Luận văn Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng hiv trong thuốc bằng phương pháp điện di Mao Quản

iện di). Nói chung, hệ số dung tích ki’ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt. Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC). Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm. Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 mm), việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều. Vì thế nên tránh dùng thế quá cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn 100 mm và cần phải điều nhiệt mao quản. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF. Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen. Bảng 1.1. Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC Chất hoạt động bề mặt Nồng độ ngưỡng của mixen (mM) Anionic Sodium dodecyl sulfate( SDS) 8 Sodium tetradecyl sulfate (STS) 2,2 Sodium cholate( SC) 13-15 Sodium taurocholate (STC) 10-15 Cationic Cetyltrimethylammonium chloride( CTAC) 1.3 Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) 0.92 Dodecyltrimethylammonium bromide (DoTAB) 14-16 3-[3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate CHAPS 6-8 Non-ionic Triton X-100 0.2-0.9 Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen với “pha tĩnh giả” là Cyclodextrin (CD-EKC) Nguồn gốc và sơ lược lịch sử nghiên cứu về các Cyclodextrin Hình 1.4: Cấu trúc không gian của β-cyclodextrin. Nhóm hợp chất hiện được biết tới dưới tên các Cyclodextrin (CD) hay còn gọi là “cellulosine” được miêu tả lần đầu tiên bởi A.Villiers năm 1891. Sau đó một thời gian, F. Schardinger phát hiện ra 3 CD tự nhiên là α-, β-và γ-. Những hợp chất này thời gian đó gọi là “đường Schardinger”. Trong suốt 25 năm, từ giữa năm 1911 và 1935, Pringsheim ở Đức đã nghiên cứu giải thích cho việc cyclodextrins là hợp chất vững bền không bị phân hủy bởi nước hay các hợp chất hóa học khác. Năm 1954, Carmer đã miêu tả cấu trúc và các tính chất hóa lý của α-, β- và γ- CD như: cấu trúc hóa học, kích thước lỗ trống, độ hòa tan, khả năng tạo phức, ảnh hưởng tới độ bền vững hóa học của dược chất ít tan. Từ đó đến nay, qua hơn 100 năm phát triển, CD đã được nghiên cứu nhiều và đưa vào sử dụng trong nhiều lĩnh vực. Hiện nay, CD vẫn tiếp tục được nghiên cứu với nhiều khả năng tiềm ẩn. Các Cyclodextrin (còn được gọi là cycloamyloses) là các hợp chất có cấu trúc vòng được tạo thành từ nhiều phân tử đường liên kết với nhau (vòng oligosaccaride). Các Cyclodextrin được tạo ra từ 5 phân tử α- D- glucopyranoside trở lên liên kết 1-4, giống như amylase (một phần của tinh bột). Đặc biệt, cyclodextrin lớn nhất có chứa 32 phân tử 1,4 anhydroglucopyranoside. Điển hình cyclodextrin có chứa một số lượng đơn phân tử glucose liên kết với nhau thành vòng chứa từ 6 đến 8 phân tử trong một vòng, có cấu trúc không gian hình nón cụt với liên kết hydro 3-OH ở bên trong và 2-OH ở bên ngoài, có 3 loại: - α- CD : 6 đường trong một phân tử vòng (18 nhóm hydroxyl) - β - CD: 7 đường trong một phân tử vòng (21 nhóm hydroxyl) - γ – CD: 8 đường trong một phân tử vòng (24 nhóm hydroxyl) Hình 1.5: Cấu trúc không gian của phân tử α- CD, β- CD, λ-CD. Các 6-OH nhóm hydroxyl linh hoạt cũng có khả năng hình thành các liên kết hydro xung quanh mép dưới cùng nhưng không ổn định do ảnh hưởng lưỡng cực, dễ dàng phân ly trong dung dịch nước và không thường thấy trong các tinh thể cyclodextrin. Các liên kết hydro 3-OH (nhóm cho electron) và 2- OH (nhóm nhận electron) trong α- CD, ngược lại điều này 3-OH (nhóm nhận electron) và 2-OH (nhóm cho electron) trong β-và γ- CD. Hình 1.6: Cấu trúc phân tử của α-, β-, λ- CD. Phân tử Cyclodextrin gồm hai phần: các nhóm hydroxyl hướng ra ngoài tạo thành bề mặt thân nước còn khoang trung tâm chứa khung cacbon, với các cầu nối hydro và oxy tạo thành vùng kỵ nước. Do sự sắp xếp này nên các phân tử dược chất sẽ liên kết một phần hoặc toàn bộ với khoảng không gian trung tâm của CD khi các khoang kỵ nước của CD bao trọn lấy phân tử hoạt chất hoặc phần thân dầu của các phân tử lớn. Quá trình này gắn với sự giải phóng các phân tử nước từ khoảng không gian trung tâm đó. Khi thay thế phân tử nước này bằng những phân tử khác thích hợp thì phức hợp tạo thành sẽ có năng lượng hòa tan thấp hơn nên dễ hòa tan hơn. Phức hợp này bền nhờ lực Van der Waals yếu, cầu nối hydro và tương tác giữa các phần thân dầu. Sự hình thành các phức hợp làm thay đổi đặc tính vật lý và hóa học của các phân tử liên kết, chủ yếu là về độ hòa tan với nước. Đây là lý do tại sao các cyclodextrin đã thu hút sự quan tâm nhiều trong lĩnh vực, đặc biệt trong ứng dụng dược phẩm: bởi vì các cyclodextrin có phân tử kỵ nước có thể thấm qua các màng sinh học của cơ thể, chúng có thể được sử dụng để giải phóng hợp chất hiệu quả. CD có cấu trúc vòng đặc biệt, hình thể dạng nón cụt, nhóm hydroxyl thứ nhất định vị ở đáy nhỏ còn nhóm hydroxyl thứ hai định vị ở đáy lớn, các nhóm hydroxyl này là đích cho việc tổng hợp ra các dẫn chất khác nhau của CD như: carboxylmethyl- β- CD, hydroxypropyl- β (-γ)- CD, methyl- β- CD Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng CD và dẫn chất trong ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như: làm giảm mùi vị không mong muốn, giải phóng mùi hương khi là quần áo hoặc dưới thân nhiệt Đặc biệt trong ngành dược CD được dùng như một tá dược làm tăng độ tan, tốc độ tan và độ ổn định của dược chất ít tan, làm tăng sinh khả dụng của thuốc, ngăn cản tương tác thuốc- thuốc và thuốc- tá dược Hiện nay, CD còn được ứng dụng rất nhiều trong kiểm nghiệm để định tính, định lượng các đồng phân quang học của một số dược chất trong các kỹ thuật sắc ký và điện di. Việc sử dụng các CD và các dẫn xuất CD vào CE liên tục được nghiên cứu. 1.4.7. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ Cx của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là: Hi = k1.Ci (12) và Si = k2.Ci (13) Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i. Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi . k1, k2 là hằng số điều kiện thực nghiệm. Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. ĐIỀU KIỆN NGHIÊN CỨU 2.1.1.1. Các chất chuẩn đối chiếu - Chuẩn quốc gia Lamivudine (200mg/ lọ) hàm lượng 99,45 % C8H11N3O3S tính theo nguyên trạng, SKS 031214603, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế. - Chuẩn quốc gia Zidovudin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,64 % C10H13N5O4 (HPLC) tính theo nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế. - Chuẩn quốc gia Nevirapin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,49 % C15H14N4O tính theo nguyên trạng, SKS WS 0109263, bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế. 2.1.1.2. Hóa chất: - Nước cất deion: là nước cất hai lần mới, được lọc qua bộ lọc tinh khiết có cột trao đổi anion và cation, sau đó lọc qua màng lọc 0,2µm. - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4 của hãng MERCK KGaA Germany 2.1.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 được điều khiển bằng phần mềm Chemstation 100001 (sản xuất tại hãng Hewlett Packard, Đức) của bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội. - Máy lọc nước tinh khiết Sartorius arium 611: model SARTORIUS AG GOTYINGEN, áp suất tối đa 100psi/ 6,9bar. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H ( sản xuất tại hãng Elma, Đức). - Máy đo pH EUTECH Instrument. - Cân phân tích Sartorius TE214S. - Giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm- Trung Quốc. - Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm. - Bộ lọc hút chân không màng lọc cenlulose với kích thước lỗ lọc 0,45 µm. - Các dụng cụ chính xác: bình định mức, pipet chính xác với các thể tích khác nhau. - Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày và cối. 2.1.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.2.1. Chế phẩm làm việc - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg, Nevirapine 200mg & Zidovudine 300mg do công ty Ranbaxy laboratories Limited Ấn Độ sản xuất . Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 9/ 2013. - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg do công ty Matrix Laboratories Limited Ấn Độ sản xuất. Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 10/2013 2.1.2.2. Chuẩn bị mẫu * Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: - Dung dịch gốc chuẩn: cân chính xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin và 59,6 mg Zidovudin vào cốc có mỏ. Thêm vào 10,0 ml MeOH hòa tan, sau đó thêm nước cất deion hòa tan. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước deion đến thể tích vừa đủ và lắc đều. - Dung dịch chuẩn: hút chính xác 5,0ml dung dịch gốc chuẩn pha vào bình định mức 10ml, thêm nước deion vừa đủ thể tích và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,2µm. - Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình một viên và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg Nevirapin và 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm 70 ml nước deion siêu âm cho tan hết, thêm nước deion đến vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm. Bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc 0,45µm. Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được lọc qua màng lọc 0,2µm trước khi tiêm vào lọ đựng mẫu. -Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị như mẫu chuẩn nhưng không có chất phân tích. *Chuẩn bị dung dịch điện ly nền: - Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. - Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM + SDS 50mM : Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 và 0,7210 g SDS vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. Dung dịch điện ly nền này điều chỉnh pH đến pH 8,5 ; pH 9,2 và pH 10. - Dung dịch điện ly nền Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 và 0,4820g β-cyclodextrin vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nội dung nghiên cứu Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích. Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Hai kỹ thuật được lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện di nào có thể tách tốt các hoạt chất. Sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện để chọn chương trình điện di thích hợp, cụ thể là: - Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp. - Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách 3 hoạt chất và định lượng đồng thời như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ. - Đánh giá thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc - Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 2.2.2.1. Thẩm định phương pháp: Phương pháp phân tích đang xây dựng được thẩm định theo các tiêu chí: Khoảng tuyến tính Để đảm bảo sự chính xác của phép định lượng, chúng tôi tiến hành trên 5- 7 mẫu hỗn hợp chuẩn cần phân tích ở các nồng độ khác nhau, lập mối tương quan giữa nồng độ của Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin với diện tích pic thu được trên điện di đồ bằng phương trình hồi quy cùng các hệ số tương ứng và đồ thị. Yêu cầu đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r 0,99. Độ lặp lại của phương pháp Tiến hành phân tích ở mức nồng độ đã xác định với 5 mẫu độc lập, khảo sát độ lặp lại của diện tích pic của ba chất cần phân tích. Đánh giá độ phân tán số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) RSD(%)= x 100 Yêu cầu RSD(%) không được quá 5%. Độ đúng của phương pháp Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã được cho thêm những lượng chuẩn nhất định. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành lặp lại sáu lần, chuẩn thêm vào 20% so với lượng có trong mẫu. Phương pháp thêm chuẩn vào mẫu được chuẩn bị như sau: Mẫu thử: là dung dịch chế phẩm được pha với hệ đệm ở nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính. Hệ đệm chúng tôi dùng trong nghiên cứu này là nước cất deion và 10% Metanol (v/v) Mẫu thêm chuẩn: được tiến hành song song cùng mẫu thử, thêm 20% chuẩn so với hàm lượng có trong mẫu. Tính độ thu hồi: Dựa vào phương trình chuẩn hồi quy tính toán được nồng độ của từng mẫu (Cmẫu ) và nồng độ của từng mẫu thêm chuẩn (Cmẫu thêm chuẩn). Cthu hồi = Cmẫu thêm chuẩn- Cmẫu Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%)=Cthu hồi/ Cchuẩn Tính tương thích hệ thống Tính tương thích hệ thống được xác định bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu hỗn hợp ba chuẩn đã được xác định nồng độ. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) và giá trị độ phân giải Rs của hai pic. Rs = 2 x [(tR)B- (tR)A] / (WA+WB) Trong đó (tR)A: thời gian dịch chuyển của chất A (tR)B : thời gian dịch chuyển của chất B WA, WB : độ rộng chân pic trên điện di đồ của hai chất A và B Tính đặc hiệu của phương pháp Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng xác định một cách chắc chắn sự có mặt của các chất cần phân tích khi có các thành phần khác bằng cách điện di lần lượt mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử trong cùng một điều kiện điện di đã lựa chọn. Trong đó mẫu trắng chính là dung môi (trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nước deion và 10% metanol (v/v) làm dung môi) đã dùng để pha mẫu thử và mẫu chuẩn. 2.2.2.2. Áp dụng phương pháp đã nghiên cứu vào định lượng các loại viên nén 2 hoạt chất và 3 hoạt chất. Trên cơ sở đã khảo sát, chọn nồng độ định lượng của mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tính. Từ đường chuẩn đã xây dựng được khi xác định khoảng tuyến tính, tính ra được hàm lượng chất cần phân tích có trong mẫu định lượng. Tiếp đó tính ra hàm lượng hoạt chất có trong chế phẩm. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách 3TC, AZT và NVP 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất Để khảo sát phổ 3TC,AZT và NVP, detector được chọn là DAD. Do 3 hoạt chất đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 120µg/ml trong 10 mM đệm Borat, 50 mM SDS, pH=9,3. Phổ thu được thể hiện hình 3.1. 3TC AZT NVP Hình 3.1 Phổ hấp thụ của 3TC, AZT và NVP Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng Kết quả quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 270,5nm, Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 264,5nm và Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 268,5nm.Chúng tôi chọn các bước sóng hấp thụ cực đại cho từng chất trong phép định lượng để cho kết quả chính xác nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP. 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Jun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 75 µm . Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản silica trần, có tổng chiều dài là 64,5cm, chiều dài hiệu lực là 60 cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 60 cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di. Điều kiện rửa mao quản: trong thời gian tiến hành điện di, mao quản đều được rửa để phục hồi và duy trì bề mặt mao quản ổn định, giảm sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt mao quản, làm mới lại bề mặt để tạo điều kiện cho silanol điện ly, tạo bề mặt mao quản mang điện tích. Thời điểm bắt đầu : lần lượt rửa bằng nước deion 5 phút, dung dịch NaOH 1M 10 phút , dung dịch NaOH 0,1 M 5 phút và rửa lại bằng nước deion 10 phút (tất cả các dung dịch trước khi chạy đều được lọc qua màng lọc 0,2µm). Giữa các lần chạy: 2 phút nước cất deion- 1 phút NaOH 0,1 M – 1 phút nước cất deion– 2 phút dung dịch đệm. Thời điểm kết thúc: lần lượt rửa bằng nước cất deion 5 phút, dung dịch NaOH 0,1M 5 phút, nước cất deion 10 phút. 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi. Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu. Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng DH, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng. Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS. Theo lý thuyết, độ điện di [7,8] mtot(i) = ( mef + mEOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14) Thời gian lưu của chất tan i là: ti = (L.l)/(mtot(i) .V) (15) Trong đó: mtot(i) = (mef + mEOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan. V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV. l: Chiều dài hiệu dụng (60 cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm). E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V (kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản. Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan được tính theo công thức sau: µef = mtot - mEOF µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 60/ ti .V mEOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 60/ t0 . V Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di metanol tinh khiết. 3.1.5 Lựa chọn cơ chế tách Tiến hành chạy điện di hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên 3 loại dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM; Na2B4O7 10mM + SDS 50mM ; Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM. Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C Các điện di đồ thu được như sau: Na2B4O7 10mM Na2B4O7 10mM + SDS 50mM Na2B4O7 10mM + β-CD 10mM. Hình 3.2 Khảo sát cơ chế tách CZE, MEKC Nhận thấy nếu chỉ dùng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) thì không tách được 3 chất ra khỏi nhau. Vì pKa của Lamivudin (pKa= 3,31 ) và Nevirapin (pKa= 2,42) khá gần nhau. Trong dung dịch điện ly nền với khoảng pH nhất định thì 2 chất này bị ion hóa giống nhau, 2 chất đi ra khỏi mao quản trong cùng một thời điểm nên trên điện di đồ chỉ xuất hiện 2 pic mà thôi. Thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm (SDS) thì độ phân giải giữa 3 chất tăng rõ rệt. Cả 3 chất được tách rõ ràng trên điện di đồ. Vì mỗi chất sẽ có sự phân bố vào Pha tĩnh giả SDS khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau. Như vậy các hoạt chất này sẽ tách được theo cơ chế MEKC. Còn khi thêm vào dung dịch điện li nền Na2B4O7 10mM một chất chọn lọc đối quang β- CD thì trên điện di đồ cũng chỉ xuất hiện 2 pic có nghĩa là yếu tố không gian của 3 chất này không ảnh hưởng tới quá trình tách. Chất hoạt động bề mặt β- CD không được lựa chọn. Chọn phương pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt là SDS đối với các khảo sát còn lại cho các hoạt chất này. 3.1.6. Ảnh hưởng pH của dung dịch điện li nền Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di chứa: - Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên dung dịch điện li nền là dung dịch Na2B4O7 10mM + SDS 50mM - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C Gía trị pH thay đổi tại pH = 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17. pH=8,76 pH= 9,06 pH= 9,30 pH= 9,62 pH= 10,17 Hình 3.3. Điện di đồ ở pH 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 8,76 đến 10,17