Luận văn Xác định và so sánh các mẫu sản phẩm dệt thực tế ở nước ta hiện nay có xử lý bằng thuốc nhuộm, thuộc nhóm thuốc nhuộm Azo dựa trên những amin bị cấm

àng quang và thận. Bên cạnh đó người tiêu dùng, may mặc cũng bị ảnh hưởng nhưng ở mức độ nhỏ, đó là thuốc nhuộm tan chảy từ quần áo vào nước rồi hấp thụ vào da và tích luỹ dần lượng amin độc hại trong cơ thể. Cùng với sự phân loại theo MAKIII(A1,A2) Mỹ cũng đưa ra những chỉ số rất quan trọng cho an toàn sức khoẻ; TWA( nồng độ mg/m3 trung bình 8 giờ/ngày hay 40 giờ/1 tuần), STEL( giới hạn nồng độ trung bình cho phép trong 15 phút) và dựa vào những chỉ số này Mỹ đã phân loại theo các amin theo ACGIH ví dụ: (A2) chất gây ung thư; (A/b) cho là gây ung thư trên người ;(C) nồng độ tối đa. Phần II: phương pháp nghiên cứu II.1. Phương pháp xác định các amin gây ung thư của đức Phương pháp ban đầu để pháp hiện thuốc nhuộm azo bị cấm trên các sản phẩm dệt đã nhuộm màu (Viện Liên bang về bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng và y tế vệ sinh của Đức). Phương pháp này được nhóm công tác ‘‘ Phân tích thuốc nhuộm azo bị cấm” trong phân cục 35 của chương trình thực phẩm và hàng hoá xây dựng. II.1.1. Mục đích và phạm vi ứng dụng Phương pháp này mô tả một quy trình pháp hiện việc sử dụng thuốc nhuộm azo bị cấm theo Pháp lệnh về hàng hoá, trong sản xuất và sử lý sản phẩm dệt may đã nhuộm màu, đặc biệt là sản phẩm dệt từ xenlulô và protein ( bông, visco, len, tơ tằm). II.1.2. Cơ chế tách amin thơm như sau: R - N = N - R’ T/N. Azo đ/k khử R - NH2 + R’- NH2 Amin thơm II.1.3 Giới hạn sự có mặt của amin thơm của thuốc nhuộm azo trên vải Theo kiến thức khoa học hiện tại, bằng chứng của việc dùng thuốc nhuộm azo bị cấm trong sản xuất hoặc trong xử lý sản phẩm dệt khi mà sản phẩm dệt hay các phần của nó đã nhuộm màu được xử lý trong những điều kiện quy trình (3.2- Phần thực nghiệm), có thể tách ra 1 trong các amin dưới đây với giới hạn phát hiện không vượt quá 30 mg/kg sản phẩm nhuộm màu. Theo phương pháp này thuốc nhuộm azo bị cấm do sự phân ly các nhóm azo của chúng sinh ra các amin o- amminoazotoluene (CAS –No: 97-56-3) và 2-amino-4-nitrotoluene (CAS-No: 99-55-8) liệt kê trong Pháp lệnh về hàng hoá, được phát hiện thông qua các amin o-toluidine và/ hoặc 2,4- diaminotoluene. Trường hợp sự có mặt của 2- naphthylamine được phát hiện với mức vượt quá 30 mg/kg sau quá trình phân ly tách khử ở mục III.3.2-phần thực nghiệm, sự sử dụng thuốc nhuộm azo bị cấm có thể chưa được khẳng dịnh chắc chắn nếu không có thông tin bổ xung, ví dụ cấu trúc hoá học của thuốc nhuộm. Như vậy chỉ cần phải phân tích trong số 18 amin sắp xếp theo thứ tự ở bảng 4 sau: II.1.4. Kết quả việc xác định thuốc nhuộm azo trên vải được công nhận khi: 1- Thực hiện theo phương pháp thử của Đức. 2- Xác định định tính amin thơm thực hiện ít nhất theo hai trong các phương pháp sắc kí sau: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Sắc ký khí hoặc quang phổ khối Điện di mao mạch với DAD Quang phổ hồng ngoại Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân 3- Xác định định lượng amin thơm phải thực hiện trên sắc ký lỏng cao áp đầu đo Diode array detector (DAD) 4- Phòng thí nghiệm được cấp chứng chỉ có hệ thống quản lý chất lượng ISO 9002 hoặc EN 45001 hoặc ISO 17025. II.1.5. Mô tả sơ lược quy trình Mẫu sản phẩm dệt được sử lý với Natri-dithionite (Na2S2O4) trong dung dịch đệm citrate (pH= 6) ở 700C trong bình kín. Các ammin giải phóng ra trong quá trình khử được chuyển sang pha t-butylmethylether bằng cách chiết lỏng -lỏng trong cột extrelut. Phần chiết butylmethylether sau đó được cô đặc ở điều Bảng 4: Danh mục 18 amin thơm độc hại có thể tách ra từ các thuốc nhuộm azo bị cấm STT Amin Công thức phân tử & số CAS –No. To n/c ,oC(Po) Tos, oC 1. 4- Aminobiphenyl (4- Biphenylamine) C6H5C6H4NH2 (92-67-1) 52- 54 191 2. Benzidine NH2C6H4C6H4 NH2 (92-87-5) 128 3. 4- Cloro- o- toluidine (4- Cloro- 2- methylaniline) Cl C6H3(CH3)NH2 (95-69-2) 29- 30 241 4. 2- Naphthylamine (2- Aminonaphthalene) C10H7NH2 (91-59-8) 111-113 306 5. p - Chloroaniline Cl C6H4NH2 (106-47-8) 69-72 232 6. 2,4- Diaminoanisole (4-Methoxy-1,3-phenylenediamine) CH3 OC6H3(NH2)2 (615-05-4) 7. 4,4’- Diamino- diphenyl methane (4,4- Methylenedianiline) CH2(C6H4NH2)2 (101-77-9) 89-91 8. 3,3’-Dichlorobenzidine (Cl C6H3NH2)2 (91-94-1) 9 3,3’- Dimethoxybenzidine ( o- Dianisidine) (CH3O C6H3NH2)2 (119-90-4) 137-138 10. 3,3’- Dimethylbenzidine ( o- Tolidine) (CH3 C6H3NH2)2 (119-93-7) 128-131 11. 3,3’- Dimethyl- 4,4’- diaminodiphenylmethane (CH3 C6H3NH2)2CH2 (838-88-0) 12. 2- Methoxy- 5- methylaniline ( p- Cresidine) CH3O C6H3(CH3) NH2 (120-71-8) 52-54 235 13. 4,4-Methylenebis – (2-chloroaniline) (Cl C6H3NH2)2CH2 (101-14-4) 102-107 202-214 14. 4,4’- Oxydianiline (4- ammino phenyl ether ) O(C6H4NH2)2 (101-80-4) 190-193 15. 4,4’- Thioxydianiline S(C6H4NH2)2 (139-65-1) 107-109 16. o- Toluidine CH3 C6H4NH2 (95-53-4) 199-200 17. 2,4- Diamino toluene (4-Methyl-1,3-phenylenediamine) CH3 C6H3(NH2)2 (95-80-7) 97-99 283-285 18. 2,4,5- Trimethylaniline (CH3)3 C6H2NH2 (137-17-7) kiện êm dịu trong thiết bị bốc hơi quay chân không và phần cô đặc được hoà tan trong methanol hoặc ethyl acetate, tuỳ thuộc vào phương pháp xác định amin tiếp theo. Việc xác định amin được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp dùng dioe array detector ( HPLC/DAD), sắc ký bản mỏng ( TLC, HPTLC) và định lượng mật độ kế , sắc ký khí mao quản với đầu đo ion hoá ngọn lửa và /hoặc một đầu đo phổ khối (GC/FID hoặc / và MSD), hoặc bằng điện di mao mạch với dide array ditector (CE/DAD). Các amin được xác định bằng ít nhất 2 phương pháp tách sắc ký khác nhau để tránh bất kỳ một sự giải thích sai lệch nào gây ra bởi các chất có ảnh hưởng ( như là các các đồng phân vị trí của các amin phải được xác định) và vì vậy có các kết luận không đúng đắn. II.1.6. Độ tin cậy của phương pháp Độ lặp lại và khả năng so sánh được xác định bởi sự thử nghiệm liên phòng thí nghiệm để đánh giá kết quả của phương pháp này. Phương pháp này đã trải qua quá trình thử nghiẹm thống kê ban đầu trên 4 vải thử nghiệm định trước thực hiện tại 7 phòng thí nghiệm. Việc đánh giá thống kê dựa trên 8 hoặc 9 giá trị riêng biệt cho mội loại vải thử (Bảng 5) Mức độ thu hồi của các amin 2, 5, 7, 8, 9, 10, 16 và 17 trong dung dịch chuẩn định đã được kiểm tra bởi 6 phòng thí nghiệm (Bảng 6) Bảng 5: Đánh giá thống kê Xơ Amin MW (mg/kg) S (mg/kg) VK Len 3,3’-Dimethylbenzidine 458 ±87 19 Bông Benzidine 635 ±100 16 Polyacrylate/len 4,4’-Diaminodiphenylmethane 38 ±6 15 Visco 3,3’-Đimethoxybenzidine 646 ±122 19 MW : Giá trị trung bình ; S : Độ lệch chuẩn ; VK : Hệ số biến đổi Bảng 7 - Đánh giá mức thu hồi Amin Mức độ thu hồi G.trị TB Giá trị riêng 2. Benzidine 40 87 91 92 94 111 86 5. p- Chloroaniline 62 77 88 94 101 181 100 7. 4,4’- Diaminodiphenylmethane 56 85 90 92 81 8. 3,3’- Diclorobenzidine 85 91 98 98 101 108 97 9. 3,3’- Dimethoxybenzidine 68 76 109 109 120 125 100 10. 3,3’- Dimethylbenzidine 75 79 94 94 96 130 94 16. o- Toluidine 64 70 87 87 98 118 97 17. 2,4- Diamino toluene 38 60 73 73 74 97 68 II.1.7. Báo cáo phân tích Mọi báo cáo phân tích đều đề cập tới quy trình phân tích này và khẳng định các điểm sau: Loại, nguồn gốc và dự kiến mục đích của vật phẩm đem phân tích hoặc một phần từ đó. Mọi sai lệch khỏi quy trình phân tích, đặc biệt mọi bước thêm và đã thực hiện. Thông báo về quy trình tách đã áp dụng và các phương pháp đã dùng cho đo đạc và xác định Trong trường hợp mức có mặt của mỗi amin [ 30 mg/kg: + “ Theo sự phân tích đã tiến hành, thuốc nhuộm azo bị cấm bởi Pháp lệnh hàng hoá không thấy được trong sản phẩn liên quan’’. + “ Kết quả phân tích cho thấy rằng sản phẩm liên quan đã được sản xuất hoặc xử lý theo cách dùng thuốc nhuộm azo bị cấm bởi Pháp lệnh hàng hoá”. Trong trường hợp của 2- Naphthylamine > 30 mg/kg thì phải có thêm bổ xung thông tin như danh pháp, tên thường của loại thuốc nhuộm đó. Các chú ý về an toàn: Các amin kể trên được phân loại vào nhóm các chất đã được khẳng định hoặc nghi ngờ gây ra ung thư cho người ( bảng A1 và 2 cho dưới danh sách MAK- nồng độ cho phép tối đa trong công việc). Mọi thao tác với chất này đòi hỏi cẩn thận đặc biệt và cảng báo trước về sức khoẻ. III.2. ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp để xác định các amin thơm tách ra từ thuốc nhuộm azo trên vải Việc tách và xác định các amin thơm bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp được dựa vào tính chất dịch chuyển với tốc độ khác nhau của các amin giữa pha tĩnh và pha động của những hệ dung môi nhất định, trong đó pha tĩnh là chất nhồi cột có kích thước hạt nhỏ và dung dịch rửa giải pha động được bơm ở áp suất cao nhờ đó hiệu quả tách rất cao. Các thành phần cơ bản của hệ thống sắc kí lỏng cao áp bao gồm: Bơm cao áp Van bơm mẫu Cột sắc kí Hệ thống phát hiện và chỉ thị kết quả Sơ đồ của một hệ thống sắc ký lỏng cao áp được mô tả trên hình 1 II.2.1. Bơm Các loại bơm tốt thường được dùng là bơm xilanh lượng lớn, xilanh có đệm (teflon với lò xo để giảm tối đa độ hở xung quanh pitông ở áp suất cao). Thể tích lạp có thể đến vài trăm mililit. Bằng cách sử dụng bánh răng cơ học để điều chỉnh pitông ta sẽ thu được tốc độ dòng ổn định và độ lặp lại cao. Với xilanh thép không gỉ có thể vận hành dưới áp suất vài trăm bar. Để loại trừ nhiễu của đường nền thường người ta có thể sử dụng bơm nhiều pitông. Hình 1 : Sơ đồ hệ thống sắc kí lỏng cao áp 1,2 : Các bình chứa dung môi 1,2 3,4 : Nước 10 : Cột sắc kí 11 : Đèn phát xạ 5 : Thiết bị đuổi khí 12 : Detector 6 : Thiết bị tạo Gradient 13 : Bộ điều khiển 7 : Hệ thống bơm pittông 14 : Máy tính ( hiển thị) 8 : Bộ trộn 15 : Thiết bị ổn nhiệt 9 : Vòng mẫu 16 : Bình chứa dung môi thải II.2.2. Pha động, tốc độ dòng, áp suất Trong sắc kí lỏng thành phần của dung môi hoặc pha động là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự tách. Pha động thường là các dung môi hữu cơ hoặc nước. Pha động cần phải đạt được những yêu cầu sau : Không làm già hóa cột tách và đặc tính của nó Phù hợp với detector Hòa tan mẫu càn tách Có độ nhớt thấp Cho phép thu hồi lại mẫu nếu cần thiết Tinh khiết ,không độc Dễ tìm và giá cả vừa phải. Hầu hết trong quá trình SKLCA không dùng lại dung môi vì lượng dung môi không lớn lắm và việc tái sinh lại chúng không kinh tế. Tất cả dung môi dùng cho SKLCA phải được làm sạch hết khí. Không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu. Có thể loại khí khỏi dung môi bằng cách đun nóng hoặc hút chân không hay kết hợp cả hai cách, bằng siêu âm... Hiệu quả cột tách phụ thuộc một phần vào sự lựa chọn tốc độ dòng. đối với các cột tách có độ phân giải cao với đường kính trong 2 mm thường vận hành ở tốc độ 10-60 ml/h ứng với áp suất khoảng 30 đến 300bar. áp suất phụ thuộc vào sự thẩn thấu của cột, độ nhớt của pha động,đường kính các chất và độ dài cột tách. đối với một dung môi nào đó khi chiều dài cột tách tăng, kích thước hạt chất nhồi giảm, muốn cho tốc độ dòng tăng cần phải tăng áp suất thích hợp. Như vậy tốc độ dòng và áp suất ảnh hưởng đến thời gian phân tích. II.2.3. Vòng bơm mẫu Dùng xilanh cỡ 1-100 um để bơm mẫu,khi mẫu vào không được làm xáo trộn chất nhồi trong trong cột. Hai kiểu bơm mẫu được sử dụng dựa trên nguyên tắc : a) cùng với dòng dung môi ; b) ngừng dòng. Với kiểu bơm mẫu thứ nhất có thẻ thực hiện trong sắc kí khí nghĩa là nhờ xilanh bơm mẫu qua đệm ngăn váo trong dung môi. Cấu trúc bộ phận bơm mẫu phải tránh được thể tích chết. Các xilanh thông thường làm việc ở áp suất 50- 480 bar, ở áp suất cao hơn phải sử dụng các xilanh đặc biệt. Một vấn đề lớn đặt ra cho hệ thống bơm mẫu này là chẳng những đệm ngăn phải chịu được áp suất cao, bền với dung môi mà còn không được chứa các chất dẻo hóa, chất chống ôxy hóa... Để bơm mẫu lớn hơn 10 ul và đặc biệt trong sắc kí thẩn thấu qua gen, mẫu là các dung dịch polime có độ nhớt cao người ta sử dụng kiểu van quay gắn với vòng chứa mẫu, có dung tích đã biết. Trong hình 2a là van ở vị trí bơm mẫu vào vòng chứa mẫu, khi quay sang vị trí ở hình 2b mẫu được đẩy vào cột tách. Khi làm việc với áp suất rất cao, mẫu được đưa vào cột tách bằng phương pháp thứ hai dựa trên nguyên tắc ngừng dòng, ở đây mẫu được đưa vào cột tách khi dòng dung môi ngừng lại không chịu áp suất, sau khi mẫu được đưa vào cột tách dung môi lại tiếp tục được bơm.Sau một thời gian ngắn áp suất mới đạt được cân bằng. Nhược điểm của phương pháp này là có thể làm cho độ nhồi chặt của cột tách thay đổi do áp suất dao động lúc ngừng dòng. Hình 2: Bơm mẫu theo kiểu van quay II.2.4. Cột tách và cách nhồi cột Cũng như trong SKK, cột tách trong SKLCA được coi là trái tim của cả hệ thống thiết bị. Cột tách sắc kí lỏng phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và có thể chịu được áp suất cao. Thuỷ tinh, thép không gỉ, tantal, đồng, nhôm có thể sử dụng để làm cột tách sắc kí lỏng. Chiều dài cột tách từ vài centimet đến 10m đã được ứng dụng trong SKLCA. Cột tách phân tích hay dùng nhất dài 12,5-25 cm, đường kính trong 2-4mm. áp suất giọt đầu cột tách tỉ lệ trực tiếp với chiều dài cột tách và tỉ lệ nghịch với bình phương của đường kính hạt chất nhồi. Cấu hình cột tách thẳng hay cong không có ảnh hưởng lớn lắm đến quá trình tách. Thường với cột tách phân tích khoảng dưới 1m ở dạng thẳng. Cột tách dạng thẳng bao giờ cũng dễ nhồi hơn. Trước khi nhồi, cột tách làm bằng thép không gỉ (thực tế hay dùng loại này nhất) được làm sạch bằng HNO 50%, rửa bằng nước rất nhiều lần, tráng bằng axeton, cloroform lại bằng axeton và cuối cùng làm khô bằng khí N hoặc không khí nóng. Các phần gá lắp ở đầu và cuối cột tách với các bộ phận khác cũng rất quan trọng và làm giảm thể tích chết ít nhất. ở các đầu cột tách phải sử dụng các màng lọc bằng thép không gỉ, thuỷ tinh xốp ép, teflon xốp. Bông thuỷ tinh thường được dùng để ngăn cách hạt nhỏ. Lỗ xốp của vật liệu làm ngăn phải nhỏ hơn kích thước các hạt nhồi ít nhất là 5 lần. Các loại chất nhồi cột trong SKLCA. Cũng như trong các loại sắc kí khác, trong SKLCA chất nhồi quan trọng và phổ biến nhất là silicagen, sau đó đến nhôm ôxit. Các loại pha ngược (RP-2, RP-8)... II.2.5. Lượng mẫu Lượng mẫu cực tiểu phụ thuộc vào độ nhạy đetectơ. Nói chung mẫu phân tích có thể nhỏ đến mức tối thiểu vì rằng lượng mẫu lớn dẫn đến sự xen phủ và mất độ phân giải. Lượng mẫu lớn nhất trong sắc kí điều chế được xác định bằng độ phân giải cực tiểu. Mối quan hệ giữa lượng mẫu, độ phân giải và tốc độ phân tích được mô tả bằng sơ đồ tam giác: Hình 3: Mối quan hệ tốc độ, lượng mẫu và độ phân giải Dung lượng mẫu của cột tách phụ thuộc vào chất nhồi cột. Các hạt xốp có bề mặt rất lớn so với loại không xốp. Điển hình nhất là chất hấp phụ xốp có diện tích bề mặt đến 200-400m/g. Đối với cột chất hấp phụ xốp với chiều dài 1m đường kính trong 2,1mm có thể bơm vào khoảng 2-5mg lượng mẫu, đây là một trong những ưu điểm lớn của SKLCA so với SKK. II.2.6. Các loại đêtectơ dùng trong sắc kí lỏng cao áp * Đêtectơ UV-Vis (hấp thụ tử ngoại và khả kiến) : Được dùng rộng rãi trong sắc kí lỏng áp suất cao. Nó dựa trên nguyên lí : Hấp phụ ánh sáng được mô tả qua định luật Lambe- beer. A = log I0 = e .C .l I A: độ hấp thụ e : hệ số tắt phân tử C : nồng độ chất (M/l) I0 : cường độ ánh sáng tới I : cường độ ánh sáng truyền qua l : chiều dày của cuvet Nhược điểm của đêtectơ UV là chỉ có khả năng phát hiện các mẫu chất hấp thụ trong vùng UV gần với bước sóng của đêtectơ và các chất rửa giải phải hoàn toàn không hấp thụ tử ngoại ở bước sóng của đêtectơ. + Detector có bước sóng đơn : Dùng đèn thuỷ ngân áp suất thấp có hiệu suất năng lượng cao tại 254 nm. Các loại detector này đơn giản, chắc chắn và làm việc với độ nhiễu thấp. Hạn chế chung của loại này là chất tan phải hấp thụ mạnh ở bước sóng 245nm mà không bị dung môi và các chất khác cản trở. + Detector có bước sóng thay đổi : Thường dùng đèn dertori bước sóng nằm trong khoảng 190 - 600 nm. Chúng có các nguồn phổ liên tục có năng lượng cao, cho các tai đơn sắc rộng và ổn định, có hệ điện tử cho nhiễu thấp. Các detector này ưu việt hơn hẳn so với detector bước sóng đơn, nó cho bước sóng tối ưu đối với các cực đại hấp thụ, chọn được sự hấp thụ tót nhất của chất tan so vói hấp thụ của dung môi hoặc chọn được sự hấp thụ tốt nhất của chất tan so với hấp thụ của các chất cản trở. Có thể tiến hành chọn bước sóng một cách liên tục trong khoảng tử ngoại và khả kiến. + Detector đa bước sóng : Loại detector (DAD) này dùng dãy diot quang tuyến tính có vùng sóng từ 108 -1022 nm với tốc độ phân giải 2- 5 nm. Toàn bộ quang phổ được ghi trong 10 mili giây và cứ sau 10 mili giây quá trình đó lặp lại. * Đêtectơ chiết suất vi sai (RI). Nguyên tắc của đêtectơ này dựa trên sự khác nhau giữa chỉ số chiết suất của dung dịch và dung môi nguyên chất. Thông thường điều này được tiến hành bằng cách đo sự khúc xạ của tia sáng đơn sắc đi qua mẫu chứa trong khuôn. Các đêtectơ loại này rất bền và nhạy, ngày nay hầu như được sử dụng rất phổ biến cho sắc kí thẩm thấu qua gen. Một nhóm khác của đêtectơ chiết suất vi sai dựa trên cơ sở hiệu ứng ứng fresnen. Đêtectơ chiết suất này xác định cường độ tia phản xạ tỉ lệ nghịch với chỉ số chiết suất. Thay vì sự phản xạ, đêtectơ cũng có thể được chế tạo để đo sự truyền qua. Người ta còn sử dụng đêtectơ dựa trên hiệu ứng Christian để xác định sự thay đổi chỉ số chiết suất. * Đêtectơ vận chuyển. Đêtectơ vận chuyển ra đời cùng với sự xuất hiện của SKLCA trước đây, ngày nay nó được phục hồi và phát triển. Trước khi phát hiện mẫu, dung môi rửa giải phải được loại trừ. Muốn vậy trước khi qua lò nhiệt phân, bộ phận vận chuyển phải được làm sạch bằng cách đốt nóng để làm cháy các hợp chất hữu cơ còn sót lại trên bề mặt. Sau khi làm bay hết dung môi rửa giải, mẫu chất không bay hơi được đưa vào lò ôxi hoá thiêu cháy ở 600-800C, sản phẩm cháy được bơm qua vùng có xúc tác và Hchuyển thành CHvà được phát hiện bởi đêtectơ ion hoá ngọn lửa. Dây vận chuyển có độ dài đến 10km với độ dày 0,12mm. Tất cả các bộ phận lò đều được điều nhiệt nhằm giảm ảnh hưởng của sự thay đổi môi trường. Tín hiệu của đêtectơ được ghi lại bằng phương pháp thông thường. Ưu điểm lớn nhất của hệ đêtectơ này là trong trường hợp lí tưởng chỉ phát hiện riêng mẫu. * Đêtectơ hấp thụ nhiệt. Đêtectơ này dựa trên cơ sở đo nhiệt hấp thụ và nhiệt giải hấp. Chất tan trong dòng chảy tiếp xúc với chất hấp thụ trong đó có bộ phận đo nhiệt rất nhạy. Bộ phận này phải điều nhiệt rất tốt, sự thay đổi nhiệt độ khoảng 0,003C. Ngoài những loại đêtectơ kể trên, các đêtectơ khác dựa trên nguyên tắc dùng các bước sóng kích thích của đèn thuỷ ngân (đêtectơ huỳnh quang), cực phổ (đêtectơ điện hoá ), độ dẫn (đêtectơ độ dẫn), hằng số điện môi, hoạt độ phóng xạ, ghép SKLCA với quang phổ khối và để xác định các hợp chất vô cơ người ta còn ghép SLKCA với quang phổ hấp thụ nguyên tử. * Đêtectơ huỳnh quang rất đặc trưng và sử dụng nó phải chú ý hơn nhiều so với đêtectơ UV nhưng độ nhạy của đetectơ này rất lớn hơn nhiều so với đêtectơ UV và khoảng tuyến tính cũng lớn hơn. Nhưng không thể dùng các dung môi là các hợp chất chứa oxi vì nó làm tắt huỳnh quang. * Đêtectơ điện hoá dựa trên việc áp dụng các phương pháp oxi hoá hoặc khử điện hoá để phát hiện mẫu trong chất rửa giải. * Đêtectơ đo hoặt tính phóng xạ chỉ dùng để phát hiện các hợp chất chứa các nguyên tử đánh dấu phóng xạ. * Đêtectơ hằng số điện môi nhạy hơn đêtectơ chiết suất và không bị ảnh hưởng bởi tốc độ dòng nhưng hiện nay vẫn chưa phổ biến. Gần đây đêtectơ phản ứng đã được phát triển và sử dụng rộng. II.2.7. Những kiểu tách sắc kí lỏng cao áp Sắc kí lỏng- rắn Nguyên tắc của nó là các phân tử chất tan bị lưu giữ lại bởi pha tĩnh (là chất rắn) và xảy ra trên bề mặt. Sau đó pha động là dung dịch rửa giải (gradient) để tách các phân tử cần tách. & Sắc kí lỏng- lỏng (sắc kí phân bố) Quá trình tách dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử mẫu cần phân tích giữa pha tĩnh và pha động. Điều kiện ở đây là chất mang phải trơ Pha tĩnh : Thường là dung môi phân cực được dùng nhiều hơn và độ phân cực thì phải rất khác nhau so với dung môi của pha động (thường là không phân cực). Chất mang : Có thể là chất rắn tương đối không hoạt động, chất mang lỗ xốp có bề mặt xác định ( như Al2O3, silica, ...) Pha động : Phải có độ tan rất hạn chế đối với pha tĩnh, nhưng pha động lại ít nhiều hoà tan bớt pha lỏng trên chất mang nên phải bão hoà trước pha động bằng pha tĩnh & Sắc kí lỏng cao áp trao đổi ion Sắc kí trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch hwopj thức giữa các ion trong dung dịch với các ion trong thành phần của chất trao đổi ion. Pha tĩnh là chất trao đổi ion, thường để tách các đối tượng vô cơ, thậm chí có thể tách các axit, bazơ hữu cơ và các phân tử trung hoà về điện. & Sắc kí rây phân tử Sắc kí rây phân tử liên quan đến sự khuyếch tán chọn lọc của các phân tử chất tan qua các lỗ. Cân bằng được thiết lập trong sắc kí rây phân tử được biểu diễn bằng phương trình Xm ô Vs trong đó Xm, Vs là lượng chất tan trong pha động pha tĩnh. Còn hệ số phân bố theo phương trình: K = [Xm] = k’ [Vm] [Vs] [Vs] Trong đó : Vm - tổng thể tích pha động nằm giữa các hạt Vs - thể tích dung môi trong các lỗ. Việc lựa chọn kích thước lỗ xốp vật liệu nhồi ( pha tĩnh ) phụ thuộc vào phân tử chất tan cần tách. Sắc kí rây phân tử được dùng phổ biến để tách và khảo sát cac hợp chất cao phân tử tổng hợp và thiên nhiên. II.2.8. Các đại lượng đặc trưng cho quá trình tách +) Thời gian lưu tR : thời gian lưu của cấu tử R trong cột sắc kí được tính từ thời điểm bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi xuất hiện đỉnh pic. Việc nhận biết các chất trên sắc đồ chủ yếu dựa vào các giá trị lưu của chúng. Thời gian và thể tích lưu là các đại lượng đặc trưng của các chất và chỉ phụ thuộc vào hệ sắc kí được lựa chọn (pha tĩnh/pha động). Với các máy sắc kí hiệu quả cao, người ta có thể thu được các đại lượng lưu với độ lệch tiêu chuẩn sthực =2% và tốt hơn nữa, điều đó cho phép sử dụng máy tính điện tử kết hợp với sử lý tự động các kết quả thu được trên sắc đồ. +) Sự lưu giữ : Đại lượng mô tả sự lưu giữ đó là hệ số dung lượng (kX’) k’X = tR – t0 t0 tR - thời gian lưu của cấu tử có lưu giữ trên cột t0 - thời gian cần thiết để các phân tử pha động hoặc bất kì phân tử nào  không bị lưu giứ trên cột, đi hết qua cột. +) Diện tích pic : Có thể phân tích định lượng trong sắc kí trước hết giả thiết rằng các biến đổi tín hiệu S của detector có quan hệ nhiêm ngặt với sự biến đổi nồng độ của các chất được tách ra trong dung dịch rửa giải theo một tương quan tỉ lệ thuận. Như vậy mỗi diện tích píc Ai = ũ Si dt đại diện cho một nồng độ của một cấu tử i trong mẫu. +) Số đĩa lý thuyết (N) : Để đánh giá khả năng phân chia của cột tương tự như quá trình chưng luyện, người ta sử dụng chiều cao tương dương với một đĩa lý thuyết H. chiều cao xác định theo chiều dài cột L chia cho số đĩa lý thuyết N H = L N Số đĩa lý thuyết trên một đơn vị chiều dài cột càng lớn (H càng nhỏ), khả năng phân chia cột càng tốt: tR ~ N, VR ~ N Hình 4: Tính số đĩa lý thuyết trên sắc đồ Công thức tính: Việc đo bề rộng của pic trên đường nền không thuận lợi ( thiếu chính xác). Trên thực tế người ta thường tính N theo công thứ sau : Người ta có thể tìm ra vận tốc tối ưu (Uo) cho Hmin theo phương trình Vandeemter: A, B, C - là các hệ số phụ thuộc vào các yếu tố như; sự khuyếch tán xoáy, khuyếch tán phân tử, tốc độ trao đổi chất. U - tốc độ pha động Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ H & U II.2.9 ứng dụng của sắc kí lỏng cao áp Tách các axit nucleic, dược phẩm, steroit, vitamin, chất bảo vệ thực phẩm, chất bảo vệ thực vật, các hiđrocacbon trong dầu mỏ, chất phụ gia cho nhiên liệu, hợp chất sufonat hữu cơ, chất dẻo hoá, các phenol, axit amin, amin, gluxit, phức chất, trong hoá học lâm sàng. Phần Iii : thực nghiệm III.1. Hoá chất, dụng cụ, máy móc III.1.1. Hoá chất Các hoá chất sử dụng có độ tinh khiết cho sắc kí 1.1. Methanol. 1.2. t-Buthyl methyl ether. 1.3. Dung dịch đệm citrate 0.06 M, pH=6 ( ví dụ : Merck No.1.09437.1000) được đun nóng sơ bộ tới 700C. 1.4. Dung dịch natri dithionite (Na2S2O4), C = 200 mg/ml, mới pha. 1.5. Extrelut õ 20 (Merck No. 11.738). 1.6. Các amin từ 1 đến 18 (theo mục II.1.3-phần PPNC) của quy trình ( Mức độ tinh khiết cho sắc kí). 1.7. Nước cất hai lần và cồn 900 sạch để rửa. 1.8. Dung dịch methanol của một hỗn hợp amin chứa các amin ( có thể mỗi hỗn hợp gồm 4 amin dể phù hợp với từng bước sóng, ví dụ: A1,2,8,9 với bước sóng 280 nm) với nồng độ C= 15.0 tới 400 mg/ml mỗi thứ. Ghi chú : Các dung dịch methanol của amin trong chai nhựa ổn định trong 2 tuần ở nhiệt độ đông lạnh. III.1.2. Thiết bị 2.1. Bình phản ứng 30 ml bằng thủy tinh chịu nhiệt có nắp xoáy, cao 10cm, đường kính 2.5 cm. 2.2. Bếp cách thủy, tủ sấy có thông gió hay khối đốt nóng, mọi thiết bị đều có nhiệt kế. 2.3. Cột làm đầy, Extrelute õ 20 (Merck No. 11.738). 2.4. Thiết bị bốc hơi chân không quay. 2.5. Pipet 20 ml dùng piston Eppendorf loại 1 ml Eppendorf loại 1 ml tới 5 ml. 2.6. Bình thuỷ tinh đáy tròn 100 ml với bộ nối chuẩn NS 29/32. 2.7. Pipet micr