Luận văn Xác định hiệu suất, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc polysaccharide thủy phân từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phương pháp kết hợp enzym với axit

976 g/L và 35,872 ± 3,610 g/L, tƣơng ứng với hiệu suất thủy phân 42,8 % và 44,8 %.  Phƣơng pháp vật lí. Trong nghiên cứu của Mohammad Taghi Taghizadeh và Reza Abdollahi [14] sử dụng phƣơng pháp siêu âm, phƣơng pháp xúc tác quang và phƣơng pháp xúc tác quang siêu âm kết hợp để nghiên cứu khả năng cắt mạch của κ-carrageenan. Kết quả cho thấy sau 60 phút, trọng lƣợng phân tử trung bình của carrageenan sau cắt mạch bằng phƣơng pháp siêu âm giảm từ 126,92 x 103 kDa xuống còn 107,31 x 103 kDa, trong khi đó trọng lƣợng phân tử trung bình của hai phƣơng pháp xúc tác siêu âm và xúc tác quang siêu âm sử dụng TiO2 làm chất xúc tác, giảm còn 93,89 x103 kDa và 88,24 x 103 kDa tƣơng ứng. Một điều đáng chú ý là sau khi cắt mạch κ-carrageenan bằng phƣơng pháp xúc tác quang siêu âm, cấu trúc hóa học của carrageenan vẫn không thay đổi. L. Relleve và cộng sự (2005) [15] sử dụng phƣơng pháp chiếu xạ để biến tính κ-carrageenan, quá trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thƣờng bằng tia gamma từ nguồn Co-60 trên dung dịch κ-carrageenan 4 %. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi tăng liều bức xạ từ 10 kGy lên 30 kGy, trọng lƣợng phân tử trung bình giảm từ 10,5x104 Da xuống còn 6,2x104 Da; trọng lƣợng phân tử đạt giá trị thấp nhất là 1,3x104 Da khi liều chiếu xạ tăng lên 200 kGy. So với phƣơng pháp xúc tác quang siêu âm, cấu trúc hóa học của carrageenan có sự thay đổi, một số nhóm sulfat đã bị mất sau khi cắt mạch bằng phƣơng pháp chiếu xạ.  Phƣơng pháp sinh học. Phƣơng pháp thủy phân bằng eznzyme có đặc điểm thuận lợi là có thể thủy phân trực tiếp từ rong biển. Trong nghiên cứu của Fangyuan Duan và 25 cộng sự (2016) [19], rong E. Cottonii đƣợc thủy phân bằng enzym : đầu tiên thủy phân bằng enzym cellulase, sau đó tiếp tục thủy phân bằng enzym tái tổ hợp κ-carrageenan, đƣợc điều chế từ Escherichia coli BL21-HTa-cgkZ. Kết quả cho thấy bằng cách sử dụng phƣơng pháp GPC (sắc ký thẩm thấu gel) để xác định trọng lƣợng phân tử của dịch sau thủy phân, sau 4 giờ thủy phân số lƣợng carrageenan có trọng lƣợng phân tử thay đổi theo chiều hwớng trọng lƣợng phân tử cao giảm và trọng lƣợng phân tử thấp tăng lên, điều này chứng tỏ quá trình thủy phân bằng enzym đã cắt mạch polysaccarid thành các monosaccarid. Kết quả phân tích hóa học cho thấy sản phẩm cuối cùng bao gồm 79,79 % oligosaccharide và 18,89 % tro, với một lƣợng protein không đáng kể. Tác giả cũng ƣớc tính khoảng 64,8 % oligosaccharide κ-carrageenan có trong dịch thủy phân rong E. Cottonii. Sheng-Jun Wu (2012) [20] sử dụng enzym α-amylase để thủy phân κ- carrageenan. Trong nghiên cứu này, Sheng-Jun Wu sử dụng phƣơng pháp đo độ nhớt bằng nhớt kế mao quản để đánh giá hiệu suất thủy phân; kết quả nghiên cứu cho thấy khi thời gian thủy phân trong 1 giờ với 40 mg enzym α- amylase, nhiệt độ 50 0 C và pH = 7.5 thì độ nhớt giảm mạnh, độ nhớt tiếp tục giảm trong 4 giờ thủy phân và hầu nhƣ giảm không đáng kể sau đó. Liều lƣợng sử dụng enzym α-amylase cũng ảnh hƣởng đến độ nhớt của dịch thủy phân, khi tăng liều lƣợng lên hơn 40 mg thì độ nhớt thay đổi không đáng kể. Kết quả rút ra ở điều kiện tối ƣu t = 4 giờ; pH = 7.5; T= 50 0 C; và enzym α- amylase 40 mg trong dịch chiết có 5 g κ- carrageenan, hàm lƣợng và hiệu suất oligosaccharide từ carrageenan thu đƣợc sau thủy phân lần lƣợt tƣơng ứng là 96,5 % và 92,6 % (w/w). Một nghiên cứu khác của Bernadette M. Henares và cộng sự (2010) [21], Bernadette M. Henares sử dụng Pseudoalteromonas carrageenovora để thủy phân carrageenan. Pseudoalteromonas carrageenovora đƣợc nuôi cấy trong chất rắn hoặc môi trƣờng lỏng, chứa 2 % iota- hoặc kappa-carrageenan, hoặc các polysaccharides khác, và phát triển ở 27 °C trong hai ngày. Sau 5 ngày thủy phân đối với 0,5 % iota-carageenan và 2 ngày đối với 0,5 % kappa- carrageenan ở 40 0 C, kết quả nghiên cứu cho thấy khi Pseudoalteromonas 26 carrageenovora đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng sử dụng kappa-carrageenan sẽ cho hiệu suất thủy phân chất nền iota- và kappa-carrageenan (50 % và 99%) cao hơn so với khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng iota-carrageenan (hiệu suất thủy phân 10 % cho mỗi loại iota- hoặc kappa-carrageenan). Kết quả phân tích GPC cũng cho thấy sản phẩm sau thủy phân của kappa- carrageenan là các oligosaccarid có trọng lƣợng phân tử thấp.  Phƣơng pháp kết hợp enzym kết hợp axit Phƣơng pháp thủy phân axit và enzym kết hợp để thủy phân rong K. Alvarezii từ vùng biển Malaysia, Faiqah Abd-Rahim và cộng sự [18] đã nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố nhƣ nhiệt độ thủy phân, thời gian, hàm lƣợng rong, nồng độ axit và thời gian thủy phân enzym lên hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc tạo thành. Điều kiện thủy phân axit: hàm lƣợng rong 80 g/L, 0,2 M H2SO4, 110 0 C trong 90 phút; sau đó tiếp tục đƣợc thủy phân bằng enzym sử dụng enzym Celluclast với hoạt độ 150 FPU, pH = 5.5, 50 0 C trong 48 giờ; kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân bằng phƣơng pháp axit và enzym kết hợp đạt 62,35 %, lƣợng đƣờng khử tăng lên là 15,6 g/L. Kết quả nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu của Ge và cộng sự [67] và Wan và cộng sự [68] khi điều kiện thủy phân tƣơng đồng nhau trên hai loại rong tƣơng ứng là L. Japonica và G. Salicornia. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA 1.3. RONG SỤN Phân tích protein tổng số bằng phƣơng pháp Kieldahl [69] 1.3.1. Nguyên tắc Vô cơ hóa rong biển bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác đặc biệt, rồi dùng kiềm đặc mạnh NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 ra thể tự do, NH3 đƣợc hấp thụ bởi H2SO4 tiêu chuẩn. Sau đó định lƣợng H2SO4 tiêu chuẩn dƣ bằng NaOH tiêu chuẩn. Các phản ứng xảy ra: R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + SO2 + H2O +(NH4)2SO4 t 0 , xúc tác 27 2NaOH + (NH4)2SO4 Na2SO4 + NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 2NaOH + H2SO4 Na2SO4 + 2H2O Phân tích hàm lƣợng lipid tổng số bằng phƣơng pháp Folch 1.3.2. [70] Nguyên tắc Dùng hỗn hợp dung môi Chloroform : Methanol với tỉ lệ 2:1 để hòa tan tất cả chất béo trong thực phẩm, tách lớp và chiết qua phễu lọc nhiều lần. Sau khi làm bay hơi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lƣợng lipid trong 100 g thực phẩm. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng tro [69] 1.3.3. Nguyên tắc Tro hoá mẫu bằng nhiệt, sau đó xác định hàm lƣợng tro bằng phƣơng pháp khối lƣợng. Phƣơng pháp phân tích độ ẩm của rong biển khô [69] 1.3.4. Nguyên tắc Dùng nhiệt độ cao làm bay hết hơi nƣớc trong rong. Cân khối lƣợng rong trƣớc và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm (%) nƣớc có trong rong. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng sau 1.3.5. thủy phân [71] Xác định carbohydrate tổng số bằng phƣơng pháp phenol-sulfuric axit Phân tích trọng lƣợng phân tử của oligo carrageenan bằng 1.3.6. phƣơng pháp sắc kí thẩm thấu (GPC). GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký dùng để phân tách các phân tử kích thƣớc lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột. Sắc ký thẩm thấu gel là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay. 28 GPC có thể xác định một số thông số về cấu trúc quan trọng bao gồm nhƣ trọng lƣợng trung bình (Mw), trọng lƣợng phân tử trung bình số (Mn), và đặc trƣng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lƣợng phân tử của nó. GPC đƣợc sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn nhƣ polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên nhƣ polysaccharide, carrageenan. GPC còn có thể tách một hợp chất cao phân tử phức tạp thành các bộ phận cấu thành của nó - polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia. Ngoài ra, GPC đƣợc kết hợp với tán xạ ánh sáng, máy đo độ nhớt và máy dò nồng độ , nó có thể đo trọng lƣợng phân tử tuyệt đối, kích thƣớc phân tử và độ nhớt nội tại và tạo ra thông tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, tập hợp và phân nhánh. Nguyên tắc chung: Mẫu đƣợc đƣa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, và đƣợc pha động dẫn chạy qua cột. Sự chia tách theo kích thƣớc đƣợc thực hiện nhờ sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó đƣợc pha tĩnh giữ ở trong các lỗ xốp của gel. Khoảng kích thƣớc lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kích thƣớc phân tử đƣợc chia tách qua quá trình sắc ký. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cả khoảng không gian của lỗ xốp và đƣợc rửa giải trong tổng thể tích thấm Vt. Các phân tử có kích thƣớc lớn hơn kích thƣớc lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyển đƣợc dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không bị giữ lại, đƣợc rửa giải trong thể tích loại trừ Vo (thể tích trống). Sự chia tách theo kích thƣớc phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm, chia tách hiệu quả thƣờng đƣợc thực hiện ở hai phần ba đầu tiên của khoảng này. Xây dựng một đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa thể tích lƣu của các chất chuẩn dùng cho hiệu chuẩn và hàm logarit của khối lƣợng phân tử của chúng. Đƣờng chuẩn thƣờng xấp xỉ với một đƣờng thẳng nằm giữa giới hạn loại trừ và giới hạn thấm tổng thể. Khối lƣợng phân tử của thành phần quan tâm có thể đƣợc ƣớc lƣợng từ đƣờng chuẩn. 29 Phân tích đặc trƣng cấu trúc oligo carrageenan bằng phổ 1.3.7. hồng ngoại ( IR). Phƣơng pháp quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR) là một trong những kỹ thuật hữu ích và phổ biến để nghiên cứu xác định cấu trúc polysaccharide nhƣ carageenan có trong thành tế bào thực vật dựa trên phân tích các đỉnh hấp thụ ở các số sóng nhất định. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại cung cấp thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharide nhƣ pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển [72]. Phổ IR là một kỹ thuật dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử trong phân tử. Theo nguyên lí, phổ IR nhận đƣợc bằng cách cho tia bức xạ IR đi qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lƣợng nhất định. Năng lƣợng tại pick bất kì trong phổ hấp thụ xuất hiện tƣơng ứng với tần số dao động của một phần của phân tử mẫu [73]. Một trong các lợi thế của phổ IR là hầu nhƣ bất kỳ mẫu nào và trạng thái nào cũng có thể nghiên cứu đƣợc [74]. Kỹ thuật này cũng thể hiện hai ƣu điểm chính: lƣợng mẫu sử dụng để đo phổ nhỏ (miligam) và kết quả cho độ chính xác đáng tin cậy. Tuy nhiên, quang phổ hồng ngoại thông thƣờng đòi hỏi các thủ tục tốn nhiều công sức để thu đƣợc phổ với tỷ lệ tín hiệu / nhiễu tốt [72]. Hạn chế này đã đƣợc khắc phục với sự phát triển của kỹ thuật phổ kế IR biến đổi Fourier (đƣợc gắn với máy tính) nên chất lƣợng phổ cải thiện đáng kể và giảm bớt thời gian đo mẫu, đƣợc gọi là quang phổ FT - IR (Fourier Transform IR). Phân tích phổ hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên kết điển hình trong cấu trúc của carrageenan: các dải sóng hấp thụ ở 1220 - 1260 cm −1 của nhóm S=O ester sulfat, 928 - 933 cm −1 của nhóm C-O 3,6-Anhydrogalactose, 840 – 850 của cm −1 của nhóm C-O-S của Galactose-4-sulfat, 800-805 cm −1 của nhóm C-O-S của 3,6- Anhydrogalactose-2-sulfat 30 2CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu là carrageenan đƣợc chiết tách rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) đƣợc nuôi trồng và khai thác tại huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận vào tháng 6 năm 2019. Hình 2.1. Rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty DỤNG CỤ-THIẾT BỊ-HÓA CHẤT: 2.2.  Dụng cụ: Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm nhƣ: ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đông, pipet, cuvet, giấy lọc, nhiệt kế, bình định mức  Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: - Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR SPECPTROMETER. - Cân phân tích CP224S Satorius 31 - Hệ thống sắc ký lọc gel GPC-2414 Waters-Mỹ - Máy sấy chân không: FRANCE-ETUVE - Máy đo quang: SHIMAZDU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER - Máy đo phổ IR: TENSOR 27 - BRUKER - GERMANY - Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc, điện áp 220V/ 50Hz, công suất 2400W, tốc độ quay 28000 r.p.m.  Hóa chất H3PO4(TQ), enzym Viscozyme® L do hãng NovoNordisk Đan Mạch sản xuất, H2SO4(TQ), cồn 96 0 và một số hóa chất khác. Các hóa chất đều đảm bảo độ tinh sạch sử dụng trong phân tích. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3. Phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn 2.3.1. Các thành phần hóa học của rong sụn đƣợc phân tích 03 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần phân tích. Phân tích protein thô bằng phương pháp Kieldahl [69] 2.3.1.1. Protein thô đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Kjeldahl, đƣa vào bình nón chịu nhiệt 1 g mẫu rong, thêm vào đó 30 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, tiếp theo 10 g K2SO4 và 1 g CuSO4. Ban đầu hỗn hợp đƣợc đun nhẹ cho đến khi hết sủi bọt thì đƣợc tăng mạnh lên. Khi dung dịch trở nên không màu hoặc trong suốt, đƣợc đun thêm 1 h nữa, để nguội, pha loãng với nƣớc cất và chuyển vào bình Kjeldahl 800 mL. Đƣa vào bình 3 hoặc 4 hạt kẽm kim loại và 100 ml dung dịch NaOH 40 % và bình đƣợc nối với đầu phun của thiết bị chƣng cất. Tiếp theo đƣa 25 ml dung dịch H2SO4 0,1 N vào trong bình hứng và chƣng cất. Khi hai phần ba lƣợng chất lỏng đã đƣợc chƣng cất, kiểm tra xem phản ứng đã xảy ra hòa toàn chƣa. Bình thu đƣợc lấy ra chuẩn với dung dịch NaOH nồng độ 0,1 N. Từ lƣợng H2SO4 bị mất đi xác định hàm lƣợng nitơ. Sau đó chuyển đổi về hàm lƣợng protein: 32 Tính kết quả Protein tổng số của rong biển đƣợc tính bằng công thức sau: mProtein = mNitrogen x 6,25 Phân tích lipid thô bằng phương pháp Folch [70] 2.3.1.2. Tách lipid từ mẫu: Cân 1 g mẫu đã đƣợc bằm nhuyễn và trộn đều, cho vào ống thuỷ tinh vial cao thể tích 20 mL. Cho thêm 600 μl nƣớc cất, 5 mL methanol, 10 mL chloroform và 200 μL BHT (Butylated hydroxy toluen). Ngâm mẫu trong dung môi khoảng 10 phút. Đồng hóa mẫu bằng máy trong 1 phút. Đổ vào ống xilanh có lót tấm giấy lọc GF/C ở dƣới đáy cho dịch mẫu chảy xuống hết hoàn toàn. Cho thêm 5mL methanol và 10 mL chloroform vào vial và đồng hóa mẫu trong 20 giây. Đổ dung dịch này vào xilanh, cho mẫu đƣợc lọc hết hoàn toàn. Sử dụng pitton xilanh để ép tống dung dịch còn lại trong xilanh xuống phễu chiết 100 mL. Cho thêm 7,5 mL NaCl 0,9 % vào phễu chiết chứa dịch mẫu. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần và giữ mẫu ở 5 o C trong khoảng 4 giờ để dịch mẫu phân chia thành 2 lớp. Chiết rút dung dịch lipid Tách lớp dƣới (chứa hàm lƣợng lipid hòa tan trong dung môi) cho chảy vào phễu chiết thể tích 50 ml. Loại bỏ lớp dịch phía trên (chứa phần hỗn hợp gồm các tạp chất đƣợc loại nhƣ nƣớc, muối, protein.). Xác định thể tích chiết ở trên (V). X = ¼ V (mL) Cho thêm 5 mL MeOH 50 % vào mỗi mẫu trong phễu chiết 100 mL. Đảo trộn ngƣợc phễu chiết nhiều lần. Cho phân chia tách thành 2 lớp và lắng qua đêm ở 5 o C. Định lƣợng lipid Lớp dƣới đƣợc rút chảy xuống bình cầu 100 mL. Cô quay chân không làm bay hơi dung môi trong bình cầu ở 37 o C đến khi còn lại thể tích khoảng 1 mL. Hòa tan mẫu lại ngay lập tức bằng một lƣợng thể tích nhỏ chloroform (chỉ cho phép tiếp xúc rất nhỏ lƣợng mẫu đã làm khô với không khí). Chuyển 33 lƣợng mẫu qua bình định mức 5 mL, tráng rửa bình cầu nhiều lần và định mức bằng chloroform vừa đủ 5 mL. Sau khi xử lý xong, dung dịch này đƣợc mang đi xác định hàm lƣợng lipid tổng. Dung dịch này có thể lƣu giữ trong tủ đông –20 o C. Xác định hàm lƣợng lipid tổng Lấy chính xác 2 mL dung dịch mẫu đã xử lý cho vào một ống thuỷ tinh có nắp 4 mL đã đƣợc sấy chân không và cân với lƣợng không đổi, làm khô bằng khí nitơ. Cho vào tủ sấy chân không đến khối lƣợng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi trong một giờ. Lipid tổng số (%) tính theo công thức: % Xt (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.Vm % Xk (g/g) = [(m1 - m0).Vdm.100] / m.T.Vm Xt: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng tƣơi của mẫu Xk: Hàm lƣợng lipid tổng số tính theo trọng lƣợng khô của mẫu m1: Trọng lƣợng cân ống vial và mẫu sau sấy (g). m0: Trọng lƣợng cân ống vial khối lƣợng không đổi (g). m: Trọng lƣợng cân mẫu (g). Vdm: Thể tích định mức sau xử lý (mL) Vm: Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (mL) T: thành phần khô của mẫu, T = (100 - W)/100 W: Độ ẩm của mẫu (%) Phân tích hàm lượng tro [69] 2.3.1.3. Chén nung đƣợc rửa sạch và nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 o C đến khối lƣợng không đổi, sau đó cân mẫu rong 1,0 g cho vào cốc nung, đem đun trên bếp điện đến khi hóa than đen. Sau khi hóa than ta chuyển vào lò nung ở nhiệt độ 550 ÷ 600 o C để hóa tro hoàn toàn (chuyển màu trắng), lặp lại ít nhất 2 lần và cân đến khối lƣợng không đổi. 34 Tính kết quả Tính ra tỷ lệ % của tro chứa trong rong biển theo công thức sau: X (%) = (A - B).100 / m A: Khối lƣợng chén nung + tro (g) B: Khối lƣợng chén nung (g) m: Số gam rong biển dùng để thí nghiệm. Phân tích độ ẩm [69] 2.3.1.4. Sấy cốc đến khối lƣợng không đổi: Rửa sạch cốc, để khô, sấy ở nhiệt độ 130 o C trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm, cân, tiến hành sấy tiếp ở nhiệt độ 130 o C khoảng 1 giờ, làm nguội trong bình hút ẩm, cân, sấy tiếp đến khi nào khối lƣợng cốc giữa hai lần cân không lệch nhau quá 5.10 -4 g là đƣợc. Cân chính xác 1,0 g rong biển khô (đã cắt nhỏ) cho vào cốc sấy đã xác định khối lƣợng không đổi. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 80 o C trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 130 o C trong 1 giờ. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng rồi tiếp tục cho vào tủ sấy trong thời gian 1 giờ, lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân nhƣ trên cho tới khi khối lƣợng không đổi. Kết quả giữa 2 lần cân không lệch nhau quá 0,5 mg cho mỗi mẫu chất thử. Tính kết quả Độ ẩm tính theo % X = Hiệu số khối lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy / Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy Carbohydrate tổng số: Carbohydrate (%) = 100 - (% độ ẩm+ % protein+ % lipid +% tro) [74] 35 Phƣơng pháp thủy phân tạo oligo carrageenan 2.3.2. Thủy phân carrageenan bằng phƣơng pháp enzym Viscozyme L 2% theo hƣớng dẫn nhà sản xuất kết hợp axit H3PO4 0,15M đƣợc khảo sát ở các điều kiện thủy phân nhƣ thời gian ủ enzym, thời gian thủy phân, khảo sát sự ảnh hƣởng của enzym giữa các mẫu. Dịch oligo-carrageenan sau thủy phân đƣợc xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng và trọng lƣợng phân tử trung bình. Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng[71]. 2.3.3. Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn Phƣơng pháp phân tích khối lƣợng phân tử bằng phƣơng 2.3.4. pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) Khối lƣợng phân tử trung bình của oligo carrageenan xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) Phép đo GPC đƣợc thực hiện với cột Ohpak SB-804 HQ tại Viện Công Nghệ Hóa Học. Nhiệt độ của cột đƣợc giữ ở 75 0 C dung dịch oligo carrageenan có nồng độ 1mg/ml. Thể tích mẫu bơm là 0,5ml với tốc độ 1,2ml/phút. Dung dịch NaCl (1mg/ml) đƣợc sử dụng làm chất rửa giải. Đặc trƣng cấu trúc carrageenan đƣợc đánh giá bằng phổ IR 2.3.5. Phƣơng pháp hồng ngoại là một phƣơng pháp đơn giản, thuận tiện đƣợc sử dụng để xác định một số nhóm chức trong phân tử carrageenan. Phép đo này chỉ đòi hỏi một vài milligam mẫu khô đƣợc sấy, nghiền và trộn với bột KBr theo tỷ lệ 1: 2. Phổ hồng ngoại FT-IR của oligo Carrageenan đƣợc ghi trên máy TENSOR 27 - BRUKER – GERMAN đo tại Viện Công Nghệ Hóa Học. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 700 đến 1400 cm -1 ta có thể xác định đƣợc các nhóm chức của oligo carrageenan. [58] 36 THỰC NGHIỆM 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4.1. Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 37 Thu và xử lý nguyên liệu 2.4.2. Hình 2.3. Qui trình xử lý rong biển trƣớc khi xử lí enzym Giải thích quy trình: Rong sụn khô Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty đƣợc thu mua tại các xã ở huyện Ninh Hải tỉnh Ninh Thuận. Cho rong vào nƣớc ngọt ngâm 20-30 phút, vừa ngâm vừa khuấy trộn nhằm rửa mặn và giảm bớt lƣợng tạp chất bám trên rong. Sau đó rong đƣợc sấy khô khoảng 60 0 C cho đến khi lƣợng ẩm còn 5-10 %, rong đƣợc xay nhuyễn thành bột. 38 Thủy phân rong sụn bằng enzym kết hợp axit ở các điều kiện 2.4.3. khác nhau So sánh hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym và không xử 2.4.3.1. lí enzym Hình 2.4. Qui trình thủy phân mẫu xử lí enzym và mẫu không xử lí enzym Giải thích quy trình: Bột rong:nƣớc= 1:50 (10g rong:500 mL nƣớc) đƣợc xử lí bằng enzym Viscozym L 2% ủ 1 ngày. Sau đó đƣợc thủy phân trực tiếp bằng axit H3PO4 0,15M, t 0 =70 0 C. Thủy phân cùng điều kiện cho mẫu không xử lí enzym. Từ đó xác định hiệu suất thủy phân giữa mẫu xử lí enzym và không xử lí enzym. 39 So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian xử lí enzym từ 1-2 2.4.3.2. ngày Hình 2.5. Qui trình thủy phân xử lí enzym 1-2 ngày. Giải thích quy trình: Bột rong:nƣớc= 1:50 (10g rong:500ml nƣớc) đƣợc xử lí bằng enzym Viscozym L 2% lần lƣợt ủ trong thời gian 1 ngày và 2 ngày. Sau đó đƣợc thủy phân trực tiếp bằng axit H3PO4 0,15M, t 0 =70 0 C. Từ đó xác định hiệu suất thủy phân giữa các mẫu xử lí enzym 1 ngày và 2 ngày 40 So sánh hiệu suất thủy phân trong thời gian 60-120 phút 2.4.3.3. Hình 2.6. Qui trình theo thời gian thủy phân Giải thích quy trình: Bột rong:nƣớc= 1:50 (10g rong:500ml nƣớc) đƣợc xử lí bằng enzym Viscozym L 2% lần lƣợt ủ trong thời gian 1 ngày. Sau đó đƣợc thủy phân trực tiếp bằng axit H3PO4 0,15M, t 0 =70 0 C với thời gian thủy phân từ 60 phút-120 phút. Thủy phân cùng điều kiện cho mẫu không xử lí 41 enzym. Từ đó xác định hiệu suất thủy phân và lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp. Thu hồi oligo carrageenan 2.4.4. Dịch sau khi thủy phân bằng phƣơng pháp thủy phân với xúc tác axit đƣợc tiến hành loại bỏ phần khối lƣợng phân tử lớn bằng cách kết tủa ở nồng độ cồn 75%, phần dung dịch còn lại đƣợc bổ sung thêm cồn 98% để đạt tỉ lệ cồn : dịch thủy = 1:9, để kết tủa oligo carrageenan, đem ly tâm thu kết tủa và sấy khô ở nhiệt độ 60 0 C. Phân tích hàm lƣợng carbohydrat tổng [71] 2.4.5. Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lƣợng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn. Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lƣợng phân tử dịch 2.4.6. thủy phân [75] Sau quá trình thủy phân, tiến hành lọc dịch thủy phân: xác định hàm lƣợng carbohydrat tổng và tính hiệu suất thủy phân theo công thức: Trọng lƣợng phân tử trung bình của oligo carrageeenan trong dịch sau thủy phân đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC). 42 3CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RONG SỤN 3.1. Các thành phần hóa học của rong sụn – Kappaphycus alvarezii nhƣ: carbohydrat, protein, chất béo và tro đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Thành phần hóa học của rong sụn – Kappaphycus alvarezii Thành phần hóa học Tỉ lệ (%) Carbohydrat 55,17 Tro 28,56 Độ ẩm 9,34 Protein 6,42 Lipid 0,51 Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy rong sụn Kappaphycus alvarezii sinh trƣởng tại vùng biển Ninh Thuận thu hoạch vào tháng 6 năm 2019 có hàm lƣợng protein là 6,42 % nhỏ hơn, hàm lƣợng tro là 28,56 % và lipit 0,51 % là tƣơng đƣơng so với các công trình công bố trên thế giới. Các báo cáo của Fujiwara và cộng sự [76], Ruperes [77], cho thấy hàm lƣợng protein trong rong đỏ chứa từ 10 đến 47 %, hàm lƣợng tro dao động từ 20 đến 40 % và hàm lƣợng lipit < 4 %. Hàm lƣợng tro cao trong rong biển có liên quan đến khả năng hấp thụ khoáng chất và các nguyên tố vi lƣợng từ môi trƣờng xung quanh. Ngoài ra kết quả này cũng tƣơng đƣơng với kết quả phân tích thành phần rong sụn Kappaphycus alvarezii thu hoạch tại Ninh Thuận tháng 04 năm 2009 của TS. Bùi Minh Lý và cộng sự [78]: tro 28,6 %, protein 4,5 %, lipit 0,4 % Rong biển không giống nhƣ những thực vật khác, rong biển hầu nhƣ không có cấu trúc phân nhánh các polyme carbohydrat nhƣ lignin và hemixenlulo (Masarin và cộng sự 2016). Siddhanta và cộng sự (2009) báo 43 cáo rằng rong biển K. alvarezii chứa khoảng 2,0 % cellulose, khá thấp so với các loài rong biển khác.[79] HIỆU SUẤT THỦY PHÂN CARRAGEENAN 3.2. Ảnh hƣởng của enzym trong quá trình thủy phân 3.2.1. Thí nghiệm tiến hành trên 2 mẫu gồm mẫu xử lí enzym Viscozyme L 2% và mẫu không xử lí enzym đều ủ 1 ngày, chiết 1h, t 0 =70 0 C. Kết quả phân tích thể hiện ở Bảng 3.2. Hiệu suất thủy phân mẫu xử lí enzym đạt 38,53 % tăng so mẫu không xử lí enzym đạt 30,16 % tăng 8,37 %. Hàm lƣợng carbohydrat tổng của mẫu