các nồng độ, dung dịch H2SO4 0,01% - 0,1% Dụng cụ: Cốc thủy tinh (các thể tích khác nhau), que khuấy thủy tinh, túi lọc, bếp điện... Quy trình chiết tách agar cơ bản: Hình 2.4. Quy trình chiết tách agar cơ bản [13] Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu liên quan, chúng tôi đưa ra quy trình chiết sau:  Chiết agar tự nhiên: Mẫu rong khô (15g) được ngâm trong cồn khoảng 1giờ để khử màu, sau đó được ngâm trong 400mL nước cất trong cốc thủy tinh để qua đêm. Quá trình chiết được tiến hành bằng việc bổ sung thêm nước và đun sôi hỗn hợp trong cốc thủy tinh trên bếp điện với nhiệt độ cố định ở 80oC liên tục trong 3 giờ. Sau đó lọc thu lấy dịch bằng vải lọc, vắt kiệt lượng lỏng còn lại 42 trong rong và lọc lại lần hai thu được dịch lọc có màu vàng nâu và độ nhớt lớn khi nguội dần. Dịch lọc được để nguội hẳn và được kết tủa bằng cồn trên bếp khuấy từ gia nhiệt. Kết tủa thu được là dạng keo sệt màu trắng hơi vàng đến vàng nâu. Kết tủa được để qua đêm để kết khối, thuận lợi cho quá trình tách dung môi. Kết tủa sau khi qua đêm sẽ kết khối lại và lơ lửng trong hỗn hợp. Dung môi được loại bớt một phần bằng cách chắt bớt ra sau đó được loại hoàn toàn bằng máy ly tâm cao tốc với tốc độ 6000 vòng/phút và được thực hiện trong ít nhất 10 phút, thu được keo polysaccharide màu vàng nâu, giống thạch. Sau đó được đem đông khô để loại hết dung môi thu được polysaccharide khô, giòn, có màu trắng, vàng đến vàng nâu. Tinh chế polysaccharide: Polysaccharide khô thu được sẽ được cho vào lọ thủy tinh rồi đem đun cho nóng chảy trên bếp khuấy từ gia nhiệt (vừa khuấy vừa đun) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Các cặn còn lại trong polysaccharides sẽ tách ra và nổi lên trên bề mặt keo hay chìm xuống dưới. Các cặn này được tách ra bằng cách cho ly tâm nóng keo tan chảy, khi đó cặn sẽ được loại bỏ và thu được polysaccharide sạch.  Chiết agar xử lý kiềm : Quy trình chiết tương tự như chiết tự nhiên (xử lý cồn) nhưng thay thế quy trình xử lý cồn bằng quy trình xử lý kiềm NaOH với nồng độ 6%. 2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của polysaccharide dạng agar 2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate Bằng phương pháp Phenol-Sulfuric [37]: Lấy 2 mL dung dịch cần xác định có nồng độ trong khoảng 40-100 µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc cho đến khi trong suốt. Thêm 10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc rồi để nguội, sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, để nguội, đo trên UV ở bước sóng 484,5 nm. 2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose Bằng phương pháp Recorcinol [38], coi fructose như là chất chuẩn: Lấy 1 mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL. Thêm 10 mL dung dịch thuốc thử Recorcinol – axetan ở nhiệt độ 20oC, lắc 43 trong 4 phút. Sau đó đun nóng đến 80oC trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 1,5 phút, đo trên máy UV-VIS ở bước sóng 555 nm. Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh. 2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC. Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu. Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ 100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức: Độ ẩm (%) = *100% 2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate Bằng phương pháp khối lượng