Luận văn Xác định sự hoạt hóa của Phosphatidylinositol 4-Phosphate 5-kinase (PIP5K) A và C61 trên dòng tế bào HeLa chuyển gene

Chương 1  TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 1: Tổng quan tài liệu  2 1.1. Phosphatidylinositol 4 phosphate 5 kinase (PIP5K). 1.1.1. Cấu trúc của PIP5K. PIP5K là nhóm các protein kinase, PIP5K có 3 isozyme là PIP5Kα, PIP5Kβ và PIP5Kγ. PIP5Kα và PIP5Kβ có cùng khối lượng phân tử là 64 kDa. Hai isozyme này được tạo dòng đồng thời ở người và chuột, danh pháp của chúng trái ngược nhau. PIP5Kα của người tương ứng với PIP5Kβ của chuột và PIP5Kβ của người tương đồng với PIP5Kα của chuột [5]. Riêng protein PIP5Kγ có 3 biến thể, có kích thước và chức năng khác nhau. PIP5Kγ635 gồm 635 amino acid, PIP5Kγ661 có thêm 26 amino acid ở đầu C và PIP5Kγ687 có thêm 26 amino acid chèn vào trước trình tự 26 amino acid của PIP5Kγ661 [24]. PIP5K gồm vùng lõi kinase bảo tồn, tương đồng khoảng 80 % giữa các isozyme. Vùng kinase này có một motif cần thiết cho sự liên kết với màng tế bào. Vùng COOH- và NH2- khác nhau giữa các isozyme. Hai vùng này được dự đoán là vị trí tương tác của PIP5K với các protein khác. [21]. Để thuận tiện trong việc trình bày, trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tạm gọi các isozyme PIP5K như sau: Hình 1.1. Cấu trúc các isozyme của PIP5K [21] Chương 1: Tổng quan tài liệu  3 Bảng 1.1. Tên gọi các PIP5K trong đề tài Tên gọi trong đề tài PIP5Kα (người) và PIP5Kβ (chuột) PIP5KA PIP5Kβ (người) và PIP5Kα (chuột) PIP5KB PIP5Kγ PIP5KC PIP5K xúc tác quá trình tổng hợp phosphatidylinositol (4, 5)-biphosphate (PIP2), là một phospholipid có nhiều chức năng quan trọng trong tế bào. 1.1.2. Quá trình tổng hợp PIP2 của PIP5K trong tế bào. Phosphatidylinositol (4, 5) - bisphosphate (PIP2) chủ yếu tập trung ở màng tế bào, chiếm khoảng 1 % tổng lượng phospholipid trên màng. Tuy chỉ chiếm một lượng nhỏ nhưng PIP2 có vai trò quan trọng trong các quá trình điều hòa của tế bào. PIP2 có vai trò như phân tử truyền tín hiệu thứ cấp trong quá trình chết theo chương trình (apoptosis), vận chuyển qua màng tế bào… PIP2 gắn trực tiếp vào protein bám trên actin và điều hòa hoạt động của các protein này, dẫn đến quá trình tái sắp xếp của khung xương tế bào (hình 1.2) [38]. PIP2 được tổng hợp thông qua hai con đường. Thứ nhất, PIP5K gắn nhóm phosphate vào phosphatidylinositol 4-phosphate PI(4)P tại vị trí D5 của vòng inositol. Thứ hai, phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase (PIP4K) gắn nhóm phosphate vào phosphatidylinositol 5-phosphate PI(5)P tại vị trí D4. Tuy nhiên, do hàm lượng PI(4)P trong tế bào nhiều hơn khoảng 10 lần so với PI(5)P nên quá trình tổng hợp PIP2 chủ yếu thông qua con đường thứ nhất (hình 1.3) [5][24]. Chương 1: Tổng quan tài liệu  4 Hình 1.3. Quá trình tổng hợp PIP2 từ PI(4)P [21] PIP5K phosphoryl hóa phosphotidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) tại vị trí D5 [PIP2] Hình 1.2. Vai trò của PIP5K và PIP2 trong các con đường truyền tín hiệu của tế bào [38] Quá trình apoptosis Vận chuyển qua màng tế bào Quá trình tạo bám dính trên tiêu điểm (focal adhesion assembly) Quá trình tái tạo sợi trục thần kinh (neurite remodeling) Quá trình thực bào Chương 1: Tổng quan tài liệu  5 Hiện nay, vẫn chưa có bằng chứng cụ thể để giải thích tại sao PIP2 lại có nhiều chức năng, nhưng một giả thuyết được đặt ra là do các isozyme PIP5K tham gia quá trình tổng hợp PIP2 khác nhau ở mỗi loại tế bào [21]. 1.1.3. Protein PIP5KA. PIP5KA được tìm thấy ở nhiều thành phần của tế bào, trong nhân, màng tế bào, bộ máy Golgi và tại những nếp gấp trên màng (membrane ruffle). PIP5KA tham gia điều hòa các hoạt động của tế bào như sau: • Quá trình apoptosis: Nghiên cứu của Mejillano và cs (2001) cho thấy PIP5KA tham gia điều hòa hoạt động của caspase, họ protein quan trọng của quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào. Khi PIP5KA biểu hiện vượt mức, protein này xúc tác tổng hợp PIP2 và PIP2 trực tiếp ức chế hoạt động caspase, đặc biệt là caspase-3, dẫn đến quá trình apoptosis của tế bào bị ngừng lại. Ngược lại, khi quá trình apoptosis xảy ra, PIP5KA là PIP5K duy nhất bị phân cắt bởi caspase-3 (hình 1.3 A). Đây là một quá trình điều hòa thuận nghịch để duy trì sự cân bằng giữa tăng trưởng và apoptosis của tế bào [25]. • Quá trình nhập bào: PIP5KA tham gia vào quá trình nhập bào thông qua thụ thể. Một đột biến mất đoạn nhỏ trên trình tự của PIP5KA làm giảm hoạt động kinase, PIP5KA không thể di chuyển đến màng tế bào và ức chế quá trình nhập bào qua thụ thể của nhân tố tăng trưởng biểu mô EGFR (epidermal growth factor receptor) [24]. Trong quá trình thực bào, PIP5KA biểu hiện tại một cấu trúc đặc biệt do sự tái sắp xếp của actin trên màng tế bào tại vị trí thực bào (gọi là phagocytosis cup), PIP2 cũng được quan sát thấy tại đây. Khi PIP5KA bị đột biến đồng thời tại vị trí amino acid 309, asparatate chuyển thành asparagine và đột biến tại vị trí amino acid 472, Arginine chuyển thành Glutamine (D309N/R427Q), cấu trúc phagocytosis cup không được hình thành và PIP2 không tập trung ở vị trí này [9][36]. Chương 1: Tổng quan tài liệu  6 • Quá trình sắp xếp của khung xương tế bào: PIP5KA còn có vai trò quan trọng trong việc điều hòa cấu trúc màng tế bào. Sự biểu hiện vượt mức PIP5KA dẫn đến hình thành cấu trúc lamellipodia khi protein Rac1 được hoạt hóa. Ngược lại khi protein Rac1 bị bất hoạt, PIP5KA thúc đẩy hình thành những nếp gấp trên màng tế bào (gọi là membrane ruffle). Trong nguyên bào sợi MG-63, PIP5KA di chuyển đến màng tế bào khi tế bào được kích thích bởi nhân tố tăng tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (platelet-derived growth factor - PDGF) [24] 1.1.4. Protein PIP5KB PIP5KB tồn tại ở dạng protein tan trong tế bào chất, liên kết với màng plasma. Hoạt động của PIP5KB phụ thuộc vào quá trình gắn và loại nhóm phosphate. Trong các thí nghiệm in vitro, PIP5K có thể tự gắn nhóm phosphate tại vị trí Ser/Thr của trình tự kinase và ức chế hoạt động kinase của bản thân. Protein kinase A phụ thuộc AMP vòng (cAMP-dependent protein kinase A) có thể gắn nhóm phosphate và bất hoạt PIP5KB. Những tác nhân kích thích quá trình loại nhóm phosphate của PIP5KB đã được xác định. Khi tế bào NIH 3T3 được kích thích bởi lysophosphatidic acid (LPA) hoặc là 12-myristate 13-acetate (PMA), PIP5KB được hoạt hóa và tăng biểu hiện [24]. PIP5KB cũng có những chức năng tương tự như PIP5KA do cấu trúc của hai protein này có độ tương đồng cao. • Tham gia quá trình sắp xếp của khung xương tế bào: Có bằng chứng cho thấy PIP5KB đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa hoạt động của actin. Khi được biểu hiện vượt mức trong tế bào, PIP5KB cảm ứng quá trình polymer hóa actin. Tế bào phì (mast cell) của chuột bất hoạt gene pip5kb tổng hợp PIP2 ít hơn 35% và actin được polymer hóa ít hơn so với bình thường [24]. Ở tế bào COS-7 được chuyển gene mã hóa PIP5KB, cấu trúc actin gồm những sợi ngắn, nhỏ và kết hợp lại theo dạng chùm lá thông (pine needles) [34]. Chương 1: Tổng quan tài liệu  7 Tế bào HeLa khi được nuôi cấy trong môi trường ưu trương, chủ yếu PIP5KB được hoạt hóa, dẫn đến quá trình tổng hợp PIP2 và biến đổi kiểu hình như actin được polymer hóa thành những sợi dày và ngắn hơn, tập trung ở ngoại vi tế bào [40]. • Tham gia điều hòa quá trình nhập bào: Trong tế bào HeLa, PIP5KB được xem là nhân tố điều hòa quá trình nhập bào thông qua thụ thể. Bất hoạt gene pip5kb bằng RNAi dẫn đến kết quả ức chế quá trình nhập bào ở tế bào HeLa. Khi PIP5KB được biểu hiện vượt mức trong tế bào này, quá trình nhập bào được thúc đẩy. [24] 1.1.5. Protein PIP5KC Khác với protein PIP5KA và PIP5KB, PIP5KC có 3 biến thể là PIP5KC635, PIP5KC661 và PIP5KC687. Trình tự ba biến thể này khác nhau chủ yếu ở đầu COOH-. PIP5KC635 hiện diện ở nhiều tế bào trong khi đó PIP5KC661 biểu hiện chủ yếu ở tế bào thần kinh [24]. Một nghiên cứu gần đây cho thấy đột biến (G757A) ở vùng kinase của PIP5KC có liên quan đến hội chứng co cứng bẩm sinh loại 3 ở trẻ sơ sinh (LCCS3). Do PIP5KC bị đột biến, PIP2 không được tổng hợp trong tế bào thần kinh. Kết quả là quá trình dẫn truyền tín hiệu và sự tăng trưởng của tế bào thần kinh bị ức chế. Trẻ sơ sinh mắc bệnh này có những kiểu hình lâm sàng như co cứng các khớp xương, hàm nhỏ và teo tủy sống [27]. Vai trò của PIP5KC trong tế bào như sau: • Tham gia quá trình tạo bám dính trên tiêu điểm (focal adhesion). Bám dính trên tiêu điểm là một phức hợp protein liên kết các sợi actin và chất nền ngoại bào (extracellular matrix). PIP5KC661 khác với PIP5KC635 do có thêm một exon gồm 26 amino acid ở đầu COOH-, trình tự này là vị trí tương tác đặc hiệu của PIP5KC661 với talin (là một protein quan trọng của quá trình tạo bám dính trên tiêu điểm). Kết quả của tương tác này là PIP5KC661 được hoạt hóa và xúc tác Chương 1: Tổng quan tài liệu  8 quá trình tổng hợp PIP2 tại màng tế bào, đồng thời hình thành bám dính trên tiêu điểm (hình 1.3 B) [39]. • Tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền trong synapse PIP5KC tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền trong synapse thông qua tương tác của bản thân nó với adaptor protein AP-2. Vấn đề này được trình bày chi tiết ở phần 1.3.2. 1.1.6. Các nhân tố hoạt hóa PIP5K Sở dĩ các isozyme của PIP5K có nhiều chức năng khác nhau trong tế bào là do được hoạt hóa bởi những nhân tố khác nhau. Trong in vitro, PIP5K được hoạt hóa bởi phosphatidic acid, là một phospholipid trên màng tế bào. Các protein thuộc nhóm GTPase như RhoA, Rac1 và ARF6 cũng là tác nhân hoạt hóa PIP5K. Cơ chế chung của quá trình hoạt hóa này là phosphoryl hóa hoặc dephosphoryl hóa tại những vị trí đặc biệt trên các protein này, cho phép các protein tương tác với PIP5K có thể gắn vào hoặc giải phóng ra khỏi PIP5K, hoặc làm thay đổi hoạt tính kinase của PIP5K [5][21]. Gần đây, kết quả nghiên cứu của nhóm chúng tôi đã cho thấy protein AP-2 trực tiếp tương tác và hoạt hóa PIP5KC661. Tương tác này được điều hòa bởi quá trình dephosphoryl hóa tại vị trí Ser 645 của PIP5KC661 [1]. Một nghiên cứu khác của nhóm chúng tôi đã chứng minh protein kinesin 2A (KIF2A) tương tác đặc hiệu với PIP5KA. Chương 1: Tổng quan tài liệu  9 1.2. Protein kinesin KIF2A 1.2.1. Họ protein kinesin (KIFs) Kinesin là một họ gene lớn mã hóa cho các protein vận chuyển phụ thuộc vi ống (microtubule-dependent motors), hiện nay đã xác định được 45 loại protein kinesin ở người và chuột. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, protein này có cấu trúc gồm hai đầu hình cầu (đường kính 10 nm), phần thân dài và đuôi có dạng rẻ quạt. Cấu trúc hình cầu gồm hai chuỗi nặng có vai trò là vùng vận động (motor domain) (hình 1.5). Vùng vận động là một trình tự bảo tồn gắn ATP. Trình tự amino acid của domain này tương đồng 30-60 % giữa các KIFs. KIFs có thể chia làm 3 nhóm dựa vào vị trí của vùng vận động. N-kinesin có vùng vận động ở đầu N, M- kinesin có vùng vận động ở giữa và C-kinesin có vùng vận động ở đầu C (hình 1.6) [15]. KIFs có khả năng vận chuyển bào quan có màng bao, phức hợp protein và RNA thông tin dọc theo vi ống. Vi ống gồm đầu cộng (plus end) và đầu trừ (minus end). Ở đầu cộng, vi ống polymer hóa nhanh hơn và nó phát triển nhanh hơn so với đầu trừ. Trong in vivo, N-kinesin và M-kinesin di chuyển đến đầu cộng của vi ống, trong khi đó, C-kinesin có xu hướng di chuyển về đầu trừ. Quá trình vận chuyển trong sợi trục thần kinh và tế bào thần kinh sợi nhánh cũng do KIFs đảm nhiệm và mỗi nhóm KIF vận chuyển với tốc độ khác nhau [16][15]. KIF2A PIP5KA PIP5KB PIP5KC RhoA Rac 1 ARF6 AP-2 PIP5KC 635 PIP5KC 661 PIP5KC 687 Talin Hình 1.4. Các nhân tố hoạt hóa của PIP5K Chương 1: Tổng quan tài liệu  10 Hình 1.6. Hình mô tả cấu trúc của họ protein Kinesin [14]. Số lượng amino acid của mỗi KIF được ghi chú bên phải. Vùng màu tím là vị trí của motor domain. Các kinesin thuộc nhóm N-kinesin được tô màu xanh lá, thuộc nhóm C-kinesin được tô màu xanh dương và M-kinesin được tô màu vàng. Hình 1.5. Cấu trúc của họ protein Kinesin quan sát dưới kính hiển vi điện tử và sơ đồ minh họa [14]. Chương 1: Tổng quan tài liệu  11 1.2.2. Protein KIF2A KIF2A là một M-kinesin thuộc nhóm protein KIF2. Đây là nhóm protein kinesin duy nhất có khả năng depolymer hóa vi ống khi được phosphoryl hóa. Cấu trúc của KIF2A được thể hiện trong hình 1.5 và 1.6. Protein này gồm 717 amino acid. Vùng đầu NH2- gồm 189 amino acid (từ vị trí amino acid thứ 1 đến amino acid 189), có cấu trúc hình cầu nhỏ. Vùng vận chuyển (motor domain) cũng có dạng hình cầu nhưng kích thước lớn hơn. Và vùng đầu COOH- có cấu trúc xoắn alpha. KIF2A tạo thành dạng homodimer, là một cấu trúc hình cầu có đường kính khoảng 16 nm. KIF2A di chuyển về phía đầu cộng của vi ống với vận tốc khoảng 0,4 µm/s. Protein này hiện diện nhiều ở tế bào thần kinh, đặc biệt là ở sợi trục thần kinh đang phát triển và giảm biểu hiện khi tế bào này trưởng thành [14]. Theo công trình của Ganmen N.J. và cs (2004) và Jang C.Y (2009), protein KIF2A định vị tại trung thể ở kì trung gian. Ngoài ra, KIF2A còn tập trung tại hai cực của thoi vô sắc ở kì giữa, kì sau và kì cuối của quá trình nguyên phân [19][13]. Khi bất hoạt gene kif2a trong tế bào bằng RNAi, quá trình phân chia của tế bào bị dừng lại bởi vì thoi vô sắc không được hình thành, nhiễm sắc thể không di chuyển về hai cực trong giai đoạn kì giữa. Kết quả này cho thấy KIF2A giữ vai trò quan trọng trong quá trình phân chia của tế bào [13]. Trong suốt quá trình nguyên phân của tế bào, protein KIF2A trực tiếp được phosphoryl hóa bởi Plk1 (Polo-like kinase), một kinase cần thiểt cho quá trình nguyên phân. Plk1 thúc đẩy là hoạt động depolymer hóa vi ống và quá trình di chuyển đến hai cực thoi vô sắc của KIF2A. Ngược lại, Aurora A cũng là một kinase cần cho quá trình tăng sinh của tế bào nhưng kết quả của quá trình phosphoryl hóa KIF2A bởi kinase này là ức chế khả năng polymer hóa vi ống [19]. Gần đây, Nakano A.K và cs (2007) sử dụng phương pháp lai hai hệ thống (two-hybrid system) đã tìm ra protein KIF2A có thể tương tác đặc hiệu với PIP5KA. Các thành phần của protein KIF2A bao gồm: vùng hình cầu (globular domain-GD), vùng vận chuyển (motor domain) và vùng đầu C được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli. Tiến hành thử nghiệm tủa miễn dịch (Immunoprecipation) Chương 1: Tổng quan tài liệu  12 nhóm tác giả chứng minh vùng hình cầu và motor domain có thể gắn với PIP5KA. Công trình nghiên cứu này vẫn đang được tiến hành tại phòng thí nghiệm (Kanaho Lab) trường Đại học Tsukuba – Nhật Bản. 1.3. Phức hợp adaptor protein AP-2 1.3.1. Cấu trúc của protein AP-2 Ở tế bào động vật, quá trình nhập bào giữ vai trò quan trọng, đó là cách tế bào liên lạc giữa với môi trường xung quanh để trao đổi các chất cần thiết cho quá trình tăng trưởng. Có nhiều con đường khác nhau tham gia vào quá trình này như ẩm bào, thực bào, con đường nhập bào phụ thuộc và không phụ thuộc vào clathrin. Con đường nhập bào thông qua clathrin thường được tế bào sử dụng để vận chuyển các chất dinh dưỡng, các thụ thể tín hiệu…Bởi vì bản thân clathrin không thể liên kết với màng tế bào nên quá trình này cần một adaptor protein để vận chuyển clathrin đến vị trí nhập bào. Một trong những adaptor protein quan trọng là phức hợp AP-2 [33]. Họ protein AP gồm 6 protein khác nhau. Protein AP-1A, AP-2, AP-3A và AP-4 hiện diện nhiều ở động vật có vú. Hai protein AP-5 và AP-6 là dạng tương đồng phụ thuộc loại tế bào của AP-1A. Cấu trúc chung của AP gồm hai tiểu phần có kích thước lớn (là γ1 và β1 của AP-1, α và β2 của AP-2, δ và β3 của AP-3, ε và β4 của AP-4), một tiểu phần trung gian (µ1, µ2, µ3 và µ4- kích thước 50 kDa) và một chuỗi nhỏ (σ1, σ2, σ3 và σ4 – kích thước 20 kDa) [28] [33]. Cũng như các AP khác, protein AP-2 (còn gọi là protein Adaptin) gồm hai tiểu phần lớn α và β2, tiểu phần µ2 và tiểu phần nhỏ σ2 tạo thành phần lõi. Vùng ear liên kết với phần lõi thông qua vùng khớp nối (hinge) (hình 1.7 A). Tiểu phần β2 gồm 3 vùng chính: vùng N thuộc phần lõi của Adaptin, vùng ear gắn với các thành phần nội bào và vùng khớp nối liên kết giữa vùng ear và vùng N (hình 1.7 B). Chương 1: Tổng quan tài liệu  13 1.3.2. Adaptin là protein tương tác đặc hiệu với PIP5KC661. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy quá trình sắp xếp của AP-2 trên màng tế bào được điều hòa bởi PIP2. Phức hợp AP-2 có thể gắn với PIP2 và cũng có thể gắn với Phosphatidyl inositol (3, 4, 5) triphosphate (PIP3) [3]. Tiểu phần α2 của Adaptin tương tác với PIP2 thông qua những vị trí tích điện dương như R11, N39, K43, K57, Y58, và K61. Một vị trí gắn khác của Adaptin với PIP2 nằm trên tiểu phần µ2 gồm các nối lysine (Lys341, Lys343, Lys345, Lys354, và Lys356). Tương tác này xảy ra khi Adaptin định vị trên màng tế bào và tiểu phần µ2 gắn với một protein vận chuyển [1]. Công trình của Bairstow (2006) đã chứng minh PIP5KC661, một enzyme xúc tác việc tổng hợp PIP2 trong tế bào, trực tiếp tương tác với Adaptin. Đầu tiên, tương tác này được tìm thấy khi sử dụng hệ thống lai kép ở nấm men (yeast two- hybrid) trong đó sử dụng một trình tự gồm 178 amin acid ở đầu C của PIP5KC661 làm mẫu dò và tiểu phần µ2 của Adaptin có thể gắn với PIP5KC661. Tương tác giữa Adaptin và PIP5KC661 trong in vivo được chứng minh bằng phương pháp tủa miễn dịch protein Adaptin biểu hiện ở tế bào HEK293 sử dụng kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu α-adaptin và PIP5KC được phát hiện bằng kháng thể đa dòng kháng protein này. Kết quả cho thấy tương tác PIP5KC661 và Adaptin điều hòa quá trình vận chuyển ion Fe2+ vào trong tế bào [3]. Một nghiên cứu khác của nhóm chúng tôi (Nakano A.K, 2007) đã chứng minh tiểu phần β2 của Adaptin có thể liên kết với PIP5KC661 và hoạt hóa protein Hình 1.7. Cấu trúc của protein Adaptin (A) và các thành phần của tiểu phần β2 (B) A B Khớp nối Phần lõi Chương 1: Tổng quan tài liệu  14 này. Ngoài ra, PIP5KC661 còn có thể tương tác với tiểu phần β1 của AP-1, là một trình tự có độ tương đồng cao (80 %) với β2 của AP-2. Để xác định vị trí tương tác trên tiểu phần β2, chúng tôi đã tạo dòng và biểu hiện ba thành phần của β2 là trình tự đầu N, vùng ear và hinge (hình 1.5 B) dưới dạng dung hợp với đuôi GST. Kết quả cho thấy vùng ear chính là vị trí tương tác giữa PIP5KC661 và Adaptin. Hoạt động in vitro của PIP5KC tăng khi vùng ear của tiểu phần β2 gắn vào đầu COOH- của protein này. Và mức độ hoạt động phụ thuộc vào nồng độ của vùng ear. Hơn nữa, tương tác giữa hai phân tử này được điều hòa bởi quá trình loại nhóm phosphate của PIP5KC661. Một mô hình (hình 1.8) được đề xuất về vai trò của Adaptin và PIP5KC661 trong việc dẫn truyền trong tế bào thần kinh: ở trạng thái nghỉ, PIP5KC661 được liên tục phosphoryl hóa bởi Cdk5 và tương tác của nó với Adaptin bị ức chế. Khi nhận được kích thích tới ngưỡng, điện thế màng thay đổi đến giai đoạn có sự cân bằng điện thế (depolarization), PIP5KC661 được dephosphoryl hóa bởi clathrin và sau đó tương tác với Adaptin, tiếp theo PIP5KC661 được hoạt hóa và tham gia tổng hợp PIP2. Kết quả là khởi động quá trình xuất và nhập bào ở synapse [1]. Hình 1.8. Tương tác giữa Adaptin và PIP5KC661 [1] Chương 1: Tổng quan tài liệu  15 1.4. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử Split Venus. 1.4.1. Hệ thống bổ trợ huỳnh quang hai phân tử (Bimolecular Fluorescence Complementation – BiFC). Tương tác protein-protein có vai trò quan trọng trong con đường truyền tín hiệu và nhiều chức năng của tế bào. Việc xác định mỗi protein tương tác với những protein khác trong điều kiện nội bào như thế nào cho phép hiểu rõ hơn bản chất của protein. Một vài phương pháp đã được sử dụng trong nghiên cứu tương tác này là hệ thống lai kép (two-hybrid system), thử nghiệm bổ trợ protein (protein complementation) và FRET (fluorescent resonance energy transfer). Thử nghiệm BiFC cho tín hiệu tương tác trực tiếp và tốt hơn nên đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu liên kết protein-protein tế bào. Hệ thống BiFC đầu tiên được phát triển dựa trên thử nghiệm bổ trợ protein, sử dụng protein huỳnh quang màu vàng (EYFP) và protein huỳnh quang màu xanh lá (ECFP). [35]. Nguyên tắc của hệ thống này dựa trên sự tái sắp xếp của hai mảnh đầu N và đầu C của một protein huỳnh quang, tự bản thân hai mảnh này không có khả năng phát huỳnh quang. Hai protein A và B được dung hợp vào hai mảnh này thông qua linker. Khi hai protein A và B tương tác hoặc liên kết với nhau thi hai mảnh N và C được kết hợp lại và cho tín hiệu huỳnh quang khi được kích thích ở bước sóng thích hợp (hình 1.9). Đồng thời kĩ thuật này cũng cho phép xác định vị trí protein trong tế bào [12]. Hình 1.9. Nguyên tắc của hệ thống BiFC [12] Chương 1: Tổng quan tài liệu  16 1.4.2. Hệ thống Split Venus Venus là dạng đột biến mới của protein huỳnh quang màu vàng YFP (yellow fluorescence protein). Quá trình nhận kích thích và phát ra ánh sáng huỳnh quang tương ứng liên quan đến hai giai đoạn: protein gấp cuộn, sau đó hình thành các nhóm phát huỳnh quang (chromophore). Các đột biến F46L/F64L/M153T/V163A/S175G trên Venus làm tăng độ bền của protein này so với protein YFP. Đồng thời, đột biến F46L thúc đẩy quá trình oxi hóa trong giai đoạn tạo chromophore và tăng cường tín hiệu huỳnh quang của Venus ở nhiệt độ 370C [25, 26]. Bước sóng kích thích tối ưu của Venus là 515 nm và bước sóng phát ra tương ứng là 528 nm [44]. Shyu và cs (2006) đã sử dụng nhiều tổ hợp protein phát huỳnh quang như protein Venus, Cerulean và Cyan. Kết quả cho thấy sự kết hợp giữa mảnh C155 (gồm trình tự amino acid 155 đến 238) của protein huỳnh quang Cyan và mảnh N173 (gồm trình tự amino acid 1 đến 172) của Venus hoặc Cerulean hoạt động hiệu quả trong điều kiện sinh lí của tế bào. Hơn nữa, hệ thống này cho tín hiệu cao gấp 13 lần so với BiFC sử dụng các mảnh của protein huỳnh quang YFP. Trước đây, khi sử dụng protein YFP cần có bước ủ tế bào ở nhiệt độ thấp trước khi quan sát tín hiệu BiFC. Nhưng hệ thống BiFC mới đã khắc phục được điều này [35]. Hệ thống split Venus sử dụng trong đề tài này được tạo ra bởi Yelena Altshuller (M.A. Frohman Lab) vào tháng 6 năm 2006 dựa trên công trình của Shyu và cộng sự. Plasmid khung sườn của hệ thống này là pEGFP- N1 và pEGFP-C1. Đối với plasmid pVenus (1-173) N-1, plasmid pVenus (155-238) N-1, trình tự Venus từ amino acid 1 đến 173 và trình tự từ amino acid 155 đến 238 lần lượt được nhân bản với cặp mồi trong đó mồi ngược có chứa trình tự linker và được dòng hóa vào vị trí Agel và BsrG1 của plasmid pEGFP-N1 thay thế cho trình tự gene mã hóa protein EGFP. Gene mục tiêu khi dòng hóa vào hai plasmid này được điều khiển bởi promoter CMV và biểu hiện dưới dạng dung hợp vào đầu N của protein Venus. Protein mục tiêu và Venus liên kết với nhau thông qua một linker gồm 18 amino acid. Các vector này có mang gene kháng neomycin/kanamycin và tín hiệu Chương 1: Tổng quan tài liệu  17 polyadenylation (poly A) từ gene mã hóa cho protein Thymidine kinase của virus Herpes simplex (HSV TK) cho phép thực hiện quá trình chuyển gene ổn định vào tế bào Eukaryote và chọn lọc trên môi trường có bổ sung G418 (hình 1.10). Trình tự Nucleotide của linker, các mảnh Venus và vị trí của các enzyme cắt hạn chế trong vùng MCS được trình bày trong phần phụ lục. Mục tiêu và nội dung thực hiện: Như đã nói trên, sự hoạt hóa protein PIP5K là khởi nguồn của nhiều quá trình sinh học trong tế bào. Với mục tiêu xác định sự hoạt hóa in vitro của protein PIP5KA và PIP5KC661 dựa trên tương tác đặc hiệu của hai protein này với protein tương tác (partner protein) tương ứng, chúng tôi sử dụng hệ thống Split Venus và tiến hành các nội dung sau: 1. Tạo dòng cDNA vùng hình cầu của protein KIF2A và vùng ear của β2- Adaptin vào vector pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238). 2. Kiểm tra sự biểu hiện của các protein và hiệu quả hoạt động của hệ thống Split Venus. 3. Xác định sự hoạt hóa của PIP5KA, PIP5KC661 và những biến đổi kiểu hình trên dòng tế bào HeLa clone 3. Hình 1.10. Sơ đồ plasmid pVenus (1-173) N1 và pVenus (155-238) N1