Luận văn Xây dựng quy trình xác định đồng, chì, cadimi trong mẫu huyết thanh bằng phương pháp quang phổ plasma ghép nối khối phổ (ICP-MS)

hân tích của ICP-MS và lựa chọn đồng vị thích hợp để phân tích *Nguyên tắc chung của phương pháp Mẫu phân hủy tới dạng đồng nhất bằng các phương pháp phân hủy mẫu thích hợp, sau đó được đưa vào phân tích trên thiết bị ICP-MS. Mẫu ở dạng đồng nhất được sol hóa thành sol khí và đưa tới tâm ngọn lửa ICP, ở đây xảy ra quá trình nguyên tử hóa và ion hóa. Các ion kim loại được thu nhận qua hệ thống phân giải phổ theo số khối (tỉ số khối lượng /điện tích ion m/z) và được thu nhận các tín hiệu qua bộ nhân quang điện. Pic phổ hoặc số hạt thu nhận được lưu giữ trong máy tính. *Các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo ICP-MS - Nồng độ muối ảnh hưởng từ 0,1 – 0,4%. - Đồng vị của các nguyên tố khác nhau có số khối trùng nhau. Sự kết hợp giữa các nguyên tử tạo ra một phân tử mới có số khối trùng với số khối của nguyên tố cần phân tích. - Các nguyên tử khi ion hóa bậc 1 hoặc bậc 2 sẽ cho các số khối khác nhau trùng với số khối của nguyên tố cần phân tích. - Ảnh hưởng của mẫu phân tích trước. *Phạm vi ứng dụng của phương pháp ICP-MS Ở Việt Nam, thiết bị ICP-MS đã được lắp đặt và sử dụng trong một số viện nghiên cứu như Viện xạ hiếm, Viện nghiên cứu địa chất-khoáng sản, Viện công nghệ môi trường, Khoa Hóa học-Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội,.. Do có khả năng phân tích hàng loạt các nguyên tố kim loại cùng một lúc với độ nhạy và độ chính xác cao, nên ICP-MS được ứng dụng trong nhiều ngành nghề khác nhau như công nghệ luyện kim, chế tạo máy, địa chất, lĩnh vực môi trường,… 1.3. Các phương pháp xử lý mẫu[8] Xử lý mẫu phân tích là một quá trình phức tạp, có hóa học, có vật lý, hay vật lý và hóa học kết hợp, để phân hủy mẫu chuyển các chất, hay các nguyên tố, hay các ion cần xác định có trong mẫu phân tích ban đầu về dạng tan trong một dung môi thích hợp như nước hay dung môi hữu cơ,…để sau đó có thể xác định được nó theo một phương pháp thích hợp. Tuy nhiên việc xử lý mẫu phân tích lại được thực hiên theo rất nhiều kỹ thuật có nguyên lý, cơ chế vật lý và hóa học có khi rất khác nhau, tùy theo mỗi loại mẫu và yêu cầu của phương pháp phân tích. Các phương pháp xử lý mẫu đã và đang được sử dụng bao gồm 1.3.1. Phương pháp vô cơ hóa 1.3.1.1. Phương pháp vô cơ hóa ướt *Xử lý bằng axit mạnh đặc nóng Dùng axit mạnh đặc và nóng (ví dụ HCl, H2SO4), hay axit mạnh, đặc và nóng có tính oxi hóa mạnh (HNO3, HClO4), hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3 + H2SO4), hay 3 axit (HNO3 + H2SO4 + HClO4), hoặc là 1 axit đặc và 1 oxy hóa mạnh (H2SO4 + KMnO4)…để phân hủy mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan, trong ống nghiệm, trong cốc hay lò vi sóng. Lượng axit cần dùng để phân hủy mẫu thường gấp 10-15 lần lượng mẫu, tùy thuộc mỗi loai mẫu và cấu trúc vật lý, hóa học của nó. Thời gian phân hủy mẫu trong các hệ hở, bình Kendan, ống nghiệm, cốc,..thường từ vài giờ đến hàng chục giờ tùy loại mẫu và bản chất của các chất, còn nếu trong lò vi sóng thì chỉ cần 50-90 phút. Ưu - nhược điểm Hầu như không bị mất các chất phân tích, nhất là trong lò vi sóng. Nhưng thời gian phân hủy mẫu rất dài, trong điều kiện thường, tốn nhiều axit đặc tinh khiết cao, nhất là trong các hệ hở. Dễ bị nhiễm bẩn khi xử lý trong hệ hở, do môi trường hay axit dùng và phải đuổi axit dư lâu, nên dễ bị nhiễm bẩn, bụi vào mẫu *Xử lý bằng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng Dùng dung dịch kiềm mạnh đặc nóng (NaOH, KOH 15-20%), hay hỗn hợp của kiềm mạnh và muối kim loại kiềm (NaOH + NaHCO3), hay một kiềm mạnh và peroxit (KOH + Na2O2) nồng độ lớn (10-20%), để phân hủy mẫu phân tích trong điều kiện đun nóng trong bình Kendan hay trong hộp kín, hoặc trong lò vi sóng. Lượng dung dịch phân hủy: cần lượng lớn từ 8-15 lần lượng mẫu. Thời gian phân hủy mẫu: từ 4-10 giờ trong hệ hở. Còn trong trong hệ lò vi sóng kín chỉ cần thời gian 1-2 giờ. Nhiệt độ phân hủy là nhiệt độ sôi của dung dịch kiềm. Nó thường nằm trong khoảng 150-200oC. Ưu - nhược điểm Ưu điểm là hầu như không làm mất chất phân tích, nhất là các nguyên tố có hợp chất dễ bay hơi và các nền của mẫu dễ tan trong kiềm Nhược điểm là tốn rất nhiều kiềm tinh khiết cao, khả năng gây nhiễm bẩn dễ xảy ra, loại kiềm dư rất khó khăn và mất nhiều thì giờ. 1.3.1.2. Phương pháp vô cơ hóa khô Kỹ thuật xử lý khô (tro hóa khô) là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung ở một nhiệt độ thích hợp (450-750oC), song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình xử lý mẫu. Vì sau khi nung, mẫu bã còn lại phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay dung dịch axit phù hợp, thì mới chuyển các chất cần phân tích trong tro mẫu vào dung dịch để sau đó xác định nó theo một phương pháp đã chọn. Khi nung, các chất hữu cơ của mẫu sễ bị đốt cháy thành CO2 và nước. Thời gian nung có thể từ 5-12 giờ tùy thuộc vào mỗi loại chất phân tích, cấu trúc, dạng liên kết của các chất trong mẫu. *Ưu - nhược điểm Thao tác và cách làm đơn giản, không phải dùng nhiều axit đặc tinh khiết cao đắt tiền, xử lý được triệt để nhất là các mẫu nền hữu cơ, đốt cháy hết các chất hữu cơ, vì thế làm dung dịch mẫu thu được sạch Nhưng có nhược điểm là có thể mất một số chất dễ bay hơi, ví dụ như: Cd, Pb, Zn, Sn, Sb,….nếu không có chất phụ gia và chất bảo vệ. 1.3.1.3. Phương pháp vô cơ hóa khô-ướt kết hợp Nguyên tắc của kỹ thuật này là mẫu được phân hủy trong chén hay cốc nung. Trước tiên người ta xử lý ướt sơ bộ bằng một lượng nhỏ axit và chất phụ gia, để phá vỡ cấu trúc ban đầu của các hợp chất mẫu và tạo điều kiện giữ một số nguyên tố có thể bay hơi khi nung. Sau đó nung ở nhiệt độ thích hợp. Vì thế lượng axit dùng để xử lý thường chỉ bằng 1/4 hay 1/5 lượng cần dùng cho xử lý ướt. Sau đó nung sẽ nhanh hơn và quá trình xử lý sẽ triệt để hơn xử lý ướt, đồng thời hạn chế được sự mất của một số kim loại khi nung. Do đó đã tận dụng được ưu điểm của cả hai kỹ thuật xủ lý ướt và khô, nhất là giảm bớt được các loại hóa chất (axit, kiềm tinh khiết cao) khi xử lý ướt, sau đó hòa tan tro mẫu sẽ thu được mẫu trong, vì không còn chất hữu cơ và sạch hơn tro hóa ướt thông thường. *Ưu và nhược điểm Hạn chế được sự mất của một số chất phân tích dễ bay hơi. Sự tro hóa triệt để, sau khi hòa tan tro còn lại có dung dịch mẫu trong. Không phải dùng nhiều axit tinh khiết cao tốn kém, thời gian xử lý nhanh hơn tro hóa ướt. Không phải đuổi axit dư, nên hạn chế được sự nhiễm bẩn. Do đó phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau để xác định kim loại. 1.3.2. Phương pháp chiết Chiết là phương pháp dựa trên cơ sở sự phân bố (hay hòa tan) khác nhau của chất phân tích vào trong hai pha (hai dung môi) không trộn lẫn vào nhau. Nhờ đó mà chúng ta lấy được chất cần phân tích ra khỏi pha mẫu ban đầu, chuyển nó vào pha thứ hai (dung môi) mà chúng ta mong muốn. Các kiểu chiết trong xử lý mẫu phân tích: - Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng - Kỹ thuật chiết pha rắn - Kỹ thuật chiết hấp phụ pha khí (rắn – khí) - Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME) - Kỹ thuật chiết Soxhlet - Kỹ thuật chiết siêu âm 1.3.3. Phương pháp pha loãng mẫu bằng dung môi thích hợp Nguyên tắc ở đây là chọn dung môi thích hợp hòa tan tốt chất mẫu, để pha loãng chất mẫu trong một tỷ lệ nhất định, ví dụ từ 50-500 lần. Sau đó xác định chất phân tích theo phương pháp đã chọn. Kỹ thuật này đơn giản, hầu như không cần trang bị gì hết, lại dễ thực hiện và nhanh. Nhưng nó chỉ thích hợp cho một số trường hợp chất phân tích có nồng độ tương đối lớn, mà khi pha loãng mẫu nhiều lần bằng dung môi thích hợp, chúng ta vẫn xác định nó tốt trong các điều kiện cho phép, và các chất khác có mặt trong mẫu, khi pha loãng trong một tỷ lệ nhất định thì không cản trở và không ảnh hưởng đến kết quả xác định chất phân tích. Đồng thời pha loãng chúng ta có thể loại bỏ được các cặn không tan có trong mẫu, nhất là các mẫu dầu hay chất hữu cơ. 1.3.4 Phương pháp điện phân Trong bình điện phân, tại thế một chiều, các ion kim loại chạy về điện cực âm, bị điện phân (nhận electron của điện cực) trở thành các phân tử trung hòa (các nguyên tử) và bám vào điện cực. Do đó ta được chất phân tích bám tên điện cực âm. Sau đó ta có thể xác định chất trên điện cực bằng phương pháp khối lượng hay hòa tan chất trên điện cực rồi xác định nó theo một cách phù hợp. Đây là cách làm giầu chất phân tích của phương pháp phân tích cực phổ có tên là phương pháp Von–Ampe. 1.3.5. Phương pháp phân hủy mẫu bằng lò vi sóng *Nguyên tắc: Dùng năng lượng của lò vi sóng để đun nóng mẫu được đựng trong bình kín. Trong điều kiện nhiệt độ và áp suất cao, mẫu được hòa tan dễ dàng. Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể thời gian xử lý mẫu, không mất mẫu và vô cơ hóa mẫu được triệt để. Có thể vô cơ hóa cùng một lúc được nhiều mẫu, Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thiết bị rất đắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không đủ điều kiện trang bị. *Cơ chế của sự phân hủy mẫu trong lò vi sóng[8] Các tác nhân phân hủy mẫu bao gồm axit [có tác dụng phá hủy và hòa tan các hạt (phân tử) mẫu], năng lượng nhiệt (có tác dụng làm tan rã các hạt mẫu cùng với axit), sự khuếch tán đối lưu, chuyển động nhiệt và va chạm của các hạt mẫu với nhau làm cho chúng bị bào mòn dần. Ngoài ra, trong lò vi sóng còn có sự phá vỡ từ trong lòng hạt mẫu ra ngoài, do các phân tử nước hấp thụ (90%) năng lượng vi sóng và có động năng rất lớn, nên chúng có chuyển động nhiệt rất mạnh, làm căng và xé các hạt mẫu từ trong ra. Thêm vào đó, vì là hệ kín nên có áp suất cao, sẽ làm cho nhiệt độ sôi lại cao hơn, đây là tác nhân phân hủy mạnh nhất, do đó thúc đẩy quá trình phân hủy mẫu rất nhanh từ trong ra và từ ngoài vào. Vì thế nên việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian rất ngắn (30-70 phút) mà lại triệt để. *Các quá trình xảy ra khi phân hủy mẫu bằng lò vi sóng Dưới tác dụng của axit, năng lượng nhiệt (nhiệt độ) và năng lượng vi sóng các quá trình vật lý và hóa học sau đây sẽ xảy ra: - Sự phá vỡ mạng lưới cấu trúc của hạt mẫu, giải phóng các chất phân tích, để đưa chúng vào dung dịch dưới dạng các muối tan. - Quá trình oxi hóa khử làm thay đổi hóa trị, chuyển đổi dạng, làm tan vỡ các hạt mẫu, để giải phóng chất phân tích về dạng muối tan. - Nếu xử lý mẫu hữu cơ phân tích kim loại, thì có sự đốt cháy, phá hủy các hợp chất hữu cơ và mùn tạo ra khí CO2 và nước, để giải phóng các kim loại trong chất hữu cơ về dạng muối vô cơ tan trong dung dịch. - Tạo hợp chất dễ bay hơi làm mất đi các anion trong phân tử chất mẫu, làm mẫu bị phân hủy tạo ra các hợp chất tan trong dung dịch. - Sự tạo thành các hợp chất muối hay phức tan trong dung dịch. - Cơ chế tách chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu ở dạng kết tủa không tan và nhờ đó người ta tách được các chất phân tích và làm giầu chúng. Như vậy, trong quá trình xử lý mẫu ở đây cũng có thể có các phản ứng hóa học xảy ra như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng thủy phân, phản ứng tạo phức, phản ứng hòa tan, phản ứng kết tủa, ….của các phân tử chất mẫu với các axit dùng để phân hủy mẫu và các chất có trong mẫu với nhau. Trong đó, quá trình nào là chính, quá trình nào là phụ được quyết định bởi thành phần chất nền, bản chất của chất mẫu và các loại axit dùng để phân hủy và hòa tan mẫu. 1.4. Phương pháp xác định độ lặp lại và độ chính xác[10; 13] Độ lặp và độ chính xác là hai đại lượng quan trọng để đánh giá một phương pháp phân tích. 1.4.1. Độ lặp lại Độ lặp lại là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng một điều kiện thí nghiệm (người phân tích, trang thiết bị, phòng thí nghiệm) trong khoảng thời gian ngắn. *Các đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại Khoảng biến thiên R: là hiệu số giữa giá trị lớn nhất và giá trị nhỏ nhất trong một tập số liệu R = xmax - xmin Độ lớn của R phụ thuộc vào kích thước mẫu. Với cùng sai số ngẫu nhiên, khi số phép đo tăng R sẽ tăng. Do đó, khoảng biến thiên được dùng để đặc trưng cho độ phân tán của tập số liệu khi phép đo nhỏ. Phương sai (s2 và S2): là giá trị trung bình của tổng bình phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai không cùng thứ nguyên với các đại lượng đo. Nếu tập số liệu nhỏ thì (với N-1=f là số bậc tự do) Khi có m tập số liệu, mỗi tập số liệu làm k thí nghiệm lặp lại với cùng một mẫu thì (với N là tổng tất cả các thí nghiệm N = m.k) Nếu phương sai càng lớn thì độ tản mạn của các giá trị đo lặp lại càng lớn hay độ lặp lại càng kém. Độ lệch chuẩn (sf hoặc Sf): Độ lệch chuẩn của một tập số liệu kết quả nghiên cứu đặc trưng cho độ phân tán các số liệu trong tập hợp so với giá trị trung bình và được xác định theo phương trình hay (Với N là số thí nghiệm lặp lại của tập hợp, thực tế thường xem các tập số liệu có N>30 là tập hợp). Hoặc hay (với N là số thí nghiệm trong mẫu thống kê được rút ra từ tập hợp. Số bậc tự do trong trường hợp này là f = N – 1) Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và hệ số biến thiên (CV) RSD là tỉ số giữa độ lệch chuẩn và giá trị trung bình RSD(%) còn được gọi là hệ số biến thiên. Đại lượng này được dùng để đánh giá độ chính xác tương đối của phép phân tích. 1.4.2. Độ chính xác Độ chính xác là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau của giá trị phân tích (thường là giá trị trung bình ) với giá trị thực hay giá trị đã được chấp nhận xt hay m. Khi không có sai số hệ thống thì giá trị trung bình tiến tới giá trị thực nếu số phép đo rất lớn (N→¥). Vì vậy, có thể nói độ chính xác tùy thuộc vào số phép đo. Độ chính xác được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Trong đó sai số tuyệt đối (EA) là sự sai khác giữa giá trị đo được (xi) với giá trị thật hay giá trị đã biết trước (xt hay m) EA = xi - m Còn sai số tương đối (ER) là tỷ số giữa sai số tuyệt đối và giá trị thật hay giá trị đã biết trước hay PHẦN II. THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu huyết thanh của những người khỏe mạnh, độ tuổi từ 20-30 có nhóm máu O, đã được sàng lọc không chứa các loại virut HIV, viêm gan A (HAV), viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV),… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu tài liệu Thu thập, nghiên cứu và phân tích, kế thừa các tài liệu đã có trên thế giới và Việt Nam về phương pháp phân hủy xác định đồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng, chì và cadimi trong huyết thanh trên thiết bị ICP-MS Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình xác định đồng thời đồng, chì, cadimi trong huyết thanh bằng phương pháp ICP-MS bao gồm 2 phần chính sau: quy trình phân hủy mẫu huyết thanh và quy trình phân tích mẫu trên thiết bị ICP-MS. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng các thuật toán để tính toán kết quả phân tích. 2.3. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.3.1. Hóa chất Tất cả hóa chất dùng trong nghiên cứu như HNO3, H3PO4, HCl, H2SO4, HF, Triton X-100 đều là các hóa chất siêu sạch (Merck). Dung dịch chuẩn của các kim loại Cu, Pb, Cd đều là các hóa chất siêu sạch được mua từ hãng Merck có nồng độ gốc 1000ppm. Từ nồng độ gốc, pha chế thành các dung dịch có nồng độ nhỏ hơn. Các dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh. Dung dịch chuẩn được pha chế hàng ngày. Các dung dịch chuẩn máy (Mg; Rh; Ce; Pb; U; In; Be; Co) nồng độ 10ppb được mua từ hãng Perkin Elmer, Mỹ. Nước cất dùng cho nghiên cứu và phân tích là nước cất siêu sạch được cung cấp từ thiết bị Milipore có độ dẫn điện nhỏ hơn 18,2Ω/cm (250C). Khí Argon siêu sạch chất lượng 99,999% được mua từ hãng Messer. Mẫu huyết thanh dùng trong thí nghiệm nghiên cứu thuộc nhóm máu O được tách li tâm trước khi mang về phòng thí nghiệm và được bảo quản đông lạnh. Huyết thanh chuẩn của hãng Bio-ral, Mỹ (Assayed Chemistry Control) dạng bột khô, được bảo quản trong lọ nhỏ màu nâu ở nhiệt độ 20C dùng để kiểm tra mẫu, tính sai số và độ lặp. 2.3.2. Dụng cụ Dụng cụ dùng trong nghiên cứu bao gồm Ống phá mẫu trong lò vi sóng làm bằng Teflon. Túp nhựa của hãng Sarstedt loại 15mL và 50mL. Các loại pipet 100mL, 1000mL và 5mL. Vì hàm lượng các nguyên tố trong huyết thanh là vết và siêu vết nên dụng cụ dùng trong thí nghiệm phải được tráng rửa sạch bằng cách ngâm trong axit HNO3 (10%) từ 1-2 ngày. Sau đó siêu âm trong 20 phút, tráng rửa lại bằng nước cất 3 lần, rồi sấy ở nhiệt độ 800C. Cân phân tích của hãng Adam (Anh), có độ chính xác 0,0001mg dùng để cân mẫu chuẩn. 2.3.3.Thiết bị phân hủy mẫu và phân tích mẫu 2.3.3.1. Thiết bị phân hủy mẫu Hệ phân hủy mẫu bằng lò vi sóng Berghof, Speed wave-4 (Đức) (hình 1), có chương trình điều khiển nhiệt độ bên trong, bên ngoài lò, áp suất và thời gian gia nhiệt. Lò vi sóng có các ống phá mẫu bằng teflon, ký hiệu là DAK-100, có thể tích 100mL. Nhiệt độ và áp suất lớn nhất có thể đạt được ở trong ống lần lượt là 2300C và 40 bar. Khối lượng mẫu lớn nhất cho vào trong ống là 500 mg. Thể tích mẫu tối thiểu trong ống là 5 ml Hình 1: Thiết bị lò vi sóng Hình 2: Dụng cụ phân hủy mẫu 2.3.3.2. Thiết bị phân tích mẫu Thiết bị ICP-MS (Perkin Elmer, ELAN 9000) (hình 2) với hệ từ trường bát cực, sử dụng nguồn năng lượng cao tần cho quá trình hóa hơi và ion hóa tất cả các nguyên tử với hiệu suất cao và ổn định. ICP-MS ghép nối hệ sol hóa mẫu giúp quá trình làm giàu mẫu và tăng khả năng phát hiện rất phù hợp với phân tích vết các kim loại. *Cấu tạo của thiết bị ICP-MS 9000 bao gồm các bộ phận sau - Nguồn ion plasma - Bộ quang học ion (tứ cực) - Thiết bị đo phổ khối lượng - tứ cực - Bộ lấy mẫu tự động Autosampler AS-93 plus, Perkin Elmer, Mỹ - Bộ sol hóa mẫu bằng sóng siêu âm (USN, Perkin Elmer, Mỹ) trước khi đưa mẫu vào buồng plasma. Hệ này giúp cho quá trình làm giàu mẫu lên nhiều lần tăng khả năng phát hiện. - Buồng chân không và hệ lọc khối (trường tứ cực và các thấu kính điện từ ion) - Vùng ghép nối (Interface) - Máy tính Ngoài ra còn có máy lạnh tuần hoàn và hệ thống quạt hút. Hình 3: Thiết bị ICP-MS Hình 4: Bộ phận lấy mẫu tự động autosampler 2.4. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu huyết thanh Mẫu máu được lấy khoảng 250-300mL vào buổi sáng ở tĩnh mạch khuỷu tay, không chứa chất chống đông hay các chất bảo quản khác. Sau khi tiệt trùng, mẫu được chứa trong loại túi sử dụng 1 lần của hãng Terumo. Để tách huyết thanh, mẫu máu được làm đông tự nhiên trong thời gian 30 phút, sau đó li tâm trên thiết bị Mistral 6000 với tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, ở nhiệt độ 10-150C. Huyết thanh được tách ra và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C. PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Các phương pháp phân hủy mẫu *Lựa chọn môi trường phân hủy mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh có thành phần nền hữu cơ phức tạp, chứa lượng protein tương đối lớn vì vậy phương pháp xử lí mẫu này cho bất kỳ thiết bị phân tích nào cũng như thiết bị ICP-MS được quan tâm đầu tiên, thông thường một axit hay hỗn hợp axit có khả năng hòa tan. Trong phân tích ICP-MS thì một số axit ảnh hưởng tới phép đo phổ, vì vậy việc sử dụng loại axit cho quá trình xử lí mẫu đóng một vai trò quan trọng nhất để đảm bảo mẫu tan hoàn toàn ở dạng đồng nhất và không ảnh hưởng tới phép đo. Thực tế khảo sát với 1gam mẫu huyết thanh thêm và không thêm chuẩn với 2 mức 0,1mg và 10mg chuẩn được xử lí với 10ml axit các loại axit HNO3, HCl, H3PO4, H2SO4, hỗn hợp HNO3 và HCl, hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF, thể tích định mức cuối cùng là 50 ml. Thực nghiệm cho thấy chỉ có HNO3, H3PO4 và hỗn hợp HNO3 , H2SO4 và HF hòa tan mẫu, tuy nhiên dễ dàng hơn cả là axit HNO3. Kết quả phân tích mẫu không thêm và mẫu thêm chuẩn với 2 mức khác nhau cho thấy độ thu hồi với mỗi nguyên tố là khác nhau tuy nhiên tất cả các kết quả đều nằm trong khoảng cho phép từ 80 đến 103% (kết quả bảng 2). Bảng 2: Độ thu hồi đối với các loại axit xử lý mẫu khác nhau STT Tên nguyên tố Hiệu suất thu hồi (%) Axit HNO3 H3PO4 HNO3&HCl HNO3, H2SO4 & HF Mức hàm lượng 0,1 mg 10 mg 0,1 mg 10 mg 0,1 mg 10 mg 0,1 mg 10 mg 1 Cu 97 95 83 82 81 85 83 80 2 Pb 95 88 96 95 97 94 80 82 3 Cd 93 88 91 86 94 96 94 96 Bảng 2 cho thấy phân hủy mẫu sử dụng axit HNO3 cho độ thu hồi đối với cả ba nguyên tố từ 88 đến 97 %. Thực nghiệm quan sát cho thấy đây cũng là axit tốt nhất để hòa tan mẫu. Axit H3PO4 cho độ thu hồi tốt nhưng quá trình thực nghiệm cho thấy mẫu không phân huỷ hết các chất hữu cơ; hỗn hợp axit HNO3 và HCl phân huỷ mẫu tốt nhưng cho độ thu hồi của Cu thấp; hỗn hợp HNO3, H2SO4 và HF cho độ thu hồi của Pb thấp. Vì vậy, các nghiên cứu tiếp theo đều sử dụng HNO3 cho việc phân hủy mẫu. 3.1.1.Phương pháp pha loãng bằng HNO3 Pha các dung dịch axit HNO3 có nồng độ lần lượt là: 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1% ; 1,2%; 1,5% từ dung dịch HNO3 (1:1) và dung dịch chuẩn của các nguyên tố Cu, Pb, Cd có các nồng độ tương ứng là 50ppm; 2ppm và 0,1ppm. Lấy 1mL mẫu huyết thanh 50mL dung dịch chuấn vào các ống nghiệm. Tiến hành định mức đến vạch 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO3 với các nồng độ 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1%; 1,2% và 1,5% đối với tất cả các ống. Mối tương quan giữa nồng độ HNO3 với hàm lượng trung bình của các kim loại đồng, chì và cadimi được trình bày ở trong bảng 3 Bảng 3: Ảnh hưởng của môi trường HNO3 đến quá trình xác định hàm lượng đồng, chì và cadimi trong mẫu huyết thanh Hàm lượng các kim loại (ppb) Nồng độ HNO3 (%) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,5 Cu Mẫu trắng 26,65 27,35 30,45 27,75 38,6 26,75 28,55 27,25 Mẫu HT 619,67 621 627 625,3 638 660 657,4 652,66 Mẫu HT + chuẩn (2500ppp) 2547,33 2566,7 2836,75 2740,05 2686,7 2910 2650,65 2565,84 Cd Mẫu trắng 0,0235 0,026 0,0195 0,021 0,011 0,028 0,016 0,0135 Mẫu HT 0,025 0,03 0,026 0,03 0,028 0,046 0,034 0,031 Mẫu HT + chuẩn (5ppb) 4,29 4,3 4,22 4,3 4,3315 4,853 4,3 4,001 Pb Mẫu trắng 0,067 0,0408 0,0555 0,054 0,0525 0,02 0,0508 0,0495 Mẫu HT 0,0763 0,19 0,3 0,3 0,3137 0,309 0,3358 0,3287 Mẫu HT + chuẩn (100ppb) 85,2463 84,69 84,8 83,6 84,5337 90,819 83,9358 83,3917 (Mẫu HT: mẫu huyết thanh) Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ các kim loại vào nồng độ HNO3 trong phương pháp pha loãng bằng HNO3 (hình 5). (5a) (5b) ( 5c) Hình 5: Ảnh hưởng của HNO3 đến quá trình xác định hàm lượng đồng (5a), chì (5b) và cadimi (5c) trong phương pháp pha loãng bằng HNO3 Từ kết quả phân tích hàm lượng đồng, chì và cadimi trong các mẫu (hình 5) ta thấy trong phương pháp pha loãng bằng HNO3 ở các nồng độ khác nhau, thì với nồng độ HNO3 1% thu được hàm lượng của các nguyên tố là cao nhất và độ thu hồi của các nguyên tố là tốt nhất. Như vậy sử dụng HNO3 với nồng độ 1% là tối ưu trong phương pháp phân hủy thường mẫu huyết thanh. 3.1.2. Phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 (1%) và Triton X-100 Tương tự, lấy 1mL mẫu huyết thanh và 50mL dung dịch chuẩn vào các ống nghiệm, rồi định mức đến vạch 10mL bằng HNO3 1% và Triton X-100 có nồng độ lần lượt là 0,05%; 0,075%; 0,1%; 0,15%; 0,2% đối với tất cả các ống. Mối tương quan giữa nồng độ Triton X-100 và hàm lượng của đồng, chì, cadimi trong huyết thanh được trình bày ở trong bảng 4. Bảng 4: Ảnh hưởng của Triton X-100 đến quá trình xác định hàm lượng đồng, chì và cadimi trong huyết thanh Hàm lượng các kim loại (ppb) Nồng độ Triton X-100 (%) 0,05 0,075 0,1 0,15 0,2 Cu Mẫu trắng 13,3 17,68 23,5 27,1 27,4 Mẫu huyết thanh 1175 1185 1285 1230 1192,7 Mẫu huyết thanh + chuẩn (2500ppb) 3195 3350 3740 3425 3246,7 Cd Mẫu trắng 0,0771 0,0803 0,0874 0,0874 0,105 Mẫu huyết thanh 0,0868 0,0906 0,1349 0,1243 0,1411 Mẫu huyết thanh + chuẩn (5ppb) 4,4418 4,1281 4,7079 4,1693 4,1321 Pb Mẫu trắng 0,596 0,631 0,647 0,685 0,705 Mẫu huyết thanh 0,6953 0,7816 0,8375 0,7749 0,7924 Mẫu huyết thanh + chuẩn (100ppb) 83,7903 84,7116 92,3175 80,9299 82,0624 Hình 6 là đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ các kim loại vào nồng độ Triton X-100 trong phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 và Triton X-100 6a 6b 6c Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ Triton X-100 đến quá trình xác định hàm lượng đồng (6a), chì (6b) và cadimi (6c) trong phương pháp pha loãng mẫu huyết thanh bằng hỗn hợp HNO3 và Triton X-100 Kết quả phân tích hàm lượng đồng, chì và cadimi trong các mẫu ta thấy trong phương pháp pha loãng bằng hỗn hợp HNO3 1% và Triton X-100 thì sử dụng hỗn hợp HNO3 1% và Triton X-100 với nồng độ 0,1% là tối ưu vì các nguyên tố Cu, Pb và Cd đều được phát hiện ở nồng độ cao nhất. 3.1.3. Phương pháp phân hủy bằng lò vi sóng Các dung dịch HNO3 có nồng độ 0,1%; 0,5%, 1%; 1,5% và 2% được lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ HNO3 trong phương pháp phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng với chương trình có sẵn trong thiết bị (bảng 5). 1 mL mẫu huyết thanh được pha loãng đến 10mL lần lượt bằng các dung dịch HNO3 nồng độ từ 0,1% đến 2%. Sau đó, cho vào các ống phá Teflon để tiến hành phân hủy mẫu huyết thanh bằng lò vi sóng. Bảng 5: Chương trình phá mẫu huyết thanh trong lò vi sóng Các bước Nhiệt độ (0C) Áp suất (Bar) Thời gian (Phút) 1 160 50 5 2 190 50 10 3 50 0 10 4 50 0 10 5 50 0 10 Hàm lượng đồng, chì và cadimi xác địn