Luận văn Xác định một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam

g để phân biệt các chủng lao gây bệnh trong các mycobacteria [41]. 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO 1.3.1. Phương pháp soi trực tiếp Phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn lao trước đây thường dựa vào thao tác nhuộm Ziehl-Neelsen sau đó soi trực tiếp trên kính hiển vi. Đây là một phương pháp phát hiện nhanh chỉ trong 30 phút đến 1 giờ, khá đơn giản và có chi phí thấp nhưng nồng độ vi khuẩn phải đạt 104 khuẩn/1ml nên độ nhạy thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn lao. Người ta đã cải tiến phương pháp này bằng kĩ thuật li tâm và cô đặc để làm tăng độ nhạy của chẩn đoán. Ở các nước phát triển họ sử dụng kính hiển vi huỳnh quang nhằm nâng cao độ nhạy và rút ngắn thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền thống dựa trên cơ sở của phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen. Phương pháp này có ưu điểm là cho kết quả nhanh và không đòi hỏi quá khắt khe về kỹ thuật do đó làm giảm những lỗi nhỏ trong quá trình làm thí nghiệm. Nhược điểm của phương pháp là giá thành của các hóa chất, thiết bị dùng cho thí nghiệm rất đắt đó là vấn đề lớn đối với các nước nghèo và có thu nhập thấp. Những năm gần đây phương pháp nhuộm diacetate đánh dấu huỳnh quang được sử dụng nhằm đánh giá sự có mặt cũng như khả năng tồn tại của vi khuẩn trong các mẫu đờm. Phương pháp này được đề xuất để phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn lao đã qua điều trị nhưng chưa thành công do giá thành cao [27, 34]. 1.3.2. Phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy vi khuẩn lao trước đây được coi là phương pháp tiêu chuẩn trong chẩn đoán phát hiện trong phòng thí nghiệm. Đây là phương pháp được thực hiện trong môi trường Lowenstein . Nhược điểm của nó là chậm và mất nhiều thời gian (4-8 tuần), nhưng ngược lại nó khá đơn giản và giá thành thấp. Đã có những phương pháp cải tiến trên môi trường nuôi cấy lỏng chẳng hạn như phương pháp BACTEC đánh dấu phóng xạ hay hệ thống phát hiện tự động mycobacteria MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) sử dụng huỳnh quang và đã làm tăng được tốc độ chẩn đoán [17]. Ngoài ra còn một số phương pháp chẩn đoán khác cũng được đề cập tới như phương pháp γ-interferon (IFN-γ) [17, 18] và phương pháp BacT/Alert 3D. Những phương pháp này đều có những ưu nhược điểm nhất định và điều cơ bản nhất là giá thành, thời gian cũng như độ chính xác của từng phương pháp là những vấn đề cần phải xem xét. Chính vì vậy các phương pháp này không thường xuyên được sử dụng trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn lao. 1.3.3. Sinh học phân tử trong chẩn đoán lao 1.3.3.1. Kĩ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh vào năm 1985 bởi nhà hóa sinh người Mỹ Kary Mullis và được hoàn thiện hơn bởi Saiki và cộng sự. Nguyên lý của kĩ thuật này đã được Khorana và đồng nghiệp mô tả từ trước đó. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu nhờ vào các gen đích tương ứng với các DNA này và các thành phần cần thiết của phản ứng PCR. Kỹ thuật này đã được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực như khoa học hình sự, mô bệnh học, các chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán các mầm bệnh [4, 12, 13, 14, 15, 20, 28]. Những nghiên cứu ở cấp độ phân tử về vi khuẩn lao cho thấy các yếu tố DNA lặp lại trong M. tuberculosis có liên quan với sự đa dạng DNA trong nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao. Sự đa dạng này cho phép các nhà nghiên cứu phân biệt được các chủng lao khác nhau. Vì vậy các yếu tố này rất quan trọng và cần thiết trong các nghiên cứu dịch tễ học bệnh lao, như nghiên cứu sự lây truyền trong cộng đồng, sự bùng nổ dịch và đặc biệt là đường lây của các chủng kháng thuốc. Có hai dạng yếu tố DNA lặp lại đó là: yếu tố IS 6110, yếu tố này có khả năng di chuyển, đoạn gen đích này có chiều dài 1300 cặp base. Ngoài ra còn có yếu tố khác là yếu tố lặp lại trực tiếp DR (Direct Repeat). Yếu tố IS6110 là yếu tố được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu dịch tễ học vì có trong nhiều chủng vi khuẩn lao khác nhau. Tuy nhiên một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng một số chủng M. tuberculosis không chứa trình tự IS6110, như các chủng phân lập được từ Đông Nam Châu Á và Ấn Độ. Theo Ernesto Liebana và cs (1996) thì có tới 4 chủng trong 304 chủng M. tuberculosis phân lập ở Việt Nam không có trình tự IS6110 do đó có thể gây ra hiện tượng âm tính giả [30]. Các nghiên cứu cũng đã phát hiện trình tự IS 1081 có ở tất cả các chủng M. tuberculosis nghiên cứu và không tìm thấy ở các loài thuộc họ Mycobacteria khác, do đó có thể dùng cả IS 1081 cho phản ứng PCR và Multiplex PCR để phát hiện M. tuberculosis đặc biệt là các chủng ở Đông Nam Á [23]. Ngoài ra gen 23S rDNA là đoạn gen mã hoá cho tiểu phần 23S của ribosome cũng được các tác giả gợi ý sử dụng trong việc phát hiện và xác định sự có mặt của vi khuẩn lao [39]. 1.3.4.2. Kĩ thuật multiplex PCR Kỹ thuật multiplex PCR đã ra đời như một bước hoàn thiện hơn về khả năng chẩn đoán của PCR. Chamberlain và cộng sự là những người đầu tiên mô tả, phát triển kỹ thuật multiplex PCR vào năm 1988. Trong kỹ thuật multiplex PCR, nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc bằng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng. Kỹ thuật multiplex PCR tiết kiệm thời gian, công sức và đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán phân tử bao gồm phân tích đột biến gen, tính đa hình DNA, phân tích định lượng, phân tích đột biến và phát hiện RNA. Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này rất có giá trị trong chẩn đoán xác định virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng, ngoài ra kỹ thuật này còn để phân tích các sinh vật chuyển gen, phân tích microsatelite và xác định kiểu gen. Đặc biệt, phản ứng multiplex PCR rất hữu ích cho việc phát hiện trực tiếp M. tuberculosis từ các mẫu lâm sàng . Với các kết quả nghiên cứu về tính khuyết gen ở một số chủng lao trên thế giới đã được công bố thì việc tiến hành multiplex PCR càng trở nên cần thiết. 1.3.4. Một số nghiên cứu về tỷ lệ khuyết gen của M.tuberculosis trên thế giới Trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về hiện tượng khuyết gen và số lượng bản copy của gen IS6110 ở M. tuberculosis. Một số nghiên cứu tiến hành trên các chủng lao có nguồn gốc từ Châu Phi và Châu Âu cho thấy sự hiện diện của 5 đến 15 bản copy của IS6110. Tác giả Van Soolingen và cộng sự (1991) công bố rằng nhiều chủng ở Đông Nam Á và khoảng 30% các chủng ở Ấn Độ chỉ chứa một bản sao của IS6110 [53]. Năm 1993 Lilly K. W. Yeun và cộng sự khi nghiên cứu 41 chủng lao từ các bệnh nhân có gốc Việt Nam đã thấy 5 chủng chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 và 4 chủng trong số đó không chứa các trình tự IS6110 [40]. Một số chủng từ Malaysia, Tanzania và Oman cũng có duy nhất một bản sao của IS6110 [32]. Das và cộng sự (1993) đã công bố trong một nghiên cứu khoảng 40% các chủng từ Madras không có hoặc chỉ có duy nhất một bản sao của IS6110 [24], Ở các chủng lao chỉ có duy nhất một bản sao hoặc không có bản sao nào cho gen IS6110 thì việc sử dụng trình tự gen đích này trong việc phát hiện vi khuẩn lao sẽ không mang lại kết quả chính xác. Đến nay, ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu chính thức nào về hiện tượng khuyết gen với số lượng mẫu lớn trên cả 3 miền Bắc Trung Nam để có được đánh giá tổng quát về hiện tượng khuyết gen trong M. tuberculosis ở Việt Nam. Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu chủng vi khuẩn lao M. Tuberculosis được thu thập từ 3 bệnh viện ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam Việt Nam. Miền Bắc: Bệnh viện Lao và Bệnh phổi TƯ – Kí hiệu chủng TB02 Miền Trung: Bệnh viện Đa Khoa TW Huế - Kí hiệu chủng TB05 Miền Nam: Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch – Kí hiệu chủng TB06 Tất cả các mẫu chủng trên được phân lập sau đó tăng sinh trên môi trường Lowenstein rồi tách chiết thu DNA sử dụng trong quá trình nghiên cứu. 2.1.2. Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu được tính theo công thức tính cỡ mẫu theo khuyến cáo của WHO cho các nghiên cứu dịch tễ học [54] n = Z21-a/2 P (1-P)/ d2 Trong đó : Z1- a/2 = 1,96 (với độ tin cậy b= 95%) P : Tỉ lệ ước đoán trong quần thể (tỷ lệ ước đoán khuyết gen đích IS6110 ở Việt Nam là 5 % theo các nghiên cứu trong nước công bố). d : Độ dao động của tỉ lệ phát hiện không quá 5% so với tỷ lệ thực n : Cỡ mẫu tối thiểu cần đạt được Căn cứ công thức trên, chọn d = 2% thì cỡ mẫu tối thiểu cần đạt là n = 456, thực tế đã thu thập 750 chủng vi khuẩn lao ở cả 3 miền. Cách lấy mẫu: Thu thập ngẫu nhiên chủng vi khuẩn phân lập được trong khoản thời gian thuộc giai đoạn 2007-2010 tại các điểm nghiên cứu. 2.2. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU Các hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị được sử dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật và các mầm bệnh sinh học – Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược – Học viện Quân Y. Các hóa chất và thiết bị Các hóa chất và thiết bị chính phục vụ cho nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1 và 2.2 Bảng 2.1. Các sinh phẩm hóa chất chất chính Tên hóa chất Hãng sản xuất 1. Hóa chất dùng trong tách chiết DNA PBS Rectopur(CE- EMB) Tris – Base Applied BioSiciences (Mỹ) Protease K Sigma (Mỹ) Lyzozyme Fermentas Các dung môi hữu cơ Gibco BRL Life technology Ethanol Wako (Japan) Natri acetate Wako (Japan) Phenol/Chloroform/Isomyl Wako (Japan) 2. Hóa chất trong PCR Taq buffer Fermentas Primers Bioneer MgCl2 Fermentas Taq DNA polymerase Fermentas DNTPs Fermentas 3. Hóa chất trong điện di và soi gel Fermentas Agarose Fermentas Thang chuẩn DNA Fermentas Loading Dye Fermentas Red safe Sigma (Mỹ) Bảng 2.2. Các máy và thiết bị chính Tên thiết bị Hãng sản xuất Máy PCR iCyler (Gradient nhiệt) Bio-Rad Máy PCR (GeneAmp PCR System 9700) Appiled BioSystems Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Heraeus Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thomas Scientific Máy làm khô chân không Eppendorf Máy chụp ảnh Gel – Doc Dolphin Tủ lạnh 0oC, 4oC, -20oC; -80oC Nuaire Lò vi song Sanyo Cân điện tử (Electronic balances) Adam Pippetman Gilson, Haminlton, Bio-Rad Vortex OSI Rotolab Bể ổn nhiệt Memmert Khối ổn nhiệt có lắc Eppendorf Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument Bộ điện di DNA Labnet Tủ cấy an toàn sinh học Nuaire Tủ ấm Shelab 2.2.2. Các cặp mồi được sử dụng trong phát hiện gen đích Trình tự các cặp mồi IS 6110 và 23S rDNA được tham khảo từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới. Cặp mồi IS 6110F/IS 6110R khuếch đại gen đích nằm trong trình tự chèn IS 6110 có độ dài 249 bp. Theo tác giả Mekonnen Kurabachew và cộng sự đã cho thấy gen đích 23S rDNA có ở tất cả các chủng lao gây bệnh [41]. Chúng tôi đã tham khảo, kiểm tra và lựa chọn cặp mồi khuếch đại ADN có độ dài 118 bp nằm trong gen 23S rDNA mã hoá cho tiểu phần 23S của rRNA. Theo các tác giả Ấn Độ và trên thế giới đã chứng minh trình tự IS 1081 cũng có giá trị rất lớn trong chẩn đoán phát hiện M. tuberculosis complex và khắc phục vấn đề thiếu gen đích IS 6110 ở một số chủng lao ở Ấn Độ, Đông Nam châu Á và Việt Nam [20,40, 43], do vậy chúng tôi sử dụng cặp mồi IS 1081F/IS 1081R để khuếch đại gen đích thuộc trình tự chèn IS 1081 có độ dài 300bp. Bảng 2.3. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu Gen đích Mồi Trình tự Sản phẩm (bp) Nguồn 23S rDNA 23S-F 5’ GAA AAC AAT TGT GAT TCC GCA AG 3’ 118 [12, 13] 23S-R 5’ CGG GTA GCG CTG AGA CAT ATC CT 3’ IS1081 IS1081-F 5’ TCG CGT GAT CCT TCG AAA CG 3’ 300 [12,13] IS1081-R 5’ GCC GTT GCG CTG ATT GGA CC 3’ IS6110 IS6110-F 5’ CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC 3’ 249 [12,13] IS6110-R 5’ GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA 3’ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu mô tả với quần thể nghiên cứu là chủng vi khuẩn lao phân lập trên cả 3 miền của Việt Nam và thông số nghiên cứu là tỷ lệ xuất hiện các gen đích đặc trưng phục vụ cho chẩn đoán của quần thể chủng vi khuẩn lao ở Việt Nam. 2.3.1.1. Kiểm tra tỷ lệ khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng multiplex PCR Các chủng lao của ba miền Bắc Trung Nam được tách DNA và chạy multiplex PCR để kiểm tra tỷ lệ xuất hiện các trình tự IS6110, IS1081 và 23S rDNA . Với những chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA sẽ được thu nhận và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi. 2.3.1.2. So sánh tỷ lệ khuyết các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA giữa ba miền Bắc Trung Nam Kết quả về hiện tượng khuyết gen được thống kê ở từng miền và so sánh với nhau. 2.3.1.3. Đặc điểm khuyết gen ở vi khuẩn lao ở Việt Nam Thống kê kết quả khuyết những gen đặc trưng như IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở vi khuẩn lao ở Việt Nam. 2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu Vi khuẩn lao Tách DNA Multiplex PCR đồng thời 3 gen đích Kiểm tra lại bằng PCR đơn mồi với mẫu khuyết gen Xác định tỷ lệ khuyết của từng gen đích So sánh tỷ lệ khuyết gen ở ba miền Bắc – Trung – Nam Đặc điểm khuyết gen ở các chủng lao ở Việt Nam 2.3.3. Các kĩ thuật sử dụng trong nghiên cứu 2.3.3.1. Tách chiết DNA Vi khuẩn lao sau khi được phân lập và tăng sinh được tiến hành tách chiết thu DNA tổng số. Tách chiết DNA tổng số gồm các bước sau: Bước 1: Votex kĩ tube chứa chủng vi khuẩn lao, lấy 200 µl vào tube eppendorf, bất hoạt ở 80oC trong 20 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng [33, 34, 38]. Bước 2: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút, thu cặn lắng chứa khuẩn lạc, bỏ nước nổi. Bước 3: Bổ sung 500µl lysis buffer và 12µl lysozyme 25mg/ml (nồng độ cuối cùng đạt 500µg/ml), vortex kĩ rồi ủ trong nước đá 30 phút. Bước 4: Bổ sung 3 µl proteinase K (nồng độ cuối 100µg/ml), lắc kỹ bằng pipetting. Bước 5: Ủ 56oC trong bể ổn nhiệt có lắc 900rpm trong 3h (hoặc qua đêm). Bước 6: Thêm 550µl Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (tỷ lệ 1/1 với lysis bufer), vortex kỹ. Bước 7: Ly tâm 6000g/phút trong 10 phút. Bước 8: Chuẩn bị trước 1 tube eppendorf có chứa 1300 µl Ethanol 100% + 50µl NaAC 3M, (trường hợp cồn 95% cần 2 tube loại 2ml, mỗi tube chứa 775µ cồn 95% +25µl NaAC 3M) trộn đều, đặt trong khay nước đá (nồng độ cuối cùng của cồn ít nhất 70%). Bước 9: Hút lấy phần dịch nổi ở phía trên ở cuối bước 7 (tránh hút lớp ngăn cách giữa 2 pha dịch) cho vào tube chứa sẵn cồn và NaAC đã chuẩn bị ở bước 8 (trường hợp cồn 95% cần chia đều dịch nổi vào 2 tube đó), lắc đảo ngược vài lần. Bước 10: Ủ - 20oC trong 3 giờ hoặc qua đêm. Bước 11: Ly tâm 13000g/phút trong 30 phút. Bước 12: Hút nước nổi, giữ lại phần cặn (không hút kiệt để tránh mất DNA). Bước 13: Thêm 1000µl cồn 70%, lắc ngược vài lần. Bước 14: Ly tâm 13000g/phút trong 20 phút, bỏ nước nổi lấy cặn (để lại khoảng 20µl tránh mất DNA). Bước 15: Ly tâm 13000g/phút trong 15 phút, bỏ nước nổi cẩn thận bằng pipet 20µl, giữ phần cặn có DNA. Bước 16: Làm khô hoàn toàn, thêm vào 200µl nước khử ion, lắc trộn bằng tay, chia ra 02 tube (nếu đã chia 02 tube ở bước 8 thì cho vào mỗi tube 100µl nước khử ion) ghi mã số chủng kèm số (1) và số (2), đo nồng độ OD. Ủ -4o C qua đêm, sau đó bảo quản tube số (2) ở -80oC, tube số (1) dùng ngay hoặc để ở -20oC. 2.3.3.2. Kĩ thuật PCR và multiplex PCR Phản ứng PCR và multiplex PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt 9700 và iCycler. Bước 1: Phân tử DNA khuôn được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử (95oC) trong vòng 30 giây đến 90 giây. Đây là giai đoạn biến tính (Denaturation). Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của mồi) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 50 đến 70oC phụ thuộc Tm của mồi sử dụng và thời gian kéo dài từ 30 đến 1 phút 30 giây. Đây là giai đoạn lai (Anealing). Để tìm nhiệt độ tối ưu cho từng cặp mồi và cho cả 3 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR chúng tôi sử dụng phương pháp gradient nhiệt. Bước 3: Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại và đặc tính của DNA Polymerase. Đây là giai đoạn tổng hợp (Extension). Đối với nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thành phần và chu trình nhiệt cho phản ứng multiplex PCR đã được tác giả Nguyễn Thái Sơn và cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân Y tối ưu vào năm 2007 [12, 13]. Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho phản ứng multiplex PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kì 1 Biến tính chung 95 5 phút 1 2 Biến tính 95 45 giây 40 3 Gắn mồi 60,7 45 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 45 phút 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Bảng 2.5. Thành phần phản ứng Stt Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 H2O 8,35 2 Buffer 2,5 3 dNTPs (2,5 mM) 2,5mM 5 4 MgCl2 (25 mM) 2,5mM 3 5 Primer 23S – F (25pmoles/µl) 0,8 µM 0,5 6 Primer 23S – R (25pmoles/µl) 0,8 µM 0,5 7 Primer IS6110 – F (25pmoles/µl) 0,4 µM 0,5 8 Primer IS6110 – R (25pmoles/µl) 0,4 µM 0,5 9 Primer IS1081 – F (25pmoles/µl) 0,6 µM 0,5 10 Primer IS1081 – R (25pmoles/µl) 0,6 µM 0,5 11 Taq DNA polymerase 0,5 unit 0,15 12 DNA template 3 Tổng 25 Các thành phần của phản ứng ở các mẫu đều giống nhau chúng chỉ khác khác nhau về DNA template. Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di trên gel Agarose 1,2% để phân tích kích thước các gen đích cần nghiên cứu. Dưới đây là thành phần cho phản ứng PCR chúng tôi sử dụng để kiểm tra lại các mẫu khuyết gen đích: Kiểm tra các mẫu khuyết IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên các chủng lao ở ba miền Bắc Trung Nam bằng phản ứng PCR Các chủng lao nghi khuyết các trình tự đặc trưng IS6110, IS1081 và 23S rDNA được kiểm tra lại bằng phản ứng PCR đơn mồi. Với các mẫu nghi khuyết IS6110 chúng tôi sẽ kiểm tra lại bằng phản ứng PCR với mồi IS6110. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 như sau: Bảng 2.6. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 Stt Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 H2O 10,35 2 Buffer 2,5 3 dNTPs 2,5mM 5 4 MgCl2 2,5mM 3 7 Primer IS6110 – F (25pmoles/µl) 0,4 µM 0,5 8 Primer IS6110 – R (25pmoles/µl) 0,4 µM 0,5 11 Taq DNA polymerase 0,5 unit 0,15 12 DNA template 3 Tổng 25 Tương tự với các mẫu nghi khuyết IS1081 sẽ được kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi IS1081. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS1081 như sau: Bảng 2.7. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi IS6110 Stt Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 H2O 10,35 2 Buffer 2,5 3 dNTPs 2,5mM 5 4 MgCl2 2,5mM 3 7 Primer IS1081 – F (25pmoles/µl) 0,6 µM 0,5 8 Primer IS1081 – R (25pmoles/µl) 0,6 µM 0,5 11 Taq DNA polymerase 0,5 unit 0,15 12 DNA template 3 Tổng 25 Với các mẫu nghi khuyết 23S rDNA được kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi 23S rDNA. Bảng 2.8. Thành phần cho phản ứng PCR với mồi 23S rDNA Stt Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 H2O 10,35 2 Buffer 2,5 3 dNTPs 2,5mM 5 4 MgCl2 2,5mM 3 7 Primer 23S rDNA – F (25pmoles/µl) 0,8µM 0,5 8 Primer 23S rDNA – R (25pmoles/µl) 0,8µM 0,5 11 Taq DNA polymerase 0,5 unit 0,15 12 DNA template 3 Tổng 25 2.3.3.3. Điện di Điện di DNA là một phương pháp đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử vì đây là phương pháp duy nhất để có thể quan sát được các phân tử DNA bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên gel Agarose. Sản phẩm DNA được điện di trên gel Agarose sẽ tạo thành các giải băng khác nhau. DNA mang điện tích âm di chuyển từ cực âm sang cực dương, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thước phân tử, dạng cấu trúc DNA, nồng độ Agarose, điện thế, nhiệt độ và thành phần chất điện di. Dựa vào kích thước từng đoạn gel được nghiên cứu và khả năng phân tách của gel Agarose, chúng tôi sử dụng kỹ thuật điện di trên gel Agarose 1,2% nhằm mục đích xác định khoảng kích thước các băng khi được điện di cùng thang DNA chuẩn. - Chuẩn bị gel Agarose 1,2%: + Pha 1,2g agarose trong TBE 0,5X và đựng trong bình chịu nhiệt. + Đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. + Để nguội đến 70oC, đổ gel vào khay đã được cài răng lược. + Rút răng lược ra sau khi gel đã đông lại (khoảng 30 phút). - Quá trình diện di và kiểm tra sản phẩn PCR: +Gel được đặt nằm ngang trong buồng điện di có chứa dung dịch đệm . + Điện di thực hiện theo phương nằm ngang với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V, dòng 60 - 80 mA, trong thời gian khoảng 45 phút. + Các axit nucleic trong gel được nhuộm bằng Red safe. + Sau khi nhuộm gel được quan sát và chụp ảnh bằng máy soi gel Dolphin-DOC [6, 12, 13, 14, 15]. PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU Các số liệu được thu thập phân tích và xử lý theo các phương pháp thống kê sử dụng phần mềm Microsoft Excel. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ KHUYẾT CÁC TRÌNH TỰ IS6110, IS1081 VÀ 23S rDNA TRÊN CÁC CHỦNG LAO Ở VIỆT NAM 3.1.1. Kết quả tách chiết DNA Trong nghiên cứu sinh học phân tử tách chiết DNA là một kĩ thuật rất quan trọng. Độ tinh sạch, nồng độ DNA và sự bảo đảm không có hiện tượng nhiễm chéo sẽ quyết định đến kết quả của nghiên cứu. Trong quá trình tách chiết DNA chúng tôi luôn tách kèm mẫu vi khuẩn không phải lao nhằm kiểm soát hiện tượng nhiễm chéo. Các mẫu DNA này sẽ được sử dụng làm đối chứng âm trong các phản ứng multiplex PCR và PCR . Các mẫu DNA sau khi tách chiết được kiểm tra độ tinh sạch bằng thiết bị máy đo quang phổ. Đo độ hấp thu quang phổ của DNA ở bước sóng 260nm và của protein ở bước sóng 280nm. Nồng độ của DNA được tính bằng độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 260nm, độ tinh sạch được đánh giá bằng tỷ số hấp thu OD260nm/OD280nm. DNA thu được có tỷ lệ OD260/OD280 trong khoảng 1,8 - 2,0 được coi là tinh sạch, không lẫn protein và các tạp chất khác [6, 26, 37]. DNA tổng số này đảm bảo để sử dụng làm panel mẫu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung Ương Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl 1 TB02-35 1,61 68,9 6 TB02-40 2,08 6,5 2 TB02-36 1,62 54,6 7 TB02-41 1,74 23,9 3 TB02-37 2,29 8,3 8 TB02-42 1,94 11,2 4 TB02-38 1,66 37,8 9 TB02-43 1,70 29,7 5 TB02-39 1,85 18,8 10 TB02-44 1,79 9,8 Bảng 3.2. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Huế Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl 1 TB05-100 1,55 20,7 6 TB05-105 1,65 30,3 2 TB05-101 1,92 27,8 7 TB05-106 1,82 91,8 3 TB05-102 1,78 20,5 8 TB05-107 1,89 86,1 4 TB05-103 1,85 16,5 9 TB05-108 1,69 49,2 5 TB05-104 1,85 17,8 10 TB05-109 1,71 39,5 Bảng 3.3. Kết quả tách chiết DNA một số chủng lao của Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl Stt Mẫu OD Nồng độ ng/µl 1 TB06-40 1,57 26,7 6 TB06-45 1,55 12,3 2 TB06-41 1,73 36,8 7 TB06-46 1,87 138,6 3 TB06-42 1,88 318,9 8 TB06-47 1,84 180,4 4 TB06-43 1,76 37,7 9 TB06-48 1,84 155,4 5 TB06-44 1,83 24,5 10 TB06-49 1,86 40,1 3.1.2. Kết quả phát hiện các gen đích đặc trưng của vi khuẩn lao Chúng tôi tiến hành kiểm tra 750 mẫu DNA được tách từ 750 chủng vi khuẩn lao do Bệnh viện Lao và bệnh Phổi Trung ương, Bệnh viện Trung ương Huế và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch thành phố Hồ Chí Minh cung cấp bằng kĩ thuật multiplex PCR. Với các mẫu sau khi được kiểm tra bằng phản ứng multiplex PCR có hiện tượng khuyết gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA chúng tôi tiến hành kiểm tra lại các mẫu này bằng phản ứng PCR đơn mồi, phản ứng PCR sẽ được chạy cùng đối chứng dương là mẫu DNA của vi khuẩn lao có xuất hiện cả 3 băng đặc trưng cho IS6110, IS1081 và 23S rDNA và mẫu đối chứng âm là mẫu DNA của vi khuẩn không phải lao. 3.1.2.1. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao phía Bắc Chúng tôi tiến hành chạy multiplex PCR với 3 gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA trên 200 chủng của bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương. Các chủng này được thu thập từ các bệnh nhân ở khu vực Bắc bộ của Việt Nam. Do vậy kết quả khảo sát trên 200 chủng này có thể đại diện cho kết quả khảo sát trên miền Bắc. Kết quả multiplex PCR được điện di trên gel agarose 1,2 % như sau: (-): chứng âm (+): chứng dương Mẫu 1 đến mẫu 14 tương ứng TB02-1 đến TB02-14 M (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 (+) M: marker 100 bp 300 IS1081 249 IS6110 118 23S rDNA Hình 3.1. Kết quả phát hiện 3 gen đích đặc trưng trên một số chủng lao Miền Bắc Kết quả trên cho thấy khi kiểm tra bằng multiplex PCR trên 200 mẫu DNA của chủng vi khuẩn lao ở miền Bắc thì thấy ở tất cả các mẫu đều xuất hiện cả 3 băng đặc hiệu cho các gen đích IS6110, IS1081 và 23S rDNA. Kết quả trên được thống kê trong bảng sau: Bảng 3.4. Kết quả phát hiện gen đích đặc trưng ở các chủng lao miền Bắc Tổng số mẫu Tổng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng mPCR Gen đích IS6110 Gen đích IS1081 Gen đích 23S rDNA Xuất hiện Khuyết Xuất hiện Khuyết Xuất hiện Khuyết 200 200 0 (0%) 200 0 (0%) 200 0 (0%) Kết quả kiểm tra trên 200 mẫu lao ở bệnh viện Lao và Bệnh phổi Trung ương được coi như kết quả khảo sát trên miền Bắc. Hiện tại chưa phát hiện hiện tượng khuyết các gen đích đặc trưng là IS6110, IS1081 và 23S rDNA ở các chủng lao phân lập ở miền Bắc. 3.1.2.2. Kết quả phát hiện các gen đích trên các chủng lao ở miền Trung Chúng tôi tiến hành kiểm tra hiện tượng khuyết gen đích bằng multiplex PCR trên 300